丹參酮ⅡA對(duì)CVB3感染的小鼠原代心肌細(xì)胞氧化損傷及凋亡的影響及其機(jī)制研究

肖文濤 張靜 郭素萍 胡振杰 李江 高傳玉

病毒性心肌炎（Viral myocarditis，VMC）是一種繼發(fā)于病毒感染的心肌炎性疾病，在年輕人中多發(fā)，可引發(fā)心力衰竭、猝死等致命性傷害［1］。據(jù)報(bào)道，腸道病毒，特別是柯薩奇病毒B3（CVB3）是導(dǎo)致病毒性心肌炎的最常見病毒［2］。鑒于最常見的心肌炎誘因是病毒感染，開發(fā)有效的抗病毒藥物對(duì)治療病毒性心肌炎具有重要意義。丹參酮ⅡA（TanshinoneⅡA，TanⅡA）是丹參酮的主要活性成分，具有抗氧化、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理學(xué)功能［3］。丹參酮ⅡA 已廣泛用于心血管疾病的治療［4-7］。然而丹參酮ⅡA 在病毒性心肌炎中的影響及作用機(jī)制的研究相對(duì)匱乏，因此本實(shí)驗(yàn)以CVB3感染小鼠原代心肌細(xì)胞在體外模擬病毒性心肌炎，探究丹參酮ⅡA 對(duì)病毒性心肌炎細(xì)胞損傷和凋亡的影響及可能的機(jī)制，以期為病毒性心肌炎臨床治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

6 周齡SPF 級(jí)BALB/C 雄性小鼠（中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）；丹參酮ⅡA（南京景竹醫(yī)藥科技有限公司）；DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；胎牛血清（美國(guó)Life Technologies 公司）；CVB3 病毒（美國(guó)菌種保藏中心）；CCK-8 試劑（日本同仁化學(xué)研究所）；BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Sigma 公司）；SOD 活力檢測(cè)試劑盒、MDA含量檢測(cè)試劑盒、GSH-Px 活力測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；IL-1β、IL-6 和TNF-α ELISA 檢測(cè)試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司）；AnnexinⅤ-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（日本TaKaRa 公司）；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；PVDF 膜（美國(guó)密理博公司）；Cleaved Caspase-3 單抗、TLR4 單抗、NF-κB 單抗、p-NF-κB 單抗及二抗（美國(guó)Santa Cruz 公司）。

1.2 心肌細(xì)胞分離及處理分組

參照文獻(xiàn)［8］分離小鼠心肌細(xì)胞，即取小鼠心臟組織，剪碎，以胰酶消化，差速貼壁法獲取小鼠原代心肌細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)已通過(guò)本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。分離的心肌細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，放置在37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。在6 孔板中接種1.0×105個(gè)/孔細(xì)胞，待單層貼壁生長(zhǎng)，向細(xì)胞中加入10 倍MOI的CVB3（根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果），輕輕混勻，37℃孵育1 h，記為模型（CVB3）組，丹參酮ⅡA 治療（CVB3+TanⅡA）組以CVB3 感染后使用濃度為10 μmol/L的丹參酮ⅡA 處理，正常對(duì)照組接種同劑量的PBS，丹參酮ⅡA（TanⅡA）組使用濃度為10 μmol/L的丹參酮ⅡA 處理，利巴韋林治療（CVB3+Rib）組以CVB3 感染后使用濃度為200 μg/mL 的丹參酮ⅡA 處理。

1.3 CCK-8 法檢測(cè)心肌細(xì)胞活性

心肌細(xì)胞以3×103個(gè)/孔加入到96 孔板中，按照1.2 方法處理和分組，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，分別在24 和48 h 向各孔細(xì)胞內(nèi)加入CCK-8 溶液10 μL，孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的光密度值（OD 值），參比波長(zhǎng)為600 nm，分別計(jì)算各組心肌細(xì)胞活性，細(xì)胞活性（%）=實(shí)驗(yàn)組OD 值/對(duì)照組OD 值×100%。

1.4 試劑盒測(cè)定SOD 和GSH-Px 活性和MDA含量

各組心肌細(xì)胞處理48 h后，收集細(xì)胞及上清培養(yǎng)液，分別參照SOD、MDA 和GSH-Px 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書對(duì)SOD 和GSH-Px活性及MDA 含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 ELISA檢測(cè)炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平

各組心肌細(xì)胞處理48 h 后，收集上清培養(yǎng)液，使用ELISA 檢測(cè)試劑盒對(duì)IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平進(jìn)行檢測(cè)，具體操作步驟參考制造商說(shuō)明書。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率

心肌細(xì)胞分組處理48 h 后，收集3×105個(gè)細(xì)胞，采用AnnexinⅤ-FITC/PI 試劑盒說(shuō)明書處理，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.7 Western blot 檢測(cè)心肌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、TLR4、NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表達(dá)水平

