白肋煙和烤煙嫁接對白肋煙碳氮代謝及硝酸鹽含量的影響

李耕，馮雨晴，趙園園，劉德水，周駿，史宏志

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南 鄭州450002；2.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司北京卷煙廠，北京 100024)

白肋煙是混合型卷煙的重要原料，其種植面積和產(chǎn)量僅次于烤煙。白肋煙是一種Yellow Burley (Yb) 基因突變體，因其葉片本身色素含量較低，導(dǎo)致光合作用下降，從而不能為葉片氮還原同化過程提供充足能量，造成葉片中的硝酸鹽大量積累[1-2]。硝酸鹽作為煙草特有亞硝胺(tobacco specific nitrosamines,TSNAs)的重要前體物，與后期煙草葉片TSNAs形成密切相關(guān)，而TSNAs是一類存在于煙葉和煙草制品中的有害化合物，對人體健康有很大危害。硝酸鹽的積累與煙草碳代謝和氮代謝密切相關(guān)，氮代謝需要依賴碳代謝提供碳源和能量，而碳代謝又需要氮代謝提供酶蛋白和光合色素，二者需要共同的還原力、三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate,ATP)和碳骨架[3]。目前，有關(guān)施氮量[4]、打頂時間[4]、氮素形態(tài)[5]和外源調(diào)控劑[6-7]對白肋煙硝酸鹽含量的影響已有較多研究，但通過嫁接的方法用氮效率顯著高于白肋煙的烤煙品種作砧木來探討對白肋煙碳氮代謝和硝酸鹽含量影響的研究比較鮮見。

嫁接是植物無性繁殖的一種栽培技術(shù)，且嫁接苗砧木和接穗中的遺傳物質(zhì)不會改變。許多研究表明，砧木可以對接穗的生長發(fā)育[8]、生理生化特性[9]、產(chǎn)量和品質(zhì)[10]以及植物抗性[11]等方面產(chǎn)生影響。王磊等[9]研究表明，強(qiáng)壯砧木與接穗嫁接后，植株葉片色素含量、光合作用、氮代謝酶活性和氮含量均高于自根苗。同時，嫁接還會影響植株呼吸、營養(yǎng)元素代謝和內(nèi)源激素含量等生理生化過程[12-13]。氮素是植物生長所必需的大量元素之一。袁亭亭等[14]研究表明,嫁接對植株氮素吸收利用效率的調(diào)控最為明顯。RUIZ等[15]研究發(fā)現(xiàn)，選擇不同氮效率的烤煙品種進(jìn)行嫁接是提高煙草氮素利用效率的一種快速而有效的方式。此外，適宜砧木嫁接可以改善接穗葉片氮代謝關(guān)鍵酶活性，提高葉片氮素同化能力[16-17]。由此可見,植株葉片的碳氮同化能力因嫁接根系改變而發(fā)生顯著變化。白肋煙和烤煙是煙草的2種類型，其氮效率和煙葉硝態(tài)氮含量差異很大，生產(chǎn)中白肋煙比烤煙施氮量高4倍之多，煙葉硝態(tài)氮含量比烤煙高10倍以上[18]。鑒于此，本試驗(yàn)以烤煙中有代表性的品種K 326和白肋煙中有代表性的品種鄂煙1號為材料進(jìn)行嫁接處理，研究嫁接對白肋煙生長發(fā)育、色素含量、光合作用及碳氮代謝能力的影響,為通過農(nóng)業(yè)措施降低和調(diào)節(jié)煙葉硝酸鹽含量提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及培育條件

試驗(yàn)在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家煙草栽培生理生化研究基地氣候室進(jìn)行。氣候室條件設(shè)置：溫度為22～28 ℃，每12 h晝夜交叉光照(白天時間段設(shè)置為8：00—20：00)，光照400 μmol·m-2·s-1。以白肋煙品種鄂煙1號和烤煙品種K 326為材料。采用漂浮育苗方式育苗，2019-09-25烤煙K 326開始育苗，為增加嫁接苗成活率，砧木要比接穗提前7 d育苗，白肋煙鄂煙1號于2019-10-02開始育苗，煙苗長至大十字期時進(jìn)行剪葉促進(jìn)煙苗生長，待煙苗長至5～6片葉(苗齡45 d左右)時開始進(jìn)行控水處理，以增強(qiáng)煙苗柔韌性，采用MS培養(yǎng)基配制營養(yǎng)液。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

