炎癥性腸病患者艱難梭菌感染的流行情況及危險(xiǎn)因素研究

伍眾文 劉平娟 郭鵬豪 陳怡麗 廖康 黃彬

炎癥性腸?。↖nflammatory bowel disease，IBD）可以分為克羅恩?。–rohn's disease，CD）與潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）。目前兩種疾病患者艱難梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）的流行情況和危險(xiǎn)因素不同研究結(jié)論差異較大［1-7］。艱難梭菌的無(wú)癥狀攜帶/定植（asymptomatic carriage/Colonization，下文統(tǒng)稱定植）是CDI 的危險(xiǎn)因素［8］，是艱難梭菌傳播的重要途徑，但目前國(guó)內(nèi)IBD 患者的定植情況未有文獻(xiàn)報(bào)道。因此，需要建立完善的艱難梭菌感染、定植檢測(cè)方法，調(diào)查國(guó)內(nèi)IBD 患者的艱難梭菌流行病學(xué)及危險(xiǎn)因素情況，為其診療提供依據(jù)［9］。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

GeneXpert 全自動(dòng)醫(yī)用PCR 分析系統(tǒng)和GeneXpert C.difficile 檢測(cè)試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR 法）購(gòu)自美國(guó)Cepheid 公司。厭氧產(chǎn)氣袋購(gòu)自英國(guó)OXOID 公司。mini VIDAS 全自動(dòng)免疫分析儀和艱難梭菌谷氨酸脫氫酶檢測(cè)試劑盒（GDH，酶聯(lián)免疫熒光法）以及艱難梭菌毒素A/B 檢測(cè)試劑盒（CDAB，酶聯(lián)免疫熒光法）、艱難梭菌顯色培養(yǎng)基（CDIF）、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Vitek MS）和基質(zhì)液CHCA 均購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：2017年11月至2019年6月，結(jié)合臨床實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)檢查、內(nèi)鏡和組織病理性，診斷為UC 或克羅恩?。–D）的住院患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：IBD 分型不能確定患者；入院48 h 內(nèi)糞便未能收集，病史不完整患者。研究經(jīng)過(guò)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。研究對(duì)象為群體數(shù)據(jù)，并非具體病例無(wú)須知情同意。

1.3 艱難梭菌感染、定植和陰性診斷標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)《中國(guó)成人艱難梭菌感染診斷和治療專家共識(shí)》［10］和美國(guó)IDSA 指南［11］，將GDH 與CDAB同時(shí)陽(yáng)性，或B 毒素分子檢測(cè)陽(yáng)性，且腹瀉次數(shù)≥3次/天或腸梗阻患者診斷為感染；糞便檢測(cè)四項(xiàng)其中有一項(xiàng)陽(yáng)性但無(wú)腹瀉或腸梗阻患者診斷為定植；無(wú)艱難梭菌檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性患者診斷為陰性。

1.4 實(shí)驗(yàn)流程

留取入院診斷為IBD 患者住院48 h 內(nèi)的大便，分為四份（每份約1 mL），分別用于以下檢測(cè)：免疫熒光法檢測(cè)GDH、CDAB，實(shí)時(shí)熒光PCR 法檢測(cè)艱難梭菌B 毒素、二元毒素和高產(chǎn)毒RT027 菌株的tcdC基因，顯色培養(yǎng)法培養(yǎng)艱難梭菌。查閱患者電子病歷，登記患者各項(xiàng)指標(biāo)。

1.5 谷氨酸脫氫酶檢測(cè)方法

①200 μL 糞便加入1 000 μL 預(yù)處理液（R1）；②充分震蕩混勻后，3 000 r/m 離心10 min；③取上清液300 μL 加入測(cè)試條上機(jī)檢測(cè)，根據(jù)cut-off 值（陰性：檢測(cè)值＜0.10；陽(yáng)性：檢測(cè)值≥0.10）判讀結(jié)果。

1.6 艱難梭菌A/B 毒素檢測(cè)方法

操作同GDH，根據(jù)cut-off值（陰性：＜0.13 ng/mL；灰區(qū)：（0.13～0.37）ng/mL；陽(yáng)性＞0.37 ng/mL）判讀結(jié)果。

