孫美玲, 馮曉光, 侯雪飛, 常希光, 陳湘寧
(1.北京農(nóng)學院食品科學與工程學院,農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點實驗室北京 102206; 2.北京裕農(nóng)優(yōu)質農(nóng)產(chǎn)品有限公司,北京 101400)
水晶冰菜(Mesembryanthemumcrystallinum)是番杏科(Aizoaceae)日中花屬(Mesembryanthemum)中的1 a或2 a生的草本植物,又名冰葉日中花、非洲冰花以及冰草等[1]。水晶冰菜原產(chǎn)自南非沙漠地區(qū),近年來由日本引進至中國國內(nèi),其莖葉的表層部位分布著大量凸起的鹽囊泡細胞,在陽光照射下晶瑩剔透,因此而得名[2-3]。水晶冰菜生食口感清脆、生津止渴、健脾開胃,不僅含有蛋白質、脂肪、維生素、氨基酸、鈣、鎂和鐵等基本營養(yǎng)成分,而且含有蘋果酸、肌醇和黃酮類化合物[4-5]。作為高營養(yǎng)價值的功能性蔬菜,水晶冰菜不僅能抗氧化、抗腫瘤、增強人體免疫力,而且能預防心腦血管疾病、動脈粥樣硬化和糖尿病等發(fā)生[6-7]。糖尿病是中國最常見的慢性病,其中Ⅱ型糖尿病患者的比例在95%左右,這和飲食習慣有直接的關系,而控制餐后體內(nèi)的血糖水平已被視為治療該病的有效手段[8]。α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶是將碳水化合物消化為葡萄糖的關鍵酶,在酶的催化下葡萄糖經(jīng)小腸進入血液使血糖升高,目前臨床上常使用阿卡波糖作為抑制劑降低血糖水平,但時常伴隨著一些副作用如胃腸功能紊亂等發(fā)生[9]。相比之下,天然降血糖藥物則因其天然性更安全。天然降血糖藥物是指含有降糖活性物質如多糖、生物堿、萜類、酚酸類和黃酮類物質等的植物[10]。水晶冰菜中含有大量黃酮類物質[11],具有一定的降糖活性,因此具備作為天然降血糖藥物的潛力。目前,與水晶冰菜相關的研究多集中在栽培種植[12]和景天酸代謝等方面[13],對其純化尤其是體外降糖活性的關注較少。本研究以水晶冰菜為原料,對水晶冰菜總黃酮粗提物進行大孔樹脂純化,以吸附率和解吸率為指標,對6種不同極性的樹脂(D101、AB-8、NKA-9、HPD-100、X-5、S-8)進行篩選,再通過靜態(tài)與動態(tài)吸附與解吸試驗,探討樣品質量濃度、pH值、洗脫液體積分數(shù)、上樣流速與上樣體積、洗脫流速與洗脫體積對水晶冰菜總黃酮樹脂純化的影響;在此基礎上,以對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率評價指標,阿卡波糖為對照,考察純化前后總黃酮的體外降糖活性變化,探討水晶冰菜作為天然降血糖藥物的潛力,為水晶冰菜生物活性的開發(fā)利用奠定理論基礎。
水晶冰菜購自北京農(nóng)學院家屬院超市;蘆丁、維生素C、阿卡波糖標準品、大孔樹脂(D101、AB-8、NKA-9、HPD-100、X-5、S-8)均購自北京中科生邦有限公司;α-淀粉酶 (166.7 μkat·g-1)、α-葡萄糖苷酶 (166.7 μkat·g-1) 、4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷酶(pNPG),購自北京暢華志誠科技有限公司;其余試劑為分析純,購自北京華佰泰生物科技有限公司。
AL204電子天平:梅特勒-托利多儀器有限公司;T6-新世紀紫外分光光度計:北京普析通用儀器有限公司;L530臺式離心機:湖南赫西儀器裝備有限公司;KQ-500DE超聲波清洗機:昆山超聲儀器有限公司;FT135中草藥粉碎機:天津泰斯特儀器有限公司;BK-FD10T臺式冷凍干燥機:濟南歐萊博科學儀器有限公司;DZF-1真空干燥箱:上海科恒實業(yè)發(fā)展有限公司;RE-2000B旋轉蒸發(fā)儀:上海亞榮生化儀器廠。