抽提處理48 h 各組心肌細(xì)胞總蛋白，BCA 法測(cè)定上清中蛋白濃度。蛋白加熱變性。等量蛋白行10% SDS-PAGE 凝膠電泳，隨后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%脫脂奶粉中封閉2 h，參照一抗說(shuō)明書按1∶1 000 稀釋Cleaved Caspase-3、TLR4、NF-κB 和p-NF-κB，加入相應(yīng)一抗，4℃過(guò)夜孵育，再加入1∶3 000 稀釋的二抗，室溫封閉2 h，以ECL 進(jìn)行顯影，使用成像系統(tǒng)采集圖像，以GAPDH 為內(nèi)參，分別計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（）表示，均符合正態(tài)分布，兩組間用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA 對(duì)CVB3 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活性的影響

與對(duì)照組相比，CVB3 組心肌細(xì)胞活性顯著降低（P＜0.05）；與CVB3 組相比，CVB3+TanⅡA 組心肌細(xì)胞活性明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。見表1。

表1 各組心肌細(xì)胞活性比較（±s）Table 1 Comparison of cardiomyocyte activity in each group（±s）

表1 各組心肌細(xì)胞活性比較（±s）Table 1 Comparison of cardiomyocyte activity in each group（±s）

注：與Control 組比，*P＜0.05；與CVB3 組比，&P＜0.05。

組別對(duì)照組TanⅡA CVB3 CVB3+TanⅡA CVB3+Rib F 值P 值細(xì)胞活性（%）0 h 100.00±5.12 99.02±5.04 98.46±4.89 98.22±5.02 99.11±5.17 0.056 0.993 24 h 99.64±5.11 96.48±5.26 76.28±4.61a 88.32±4.06b 90.14±4.37b 11.047 0.001 48 h 97.85±5.14 96.33±5.39 52.16±3.65a 80.92±4.33b 84.57±4.27b 48.006 0.000

2.2 丹參酮ⅡA 對(duì)CVB3 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

與對(duì)照組相比，CVB3 組SOD 和GSH-Px 活性明顯降低（P＜0.05），MDA 含量明顯增多（P＜0.05）；與CVB3 組相比，CVB3+TanⅡA 組SOD 和GSHPx 活性上升（P＜0.05），MDA 含量下降（P＜0.05）。見表2。

表2 各組心肌細(xì)胞SOD 和GSH-Px 活性及MDA 含量比較（±s）Table 2 Comparison of SOD and GSH-Px activities andMDA content of cardiomyocytes in each group（±s）

表2 各組心肌細(xì)胞SOD 和GSH-Px 活性及MDA 含量比較（±s）Table 2 Comparison of SOD and GSH-Px activities andMDA content of cardiomyocytes in each group（±s）

注：與對(duì)照組組比，aP＜0.05；與CVB3 組比，bP＜0.05。

組別對(duì)照組TanⅡA CVB3 CVB3+TanⅡA CVB3+Rib F 值P 值SOD（U/mL）77.63±6.11 75.28±6.08 58.04±5.02a 71.26±6.07b 73.44±6.81b 4.847 0.0020 MDA（U/mL）12.52±0.13 13.41±1.01 28.65±3.02a 16.14±1.70b 14.15±1.57b 42.919 0.000 GSH-Px（U/mL）148.92±10.21 145.12±11.75 91.38±8.11a 133.74±9.61b 139.26±12.08b 14.851 0.000

2.3 丹參酮ⅡA 對(duì)CVB3 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響

與對(duì)照組相比，CVB3 組IL-1β、IL-6 和TNF-α水平升高（P＜0.05）；與CVB3 組相比，CVB3+TanⅡA 組IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平明顯下降（P＜0.05）。見表3。

表3 各組心肌細(xì)胞IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平比較（±s）Table 3 Comparison of levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in cardiomyocytes of each group（±s）

表3 各組心肌細(xì)胞IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平比較（±s）Table 3 Comparison of levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in cardiomyocytes of each group（±s）

注：與對(duì)照組組比，aP＜0.05；與CVB3 組比，bP＜0.05。

TNF-α（pg/mL）21.41±2.32 35.45±3.14 367.95±36.84a 107.85±10.44b 76.52±7.63b 195.750 0.000組別對(duì)照組TanⅡA CVB3 CVB3+TanⅡA CVB3+Rib F 值P 值IL-1β（pg/mL）12.52±0.13 11.81±1.04 28.65±3.02a 16.14±1.70b 14.24±1.38b 47.595 0.000 IL-6（pg/L）0.71±0.07 0.68±0.06 3.55±0.37a 1.06±0.13b 0.91±0.09b 131.406 0.000

2.4 丹參酮ⅡA對(duì)CVB3誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組相比，CVB3 組心肌細(xì)胞凋亡率和Cleaved Caspase-3 的表達(dá)升高（P＜0.05）；與CVB3組相比，CVB3+TanⅡA 組細(xì)胞凋亡率和Cleaved Caspase-3的表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。見圖1和表4。