1.7 實(shí)時(shí)熒光PCR 法

①拭子挑取少量標(biāo)本并插入處理液小瓶中；②震蕩混勻后將全部液體轉(zhuǎn)移至Gene Xpert C.difficile Assay 檢測(cè)試劑盒中，然后上機(jī)檢測(cè)。檢測(cè)標(biāo)本中艱難梭菌的毒素B、二元毒素和缺失nt117 的tcdC 基因序列。

1.8 顯色培養(yǎng)法

取糞便標(biāo)本約300 μL 與等體積95%乙醇振蕩混勻，室溫靜置1 h，3 000 r/m 離心5 min，用無(wú)菌棉簽取上述預(yù)處理標(biāo)本沉淀接種于顯色培養(yǎng)基，置于37℃厭氧培養(yǎng)24～48 h。挑取邊緣不規(guī)則，扁平干燥，伴有“馬糞”臭味，黑色典型菌落進(jìn)行鑒定。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（）表示，采用t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布采用M（P25，P75）表示；兩項(xiàng)比較指標(biāo)有一項(xiàng)或兩項(xiàng)不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般情況比較

克羅恩病組（CD）和潰瘍性結(jié)腸炎組（UC）例數(shù)分別為80（61.5%）和50（38.5%），定植率和感染率克羅恩病患者分別為20.0%和8.8%，潰瘍性結(jié)腸炎患者分別為16.0%和26.0%。IBD 患者總體艱難梭菌定植率與感染率分別18.5%［（16+8）/130］和15.4%［（7+13）/130］。兩組年齡、活動(dòng)期重度比例、巨細(xì)胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）、EB 病毒感染率、3 個(gè)月內(nèi)激素、抗生素使用率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 一般情況比較［n（%），（±s）］Table 1 General differences between CD and UC group［n（%），（±s）］

表1 一般情況比較［n（%），（±s）］Table 1 General differences between CD and UC group［n（%），（±s）］

項(xiàng)目性別分組男女t/χ2值0.095 P 值0.758年齡活動(dòng)期-4.817-5.772 0.000 0.000 38.6160.000分組腹瀉次數(shù)緩解期輕度中度重度(空白)陰性定植感染少于3 次3～4 次5～7 次多于等于8 次-1.950 0.327 7.033-5.355 0.051 0.567 0.008 0.000發(fā)熱CMV EB激素單抗免疫抑制劑抗生素克羅恩病組（n=80）47（58.8）33（41.3）29.1±11.1 8（10.0）17（21.3）46（57.5）1（1.3）8（10.0）57（71.3）16（20.0）7（8.8）49（61.3）25（31.3）6（7.5）0（0.0）13（16.3）4（5.0）7（8.8）7（8.8）8（10.0）18（22.5）19（23.8）潰瘍性結(jié)腸炎組（n=50）28（21.5）22（16.9）39.7±13.8 0（0.0）4（8.0）22（44.0）22（44.0）2（4.0）29（58.0）8（16.0）13（26.0）10（20.0）20（40.0）12（24.0）8（16.0）10（20.0）12（24.0）21（42.0）18（36.0）4（8.0）7（14.0）20（40.0）0.297 10.292 20.129 14.710 0.146 1.431 3.869 0.586 0.001 0.000 0.000 0.703 0.232 0.049

2.2 患者大便檢測(cè)情況

兩組大便血紅蛋白陽(yáng)性率（OB）、轉(zhuǎn)鐵蛋白陽(yáng)性率（TF）、大便WBC 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組四種艱難梭菌檢測(cè)方法陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 大便檢測(cè)比較［n（%）］Table 2 Stool examination differences［n（%）］

2.3 患者炎癥標(biāo)志物比較

兩組靜脈血白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、C 反應(yīng)蛋白（CRP）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 炎癥指標(biāo)比較［（±s），M（P25，P75）］Table 3 Inflammatory biomarkers differences between CD and UC group［（±s），M（P25，P75）］

表3 炎癥指標(biāo)比較［（±s），M（P25，P75）］Table 3 Inflammatory biomarkers differences between CD and UC group［（±s），M（P25，P75）］

項(xiàng)目ESR WBC CRP n 126 129 121克羅恩病組47.5±29.5 6.9（5.28，9.37）28.2（12.43，47.20）潰瘍性結(jié)腸炎組38.5（18.75，62）8.3（6.55，10.92）11.5（4.20，37.05）Z 值-0.849-2.789-2.553 P 值0.396 0.005 0.011