1.3.1 水晶冰菜總黃酮粗提物的制備 將水晶冰菜置于60 ℃真空干燥箱內(nèi)干燥48 h蒸干水分,碾碎過60目篩后取100 g于燒杯中加入2 500 mL體積分數(shù)70%乙醇溶液攪拌30 min,在60 ℃下以250 W的功率在超聲波清洗機中超聲120 min,之后于離心機中10 000 r·min-1下離心15 min,殘渣重復提取2次,合并上清液轉移至旋轉蒸發(fā)儀內(nèi)蒸至無醇味,于冷凍干燥機中干燥24 h,得水晶冰菜總黃酮粗提物(以下簡稱粗提物),用去離子水溶解配置成不同質量濃度粗提物溶液備用。
1.3.2 水晶冰菜總黃酮質量濃度的測定 參考荊常亮[14]的方法稍作修改,采用NaNO2-Al(NO3)3比色法,得到蘆丁標準曲線的線性回歸方程為:y=0.102 1x+0.000 2,R2=0.999 8,進而測定水晶冰菜總黃酮質量濃度。
1.3.3 大孔樹脂的篩選 選取6種極性不同的大孔樹脂(D101、AB-8、NKA-9、HPD-100、X-5、S-8),具體參數(shù)如表1所示。按照楊宇華等[15]方法進行預處理,按照m(大孔樹脂/g)∶V(粗提物溶液/L)=1∶20的比例在25 ℃、180 r·min-1的水浴恒溫振蕩器中振蕩24 h,真空抽濾,測定濾液中總黃酮質量濃度C1;用去離子水沖洗吸附后的大孔樹脂至液體清亮無渾濁,加入20 mL體積分數(shù)70%乙醇作為解吸液,同樣條件下振蕩24 h,真空抽濾,測定濾液中總黃酮質量濃度C2。大孔樹脂吸附率、解吸率和回收率的公式如下:
(1)
(2)
(3)
式中:Q1、Q2、R分別為大孔樹脂的吸附率、解吸率和回收率;C0、C1、C2分別為吸附前、吸附后和解吸液中總黃酮質量濃度;V1、V2分別為樣品溶液和解吸液體積。
表1 6種大孔樹脂參數(shù)比較Table 1 Comparison of parameters of six macroporous resins
1.3.4 水晶冰菜總黃酮大孔樹脂純化靜態(tài)吸附和解吸試驗 (1)靜態(tài)吸附動力學曲線的繪制。稱取2 g大孔樹脂,加入40 mL 粗提物溶液,按照1.3.3方法處理,每30 min從溶液中快速吸取1 mL,以時間為橫坐標,吸附率為縱坐標繪制吸附動力學曲線。
(2)粗提物溶液質量濃度對靜態(tài)吸附的影響。稱取8份1 g大孔樹脂,加入20 mL 粗提物溶液,分別調節(jié)粗提物溶液質量濃度為0.02、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 g·L-1,按照1.3.3方法進行吸附處理,計算吸附率。
(3)pH值對靜態(tài)吸附的影響。稱取9份1 g大孔樹脂,加入20 mL 粗提物溶液,分別調節(jié)粗提物溶液和體積分數(shù)70%乙醇解吸液pH值為1~9,按照1.3.3方法進行吸附和解吸處理,計算吸附率和解吸率。
(4)洗脫液體積分數(shù)對靜態(tài)吸附的影響。稱取7份1 g大孔樹脂,加入20 mL 粗提物溶液,洗脫液乙醇體積分數(shù)為30%~90%,按照1.3.3方法進行解吸處理,計算解吸率。
1.3.5 水晶冰菜總黃酮大孔樹脂純化動態(tài)吸附和解吸試驗 (1)上樣流速和上樣體積對動態(tài)吸附的影響。選取1.6 cm×30 cm的玻璃管層析柱濕法裝柱,確定柱床體積1 BV=40 mL,在靜態(tài)吸附基礎上以40、60、80、100和120 mL·h-1的流速上樣,計算吸附率。在合適的流速條件下,每8 mL收集1管流出液,共收集20管,測定總黃酮質量濃度,繪制泄漏曲線。
(2)洗脫流速和洗脫體積對動態(tài)吸附的影響。選取最佳上樣條件上樣,待吸附飽和后用去離子水沖洗樹脂至洗脫液無色,先固定體積分數(shù)80%乙醇溶液為200 mL,在靜態(tài)吸附基礎上以40、60、80、100和120 mL·h-1的流速洗脫,計算解吸率。在合適的流速條件下,每8 mL收集1管洗脫液,共收集25管,測定總黃酮質量濃度,繪制洗脫曲線。