2019-11-15挑選長勢均勻，大小一致的煙苗采用劈接法進(jìn)行嫁接。試驗(yàn)設(shè)置3個處理，處理1:接穗與砧木都為K 326,用“F/F”表示;處理2:接穗與砧木都為鄂煙1號,用“B/B”表示;處理3:鄂煙1號為接穗,K 326為砧木，用“B/F”表示。當(dāng)嫁接苗出現(xiàn)新生的真葉時開始將其移栽至填滿營養(yǎng)土的花盆中，1株·盆-1。移栽21 d后開始取樣測定生理指標(biāo)和常規(guī)化學(xué)成分，每個處理10棵煙，共30棵。

1.3 測定項目和方法

1.3.1 光合測定 選取各處理長勢均勻一致的煙苗，采用便攜式光合測定儀(LI-6400，美國Licor公司)測定凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間二氧化碳摩爾系數(shù)(Ci)。光合儀器設(shè)置為開放通路 (手動進(jìn)行)，紅藍(lán)光源外接光源光照度設(shè)為800 μmol·m-2·s-1，每棵煙所測葉片用外接光源照射15 min，使其光合速率達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，測定時間選擇9:00—12:00和14:00—17:00，測定部位選擇煙苗最大功能葉(從下向上，第3葉位)進(jìn)行測定。每個處理重復(fù)測定3次。

1.3.2 生物量積累測定 挑選不同處理的煙將其根、莖、葉進(jìn)行分離，稱其鮮質(zhì)量后，將其根、莖和葉片在烘箱中 105 ℃殺青20 min，60 ℃烘干，稱其干質(zhì)量后磨碎，過0.25 mm篩子，用于后續(xù)化學(xué)成分測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

釆用Excel和GraphPad Prism(V.5.01,GraphPad Software Inc.,CA USA)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和圖形的繪制，采用DPS 7.05軟件和LSD法，對不同處理間煙葉色素含量、硝酸還原酶(nitrate reductase,NR)和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)活性、蛋白質(zhì)含量、總氮、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量等指標(biāo)進(jìn)行多重比較和方差齊性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 白肋煙和烤煙嫁接對白肋煙煙葉生物量的影響

表1顯示，煙草不同砧穗組合嫁接苗生物量存在顯著差異,且3種嫁接苗根、莖、葉鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均表現(xiàn)為F/F>B/F>B/B。其中，B/F處理的根、莖、葉鮮質(zhì)量分別較B/B處理升高20.00%,20.49%和14.34%，根、莖、葉干質(zhì)量分別較B/B處理升高50.00%,22.58%和15.57%。F/F處理的根、莖、葉鮮質(zhì)量分別較B/B處理升高40.00%,26.01%和22.18%，根、莖、葉干質(zhì)量分別較B/B處理升高75.00%,51.61%和26.23%。

表1 白肋煙和烤煙嫁接對白肋煙煙葉生物量的影響Table 1 Effects of burley tobacco and flue-cured tobacco grafting on tobacco leaf biomass g

2.2 白肋煙和烤煙嫁接對白肋煙煙葉色素含量的影響

由圖1可知，砧木顯著影響了嫁接煙葉色素含量，以烤煙為砧木嫁接后，3種嫁接苗間的色素含量有明顯差異，且葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和色素總含量均表現(xiàn)為F/F>B/F>B/B。其中，與B/B處理相比，B/F處理的煙葉葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和色素總含量分別增加13.61%,14.44%，25.62%和15.45%。與B/B處理相比，F(xiàn)/F處理的煙葉葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和色素總含量分別增加20.17%，22.43%，48.38%和25.44%。白肋煙是葉色黃綠突變的煙草，色素含量較低，而以烤煙為砧木能夠顯著提升白肋煙接穗葉綠素含量，可能與上述烤煙根系生物量高，從而能吸收更多氮素有關(guān)。

2.3 白肋煙和烤煙嫁接對煙苗光合參數(shù)的影響

由圖2可知，以烤煙為砧木嫁接后，不同處理間Pn，Tr，Gs和Ci均表現(xiàn)為F/F>B/F>B/B，且B/F處理和F/F處理之間無顯著差異。其中，B/B處理煙苗Pn和Tr顯著低于F/F處理，而以烤煙K 326為砧木進(jìn)行嫁接后，B/F處理煙苗Pn和Tr分別較B/B處理增加21.89%和17.76%。表明砧木對接穗光合性能有較大影響，尤其對凈光合速率的影響最大。

