非洲豬瘟病毒特異性抗體檢測(cè)研究進(jìn)展

祁元明，陳玉梅，2，王愛萍，2

(1.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450001； 2.河南省免疫生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是發(fā)生于野豬和家豬之間的急性、熱性和高度接觸性傳染病，其病程短，致死率高，對(duì)全世界養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重威脅[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì),2018—2019年全世界共銷毀了大約3 000萬頭豬，造成高達(dá)20億美元的經(jīng)濟(jì)損失[2]。 2018-08-03農(nóng)業(yè)農(nóng)村部確認(rèn)沈陽市發(fā)生非洲豬瘟疫情，疫情范圍從東部、北部地區(qū)向西部和南部地區(qū)擴(kuò)散，隨后蔓延至全國(guó)，給中國(guó)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展。

非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)是非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)非洲豬瘟病毒屬(Asfivirus)的線性雙鏈DNA病毒，平均直徑200 nm，為20面體對(duì)稱的囊膜病毒[3]，其基因組長(zhǎng)約170～193 kb之間，可編碼包括 p72蛋白、p54蛋白、p12蛋白、pp220蛋白、pp62蛋白、p30蛋白以及血凝素等在內(nèi)的 50多種病毒結(jié)構(gòu)蛋白，這些蛋白大都與病毒吸附、毒力、細(xì)胞凋亡、宿主范圍及免疫應(yīng)答相關(guān)[4-6]。ASFV結(jié)構(gòu)復(fù)雜，擁有復(fù)雜的免疫逃逸機(jī)制，目前尚無有效的疫苗[7]。ASFV可通過軟蜱在疣豬、叢林豬和野豬之間傳播，或通過與受感染動(dòng)物直接或間接接觸的環(huán)境、病媒和動(dòng)物產(chǎn)品傳播[8-9]。目前，防治ASFV傳播的最有效手段依然是嚴(yán)格的衛(wèi)生和生物安全控制，而有效防控的第一步依賴于ASFV快速、可靠的早期診斷。

1 非洲豬瘟病毒特異性抗體檢測(cè)的意義

ASFV常用的診斷技術(shù)包括檢測(cè)和識(shí)別ASFV特異性抗原、DNA或抗體等[10]。其中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative，qPCR)，以及新型多重反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)最為常見[11]。前兩者是監(jiān)測(cè)由特急性、急性或亞急性ASFV感染動(dòng)物造成的長(zhǎng)期病毒血癥和高病毒載量的基本診斷工具[12-14]，也是ASFV早期檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。但是，由于該技術(shù)需要專門的設(shè)施和培訓(xùn)，僅限于實(shí)驗(yàn)室診斷，而不適合用于現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)診斷。ASFV特異性抗原檢測(cè)的主要方法包括病毒分離(virus isolation,VI)[15]、紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)(haemadsorption,HAD)[16]、直接熒光抗體法(direct fluorescent antibody test，DFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)[17-18]等。ELISA檢測(cè)病毒抗原成本比PCR低，適合于短時(shí)間內(nèi)對(duì)樣品的大規(guī)模篩查，然而對(duì)于亞急性和慢性病例敏感性明顯低于PCR。因此，抗原ELISA主要用于群體檢測(cè)，并輔助以其他病毒學(xué)和血清學(xué)檢測(cè)。

血清學(xué)檢測(cè)主要是指抗體檢測(cè)，常用的方法有ELISA[19]、免疫印跡試驗(yàn)(immunoblotting test,IB)、間接免疫熒光試驗(yàn)(indirect immunofluorescent assay，IFA)、間接免疫過氧化物酶試驗(yàn)(indirect immuno-peroxidase test，IPT)[20]。聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(food and agriculture organization of the United Nations，F(xiàn)AO)建議使用ELISA進(jìn)行初步篩查，另外3種方法作為確認(rèn)試驗(yàn)。GALLARDO等[21]于2015年報(bào)道，在歐洲出現(xiàn)無紅細(xì)胞吸附反應(yīng)的基因Ⅰ型ASFV弱毒株NH/68，豬感染該毒株后表現(xiàn)為慢性感染癥狀，且病豬在感染3個(gè)月后仍可以散毒，這就表明慢性感染豬會(huì)成為長(zhǎng)期的傳染源。ASFV抗體陽性測(cè)試表明，當(dāng)動(dòng)物患有持續(xù)感染或正從過去的感染中恢復(fù)時(shí)(并可能終生血清反應(yīng)陽性)，這些抗體的效價(jià)可以反映受感染動(dòng)物的生存時(shí)間。另外，方便、廉價(jià)、快速的抗體檢測(cè)可用于大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查和對(duì)于無癥狀感染/康復(fù)豬的篩查。

2 非洲豬瘟病毒特異性抗體檢測(cè)樣本類型

2.1 首選樣本

ASFV特異性抗體檢測(cè)首選樣本包括全血樣本和血清樣本。全血樣本一般使用含有抗凝劑(使用EDTA，不可用肝素)的采血管從豬的靜脈中抽取全血進(jìn)行抗體檢測(cè)。而血清樣本在采集過程中則特別注意避免產(chǎn)生溶血，因?yàn)檫@會(huì)增加ELISA檢測(cè)抗體時(shí)的假陽性率。