1.3.6 水晶冰菜總黃酮純化物純度測定 將洗脫液轉移至旋轉蒸發(fā)儀內(nèi)蒸至無醇味,于低溫冷凍干燥機中干燥24 h,得水晶冰菜總黃酮純化物(以下簡稱純化物),按下式計算純度:
(4)
式中:m1、m2分別為粗提物和純化物的質量。
1.3.7 水晶冰菜總黃酮體外降血糖活性試驗 (1)抑制α-葡萄糖苷酶的活性測定。參考康彤[16]的方法稍作修改,將50 μL不同質量濃度(0.01、0.04、0.08、0.12、0.15 g·L-1)粗提物和純化物溶液分別與50 μL α-葡萄糖苷酶(8.335 nkat·mL-1)均勻混合,于37 ℃下保溫15 min。然后加入100 μL 的pNPG(3 mmol·L-1,溶解于0.1 mol·L-1,pH值6.8磷酸鹽緩沖液中),在37 ℃反應20 min,添加750 μL Na2CO3(0.1 mol·L-1)終止反應,在405 nm處測定吸光度。用阿卡波糖作陽性對照,等體積磷酸鹽緩沖液(0.1 mol·L-1,pH值6.8)代替α-葡萄糖苷酶溶液做對照組,抑制率公式如下:
(5)
式中:W為粗提物溶液或阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率;A為粗提物或純化物組的吸光度;A0為對照組的吸光度;A1為PBS和pNPG溶液與酶溶液混合反應的吸光度;A2為PBS和pNPG溶液混合反應的吸光度。
(2)抑制α-淀粉酶的活性測定。參考李波等[17]的方法稍作修改,將100 μL不同質量濃度(0.01、0.04、0.08、0.12、0.15 g·L-1)粗提物和純化物溶液分別與200 μL α-淀粉酶溶液(16.67 nkat·mL-1)在37 ℃下預混合10 min,加入400 μL 可溶性淀粉溶液(1.0 g·mL-1)在37 ℃下反應15 min,反應結束后添加400 μL DNS試劑終止。將混合物在沸水浴加熱5 min,冰水浴冷卻至25 ℃,并用2.9 mL去離子水稀釋,于540 nm處測定其吸光度。用阿卡波糖作陽性對照,等體積磷酸鹽緩沖液(0.1 mol·L-1、pH值6.8)代替α-淀粉酶溶液做對照組,抑制率公式如下:
(6)
式中:W為粗提物溶液或阿卡波糖對α-淀粉酶的抑制率;A為粗提物或純化物組的吸光度;A0為對照組的吸光度。
1.3.8 數(shù)據(jù)分析 每組試驗重復3次,試驗結果以均值±標準差表示,用SPSS Statistics 21和Microsoft Excel 2007軟件進行試驗數(shù)據(jù)分析和繪圖;IC50值指酶抑制劑對酶的半抑制質量濃度,利用 GraphPad Prism 8 軟件進行計算分析。
合適的純化樹脂不僅要求吸附能力強,也需要較高的解吸能力。如圖1所示,對比6種大孔樹脂吸附率可知,AB-8最高為(51.36±0.07)%,D101吸附率為(48.32±0.21)%,比AB-8低0.59%,排在6種大孔樹脂第3位。對比解吸率可知,D101最高為(54.95±0.09)%,明顯高于其他大孔樹脂。通過綜合考慮,選擇吸附和解吸效果較好的大孔樹脂D101對水晶冰菜總黃酮粗提物進行純化。
注:不同小寫字母代表相同指標內(nèi)差異顯著,P<0.05。下同。
2.2.1 D101型大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學曲線 D101型大孔樹脂的靜態(tài)吸附動力學曲線如圖2所示。當吸附時間在0.5~3.5 h內(nèi),吸附率隨時間延長有明顯上升趨勢,3.5 h時吸附率為35.39%,此后曲線逐漸趨于平緩,基本到達吸附平衡,在10 h時達到最大吸附率44.10%。