2.4 白肋煙和烤煙嫁接對白肋煙煙葉總糖和還原糖含量的影響

由圖3可知，以烤煙為砧木嫁接后，3種嫁接苗間總糖和還原糖含量均表現(xiàn)為F/F>B/F>B/B，差異達(dá)顯著或極顯著水平。其中，與B/B處理相比，B/F處理的煙葉中總糖和還原糖含量分別升高21.05%和79.44%。與B/B處理相比，F(xiàn)/F處理的煙葉中總糖和還原糖含量分別升高42.66%和93.33%。因此，以烤煙為砧木能促進(jìn)白肋煙接穗碳水化合物合成，從而為煙葉硝酸鹽還原同化提供充足碳源。

圖1 白肋煙和烤煙嫁接對白肋煙煙葉色素含量的影響 Fig.1 Effects of burley tobacco and flue-cured tobacco grafting on the pigment content of tobacco leaves

圖2 白肋煙和烤煙嫁接對白肋煙煙苗光合參數(shù)的影響 Fig.2 Effects of burley tobacco and flue-cured tobacco grafting on photosynthesis parameters of tobacco seedlings

圖3 白肋煙和烤煙嫁接對白肋煙煙葉總糖和還原糖含量的影響 Fig.3 Effects of burley tobacco and flue-cured tobacco grafting on the content of total sugar and reducing sugar in tobacco leaves

2.5 白肋煙和烤煙嫁接對白肋煙煙葉氮代謝酶活性和含氮化合物含量的影響

圖4 白肋煙和烤煙嫁接對白肋煙煙葉氮代謝酶活性和含氮化合物含量的影響 Fig.4 Effect of burley tobacco and flue-cured tobacco grafting on the activities of nitrogen metabolism enzymes and the contents of nitrogen compounds of tobacco leaves

2.6 白肋煙和烤煙嫁接對白肋煙煙葉氮素積累的影響

由表2可知，3個嫁接苗氮素積累特點(diǎn)不同。以烤煙為砧木嫁接后，在根、莖中總氮含量大小分別為F/F>B/F>B/B。與B/B處理相比，B/F處理的根、莖總氮含量提高了11.02%和6.23% ，F(xiàn)/F處理的根、莖總氮含量提高了16.27%和11.53%。B/B處理的煙苗葉片總氮含量較高，較F/F處理和B/F處理分別高9.02%和2.34%，但葉片氮素積累量相對較低，這與其葉片干物質(zhì)積累量較低密切相關(guān)；而B/F處理和F/F處理的煙苗葉片總氮含量較低，但葉片氮素積累量較高，分別較B/B處理高15.92%和13.17%，這與該處理葉片干物質(zhì)積累量較高有關(guān)。說明以烤煙為砧木有利于促進(jìn)白肋煙葉片中干物質(zhì)積累。

表2 白肋煙和烤煙嫁接對白肋煙煙葉氮素積累的影響Table 2 Effects of burley tobacco and flue-cured tobacco grafting on nitrogen accumulation of tobacco leaves

3 結(jié)論與討論

采用不同砧木嫁接苗對比試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)其植株生長發(fā)育因嫁接砧木的不同而表現(xiàn)顯著差異[25]。本研究通過對F/F，B/B和B/F嫁接的對比發(fā)現(xiàn)，植株根、莖、葉鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均表現(xiàn)為F/F>B/F>B/B，表明了烤煙K 326砧木發(fā)達(dá)的根系對嫁接苗生長具有顯著促進(jìn)效果。同時，嫁接砧木還會影響植株光合特性[26]。王磊等[9]研究表明，與接穗自根嫁接苗相比，長勢較強(qiáng)砧木嫁接組合色素、光合速率和葉片總氮含量分別升高8.46%，23.13%和16.21%。不同砧木嫁接苗的差異可能與砧木根系緊密相關(guān),強(qiáng)壯根系砧木因其較強(qiáng)吸肥吸水能力導(dǎo)致植株體內(nèi)元素和水分狀況較好[27-28],從而有利于植株葉片葉綠素的合成及光合能力的提高[29]。此外,也有研究表明,嫁接顯著影響植株葉片及傷流液中內(nèi)源激素含量，進(jìn)而調(diào)控植株葉片的光合能力[30-31]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，B/B處理的煙株色素含量和光合作用顯著低于F/F處理，而以烤煙為砧木嫁接后，B/F處理的煙株色素和光合作用高于B/B處理。葉綠素與氮素具有較好的相關(guān)性，本試驗(yàn)中B/F處理的煙株根、莖、葉氮素積累量均高于B/B處理，可能因此導(dǎo)致B/F處理的煙株色素含量和光合作用高于B/B處理。此外，烤煙砧木是否改變了白肋煙接穗中的內(nèi)源激素含量,從而導(dǎo)致其色素和光合作用的變化，有待進(jìn)一步研究。