表4 各組心肌細(xì)胞凋亡率比較（±s）Table 4 Comparison of apoptosis rate of cardiomyocytes in each group（±s）

表4 各組心肌細(xì)胞凋亡率比較（±s）Table 4 Comparison of apoptosis rate of cardiomyocytes in each group（±s）

注：與對(duì)照組組比，aP＜0.05。

組別對(duì)照組TanⅡA CVB3凋亡率（%）2.52±0.59 2.88±0.62 25.79±3.24a Cleaved Caspase-3 0.11±0.01 0.12±0.01 0.52±0.05a

圖1 丹參酮ⅡA 對(duì)CVB3 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和Cleaved Caspase-3 表達(dá)的影響Figure 1 The effect of Tanshinone ⅡA on CVB3-induced cardiomyocyte apoptosis and Cleaved Caspase-3 expression

2.5 丹參酮ⅡA 對(duì)CVB3 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中TLR4/NF-κB 信號(hào)通路激活的影響

與對(duì)照組相比，CVB3 組心肌細(xì)胞中TLR4 和p-NF-κB 的表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；與CVB3 組相比，CVB3+TanⅡA 組細(xì)胞中TLR4 和p-NF-κB 的表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05）。見圖2和表5。

圖2 Western blot 檢測(cè)各組心肌細(xì)胞中TLR4、NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表達(dá)Figure 2 Western blot detection of TLR4，NF-κB and p-NF-κB protein expression in cardiomyocytes of each group

表5 各組心肌細(xì)胞中TLR4、NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表達(dá)水平比較（±s）Table 5 Comparison of TLR4，NF-κB and p-NF-κB protein expression levels in cardiomyocytes of each group（±s）

表5 各組心肌細(xì)胞中TLR4、NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表達(dá)水平比較（±s）Table 5 Comparison of TLR4，NF-κB and p-NF-κB protein expression levels in cardiomyocytes of each group（±s）

注：與對(duì)照組比，aP＜0.05；與CVB3 組比，bP＜0.05。

p-NF-κB 0.32±0.03 0.33±0.03 0.63±0.06a 0.41±0.04b 0.38±0.03b 30.247 0.000組別對(duì)照組TanⅡA CVB3 CVB3+TanⅡA CVB3+Rib F 值P 值TLR4 0.11±0.01 0.12±0.01 0.89±0.09a 0.23±0.02b 0.21±0.02b 176.736 0.000 NF-κB 0.82±0.08 0.81±0.08 0.83±0.07 0.81±0.08 0.80±0.07 0.067 0.991

3 討論

心肌炎定義為心肌損傷后心肌的炎癥，也是引發(fā)小兒心力衰竭患者的主要原因之一［9］。腸道病毒感染被認(rèn)為是該疾病的一個(gè)主要原因，尤其是年輕患者中CVB3 的感染。CVB3 是一種重要的人類病原體，可誘導(dǎo)兒童和年輕人的急性和慢性病毒性心肌炎［10］。大約50%的心肌炎及其末期擴(kuò)張型心肌病可歸因于CVB3 感染［11］。目前關(guān)于病毒性心肌炎的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，且缺乏病毒性心肌炎治療的特效藥。因此探究病毒性心肌炎的發(fā)病機(jī)制及開發(fā)有效的藥物對(duì)病毒性心肌炎的臨床治療顯得尤為重要。

丹參酮ⅡA 來(lái)源于唇形科植物丹參的根及根莖，主要用于治療冠心病、心律過(guò)速、心絞痛等心血管疾?。?2］。近期研究顯示，丹參酮ⅡA 磺酸鈉注射液廣泛治療病毒性心肌炎的小鼠模型及臨床應(yīng)用［13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示丹參酮ⅡA 對(duì)CVB3 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。以往研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA 可能通過(guò)調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)發(fā)揮其對(duì)器官損傷的保護(hù)作用［14］。本實(shí)驗(yàn)中丹參酮ⅡA 能夠提高CVB3 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞抗氧化酶SOD 和GSH-Px 活性，降低MDA 的含量，減輕心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。此外，丹參酮ⅡA 可降低CVB3 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞分泌的炎性因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平，降低炎癥反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以上研究相符。一項(xiàng)研究顯示，丹參酮ⅡA 可通過(guò)降低TLR4-MyD88-NF-κB 信號(hào)通路，對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用［15］。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮IIA 通過(guò)TLR-4 介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路降低炎性細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激水平的產(chǎn)生，改善缺氧缺血性腦?。?6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丹參酮IIA 可下調(diào)CVB3 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中TLR4 和NF-κB 蛋白表達(dá)。表明丹參酮IIA 能夠抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的激活。

總之，丹參酮ⅡA 能夠改善CVB3 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡，其潛在的機(jī)制可能與抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的活化有關(guān)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將對(duì)丹參酮ⅡA 在病毒性心肌炎小鼠心臟的影響進(jìn)一步探究，以期為病毒性心肌炎的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。