2.2.2 粗提物質量濃度對D101型大孔樹脂靜態(tài)吸附的影響 由圖3知,D101型大孔樹脂吸附率與粗提物質量濃度呈正相關。當粗提物質量濃度0.02~0.15 g·L-1時,吸附率顯著上升;當粗提物質量濃度大于0.15 g·L-1時吸附率緩慢上升,且在0.30 g·L-1時達到最大吸附率51.86%,此后吸附率略微下降。
圖2 D101型大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學曲線Fig.2 Static adsorption kinetic curve of D101 macroporous resin
圖3 粗提物質量濃度對D101型大孔樹脂吸附率的影響Fig.3 Effect of total flavonoids on adsorption and desorption rate of D101 macroporous resin
2.2.3 pH值對D101型大孔樹脂吸附率和解吸率的影響 由圖4可知,當溶液pH值在1~4 時,D101型大孔樹脂吸附率逐漸上升,當pH值為4時達到80.65%;當pH值大于4時,吸附率隨pH值的上升而逐漸下降,即在酸性條件下吸附率明顯上升,在堿性條件下急劇下降。同時,洗脫液pH值也呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢,在pH值6時解吸率最高為54.87%,此后緩慢下降。
圖4 pH值對D101型大孔樹脂吸附率和解吸率的影響Fig.4 Effect of pH value on adsorption rate and desorption rate of D101 macroporous resin
2.2.4 洗脫液乙醇體積分數(shù)對D101型大孔樹脂解吸率的影響 由圖5可知,當洗脫液乙醇體積分數(shù)在30%~60%時,D101型大孔樹脂解吸率隨乙醇體積分數(shù)的上升而緩慢上升,而在乙醇體積分數(shù)60%~80%范圍內(nèi)急劇提升,當乙醇體積分數(shù)80%時達到最大解吸率81.28%,之后緩慢下降。
圖5 洗脫液乙醇體積分數(shù)對D101型大孔樹脂解吸率的影響Fig.5 Effect of volume fraction of eluent ethanol on desorption rate of D101 macroporous resin
2.3.1 上樣流速和上樣體積對D101型大孔樹脂吸附率的影響 由圖6知,D101型大孔樹脂吸附率隨上樣流速的上升而下降,而且下降趨勢明顯。當上樣流速為60 mL·h-1時D101型大孔樹脂吸附率為79.43%,略高于20、40 mL·h-1時的吸附率。從節(jié)約時間成本提高試驗效率的角度來講,選擇60 mL·h-1作為最佳上樣流速,此時動態(tài)泄露曲線如圖7所示。當流出液中目標成分的質量濃度為上樣液質量濃度的1/10時即為泄漏點,此時大孔樹脂基本達到吸附飽和狀態(tài),可以停止上樣。第6管時流出液質量濃度0.026 g·L-1,第7管時流出液質量濃度為0.036 g·L-1,接近上樣液質量濃度0.30 g·L-1的1/10,因此選擇第7管56 mL為最佳上樣體積。
圖6 上樣流速對D101型大孔樹脂吸附率的影響Fig.6 Effect of sample flow rate on adsorption rate of D101 macroporous resin
圖7 水晶冰菜總黃酮的動態(tài)泄露曲線Fig.7 Dynamic leakage curve of total flavonoids in Mesembryanthemum crystallinum