2.4 艱難梭菌不同檢測(cè)方法結(jié)果

指南推薦聯(lián)合方法結(jié)果與tcdB 法比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。二元毒素（CDT）與O27高毒株檢測(cè)均為陰性。見表4～5，圖1。

表4 4 種檢測(cè)方法的結(jié)果Table 4 4 methods result

表5 tcdB 與聯(lián)合法結(jié)果比較Table 5 differences between tcdB and union method］

圖1 艱難梭菌四種檢測(cè)方法的結(jié)果Figure 1 4 methods result

3 討論

臨床開展的檢測(cè)艱難梭菌的方法有谷氨酸脫氫酶免疫學(xué)檢測(cè)（GDH）、艱難梭菌A/B 毒素免疫學(xué)檢測(cè)（CDAB）、艱難梭菌基因分子檢測(cè)（NAAT）、艱難梭菌培養(yǎng)。指南推薦以GDH 和CDAB 聯(lián)合為基礎(chǔ)，NAAT、產(chǎn)毒培養(yǎng)（TC）或細(xì)胞毒試驗(yàn)確證（CCTA）的聯(lián)合法［10］。研究發(fā)現(xiàn)由于CDAB 的陽(yáng)性率低下，大量標(biāo)本需要再進(jìn)一步檢測(cè)，所以單用tcdB 檢測(cè)是臨床檢測(cè)更好的選擇。

國(guó)內(nèi)艱難梭菌感染率情況根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道：IBD人群整體感染率范圍在5.0～13.9%；UC 的范圍在5.56%～22.8%；CD 的范圍在4.0%～20.45%［2-7］。研究發(fā)現(xiàn)患者整體的艱難梭菌感染率為15.4%，潰瘍性結(jié)腸炎（UC）感染率為26.0%，克羅恩?。–D）感染率為8.8%，與浙江邵逸夫醫(yī)院報(bào)道感染率13.9%、24.7%和8.5%接近［7］。與一些報(bào)道［3，12-13］結(jié)果差異較大可能是檢測(cè)方法差異導(dǎo)致的，尤其是一些單純CDAB 檢測(cè)報(bào)道。

與癥狀明顯的艱難梭菌感染相比，艱難梭菌的定植往往遭到臨床的忽視。在中國(guó)，上海市報(bào)道健康人群艱難梭菌定植率為0.70%［14］，臺(tái)灣報(bào)道入院患者艱難梭菌定植率達(dá)20.0%［15］。對(duì)于IBD 人群，國(guó)外有研究發(fā)現(xiàn)兒童患者，定植率可達(dá)10.8%～17%；臨床緩解期、無(wú)激素、抗生素、免疫抑制劑使用史，近期住院史患者產(chǎn)毒菌株定植率達(dá)8.2%［16］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IBD患者定植率為18.5%，其中UC 患者定植率為16%，CD 患者為20%（兩者定植率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異），據(jù)筆者所知是中國(guó)IBD 人群定植情況的首次報(bào)道。

艱難梭菌定植有重要臨床意義，根據(jù)患者攜帶菌株是否攜帶產(chǎn)毒基因，可分為產(chǎn)毒菌株攜帶和非產(chǎn)毒菌株攜帶［17］。產(chǎn)毒菌株的攜帶不但能造成艱難梭菌的傳播，而且會(huì)加大攜帶者自身感染的風(fēng)險(xiǎn)［8］；與之相反，非產(chǎn)毒株攜帶通過(guò)激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，能降低攜帶者艱難梭菌感染風(fēng)險(xiǎn)［18］。這也凸顯了tcdB 的獨(dú)特價(jià)值，它是一種簡(jiǎn)便且能區(qū)分產(chǎn)毒與非產(chǎn)毒菌株定植的臨床檢測(cè)方法。

因?yàn)榭陀^條件的限制，本研究沒有采用參考方法（產(chǎn)毒培養(yǎng)或細(xì)胞毒試驗(yàn)）檢測(cè)，艱難梭菌感染/定植分組可能會(huì)有偏差；由于是查閱患者病歷的回顧性研究，一些危險(xiǎn)因素（如質(zhì)子泵抑制劑、住院史、胃腸手術(shù)史、IBD 評(píng)分等）因采集不完整而沒有納入研究；因是單中心研究，樣本數(shù)量有限，可能沒有全面地揭示患者真實(shí)情況。