2.3.2 洗脫流速和洗脫體積對D101型大孔樹脂解吸率的影響 由圖8可知,當固定體積分數(shù)80%乙醇溶液為200 mL時,隨著洗脫流速的上升,D101型大孔樹脂的解吸率先上升后下降。當洗脫流速在40 mL·h-1時達到最大的解吸率83.43%,而洗脫流速在60 mL·h-1時的解吸率為81.93%,略高于40 mL·h-1時的吸附率,從減少時間成本的角度選擇60 mL·h-1作為最佳洗脫流速,對應的動態(tài)洗脫曲線如圖9所示。隨著洗脫體積的上升,洗脫液中總黃酮質量濃度先增大后減小,在第6管即洗脫體積為48 mL時達到峰值,到洗脫體積128 mL時總黃酮質量濃度幾乎不變,說明在此時總黃酮基本洗脫完全,故選擇128 mL作為最佳洗脫體積。
圖8 洗脫流速對D101型大孔樹脂解吸率的影響Fig.8 Effect of elution velocity on desorption rate of D101 macroporous resin
當粗提物質量濃度0.30 g·L-1、pH值4、上樣流速60 mL·h-1、上樣體積56 mL,洗脫液為80%的乙醇溶液、洗脫液pH值6、洗脫流速60 mL·h-1、洗脫體積128 mL時,經(jīng)D101型大孔樹脂純化后水晶冰菜總黃酮純化物純度達到57.67%,較粗提物純度提高了2.98倍,表明該純化工藝條件下D101型大孔樹脂對水晶冰菜總黃酮純化有顯著效果。
圖9 水晶冰菜總黃酮的動態(tài)洗脫曲線Fig.9 Dynamic elution curve of total flavonoids in Mesembryanthemum crystallinum
由表2可知,隨著質量濃度的增大,粗提物、純化物和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的抑制率均顯著上升。當質量濃度為0.35 g·L-1時,粗提物、純化物和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率分別為52.58%、62.17%和69.78%,對α-淀粉酶的抑制率分別為57.78%、54.53%和43.66%。此時,對于α-葡萄糖苷酶活性抑制效果,阿卡波糖高于純化物高于粗提物,呈顯著性差異;對于α-淀粉酶活性抑制效果,阿卡波糖與純化物無顯著性差異,但均顯著高于粗提物。由表3可知,粗提物、純化物和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性抑制的IC50值分別為0.274、0.178、0.149 g·L-1;對α-淀粉酶活性抑制的IC50值分別為0.388、0.295、0.267 g·L-1。阿卡波糖與純化物對2種酶活性的抑制效果無顯著性差異,均顯著高于粗提物。粗提物、純化物和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果均顯著高于對α-淀粉酶活性的抑制效果,這表明水晶冰菜總黃酮純化物與阿卡波糖具有相當?shù)慕堤切Ч?,且可以視為較強的α-葡萄糖苷酶抑制劑和較弱的α-淀粉酶抑制劑。
表2 水晶冰菜總黃酮及阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性抑制效果Table 2 Inhibitory effect of flavone and acarbose on α-glucosidase and α-amylase activity
表3 水晶冰菜總黃酮及阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性抑制的IC50值Table 3 Inhibitory effect of flavone and acarbose on α-glucosidase and α-amylase activity
本文研究了不同因素對水晶冰菜總黃酮大孔樹脂純化工藝的影響,結果表明,D101型大孔樹脂對水晶冰菜總黃酮有較好的吸附和解吸效果。在水晶冰菜總黃酮粗提物質量濃度0.30 g·L-1、pH值4、上樣流速60 mL·h-1、上樣體積56 mL,洗脫液為80%的乙醇溶液、洗脫液pH值6、洗脫流速60 mL·h-1、洗脫體積128 mL的條件下,經(jīng)D101型大孔樹脂純化后,水晶冰菜總黃酮純化物純度達到57.67%,較粗提物的純度提高了2.98倍。本研究同時發(fā)現(xiàn)水晶冰菜總黃酮對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶表現(xiàn)出了不同程度的抑制能力,而且純化后的抑制能力顯著增強。本研究結果為開發(fā)水晶冰菜的功能活性奠定基礎。
本研究采用D101型大孔樹脂對水晶冰菜總黃酮粗提物進行純化,原因是相比于其他類型的樹脂,該樹脂吸附和解吸附能力較好; AB-8吸附能力最強,推測其為弱極性樹脂,具有從極性溶劑中吸附非極性物質和從非極性溶劑中吸附極性物質的雙重性能[18],但是解吸率卻較低,是因為AB-8樹脂吸附的物質和樹脂的結合力強,導致洗脫困難。作為合適的純化樹脂不僅要求吸附能力強,且更需要一定的解吸能力[19]。在靜態(tài)吸附和解吸試驗中,當粗提物質量濃度為0.30 g·L-1時吸附率達到最高51.86%,此后吸附率略微下降,該結果與王廣慧等[20]研究結果一致,推測是粗提物質量濃度過低導致樹脂無法吸附完全,而質量濃度過高時會產(chǎn)生少量雜質與黃酮類化合物競爭與樹脂的吸附位點,造成吸附能力下降。當粗提物溶液pH值為4時吸附率最高,之后急劇下降,推測是因為總黃酮屬于多羥基酚類化合物,在酸性條件下以分子狀態(tài)存在,能通過范德華力吸附在樹脂上,而在堿性條件下羥基去離子化形成離子型結構,吸附能力下降[21]。當洗脫液乙醇體積分數(shù)80%時解吸率最高,推測是因為隨著乙醇體積分數(shù)的上升,極性增大,氫鍵逐漸斷裂,解吸率上升,直到氫鍵斷裂完全,解吸率不再有明顯變化[22]。在動態(tài)吸附和解吸試驗中,D101型大孔樹脂的吸附率隨上樣流速的上升而下降,原因是上樣流速變慢溶液可以和樹脂充分接觸,有效成分得到完全吸收,吸附率上升[23]。解吸過程中,洗脫流速過低或過高解吸率均有所下降,推測是因為在較低流速下洗脫液和總黃酮接觸時間長,提高了醇溶性物質流出的可能性,而在較高流速下洗脫液未能和樹脂上總黃酮類物質充分接觸就被沖洗下來。目前,尚未發(fā)現(xiàn)對水晶冰菜純化方法的報道,但袁茹楠等[24]采用AB-8大孔樹脂純化甘草渣總黃酮,純化物純度為53.43%,低于本研究結果,故認為D101型大孔樹脂適用于水晶冰菜總黃酮的純化。
通過純化處理后的水晶冰菜總黃酮不僅能夠抑制α-葡萄糖苷酶的活性,而且可以抑制α-淀粉酶的活性,對2種酶的IC50值分別為0.178、0.295 g·L-1,表現(xiàn)出了較高的降糖活性,推測水晶冰菜總黃酮在體內(nèi)可以通過多途徑多層次發(fā)揮不同程度的降糖作用[25]。目前,臨床上最常用的降血糖類藥物是阿卡波糖[26-27],而阿卡波糖和純化物對α-淀粉酶的IC50值分別為0.267、0.295 g·L-1,無顯著性差異。李萌萌等[28]報道的紅樹莓籽總黃酮對α-淀粉酶的IC50值為1.33 g·L-1,明顯低于本研究結果。水晶冰菜總黃酮作為純植物提取物與阿卡波糖有著相當?shù)慕堤腔钚?,毒副作用小,具有廣闊的應用前景。目前,相關研究尚未見關于水晶冰菜總黃酮降糖作用的報道,但李勝華等[29]發(fā)現(xiàn)蛇含委陵菜總黃酮對α-葡萄糖苷酶的活性抑制作用與本研究結果一致,但抑制能力卻低于本研究結果,表明水晶冰菜總黃酮可以作為純天然的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性抑制劑,具有開發(fā)成為天然降血糖藥物或者保健食品的潛力。本研究為水晶冰菜總黃酮開發(fā)成為天然降血糖藥物或保健食品奠定理論基礎。