2.2 備選樣本

在對(duì)野豬感染ASFV情況的日常監(jiān)測(cè)中，研究人員常無法取得新鮮的血液樣本，因此嘗試使用干血斑、干燥的血液拭子、糞便、器官與組織以及唾液等其他替代樣本進(jìn)行抗體檢測(cè)。RANDRIAMPARANY等[22]于2016年報(bào)道將在野外環(huán)境下采集到的少量血液滴加到干燥的Whatman 3-MM濾紙上，風(fēng)干數(shù)小時(shí)后將濾紙放入含有干燥劑的塑料樣本袋中，此樣本即為干血斑。使用ELISA檢測(cè)干血斑發(fā)現(xiàn)其敏感性與全血或者血清樣本基本一致。CARLSON等[23]使用干燥的血液拭子樣本進(jìn)行ASFV抗體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于血液樣本其敏感性為93.1%，特異性為100%。隨后，CARLSON等[23]進(jìn)一步評(píng)估了用干燥的血液拭子檢測(cè)ASFV抗體的情況，其試驗(yàn)結(jié)果與之前研究結(jié)果一致。NIETO-PELEGRN等[24]使用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的p72蛋白和p30蛋白作為包被原，對(duì)人工感染ASFV豬的糞便樣本進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用糞便樣本和血液樣本得到的結(jié)果基本一致，但是糞便樣品中抗體穩(wěn)定性高度依賴于溫度，即溫度越低，穩(wěn)定性越好。在使用器官與組織樣本方面，選用淋巴結(jié)、脾臟、肺臟和肝臟等器官中提取的滲出物作為檢測(cè)樣本，通過IPT進(jìn)行抗體檢測(cè)，能獲得比ELISA更靈敏的結(jié)果[25]。在使用唾液樣本方面，MUR等[26]首次對(duì)比了人工感染弱毒ASFV的豬在感染后不同時(shí)間點(diǎn)的血液樣本和唾液樣本中ASFV特異抗體的含量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于感染后8～11 d血液中開始出現(xiàn)特異性抗體，唾液樣本中出現(xiàn)特異抗體的時(shí)間在感染后11～30 d，2種樣本中抗體量的變化基本一致。當(dāng)血液樣本中ASFV特異性抗體滴度低于1∶2 500時(shí)，唾液中檢測(cè)不到特異性抗體存在。GIMéNEZ-LIROLA等[27]建立了基于原核表達(dá)的p30蛋白作為包被原的檢測(cè)血液和唾液樣本中ASFV特異性抗體的間接ELISA方法，發(fā)現(xiàn)對(duì)于不同來源的血液和唾液樣本其檢測(cè)結(jié)果基本一致，同時(shí)使用該方法可在感染后8 d的唾液樣本中檢測(cè)到特異抗體。

3 非洲豬瘟病毒特異性抗體相應(yīng)檢測(cè)靶標(biāo)研究

3.1 非洲豬瘟病毒特異性抗體檢測(cè)常用靶標(biāo)

3.1.1 p72蛋白 p72蛋白是最早被證明在自然感染中能夠引發(fā)抗體產(chǎn)生的ASFV蛋白[28]。BAO等[29]對(duì)27個(gè)ASFV毒株的全基因組進(jìn)行變異性分析發(fā)現(xiàn)，p72蛋白的保守性較高，可作為穩(wěn)定的檢測(cè)靶點(diǎn)。MALLORY等[30]通過桿狀病毒表達(dá)p72蛋白片段(氨基酸位點(diǎn)20～303)制備了識(shí)別ASFV的p72蛋白單克隆抗體，為開發(fā)ASFV抗體新檢測(cè)方法提供了可能。西班牙INGENASA公司開發(fā)了基于p72蛋白的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)試劑盒及側(cè)向流層析檢測(cè)試劑盒(以下簡(jiǎn)稱商品化試劑盒)。林彥星等[31]合成p72蛋白的抗原表位優(yōu)勢(shì)肽段，并將其與牛血清白蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，建立了檢測(cè)p72蛋白抗體的量子點(diǎn)免疫層析試紙檢測(cè)方法。郭晶等[32]使用畢赤酵母表達(dá)的重組p72多表位融合蛋白作為包被抗原建立的檢測(cè)ASFV抗體間接ELISA方法特異性和敏感性良好。朱家宏[33]用抗p72蛋白的納米抗體建立的競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，敏感性為93.3%，特異性為97.1%，與商品化試劑盒的符合率達(dá)到96.3%。張蕾等[34]選用人工合成肽(包括p72蛋白)作為包被原建立的間接ELISA抗體檢測(cè)方法，敏感性為91.4%，特異性為98.1%，與商品化試劑盒的符合率達(dá)到92.9%。庚辛等[35]使用原核表達(dá)的p72蛋白建立了檢測(cè)ASFV特異性抗體的間接ELISA方法，結(jié)果顯示，該方法可以檢測(cè)出稀釋度為1∶3 200的ASFV陽性血清，試劑盒檢測(cè)敏感性為100%，特異性為98.70%，總符合率為98.91%。王彩霞等[36]以真核表達(dá)的p72蛋白作為包被抗原、以抗p72蛋白的特異性單克隆抗體作為檢測(cè)抗體建立的特異性檢測(cè)ASFV抗體阻斷ELISA方法具有較高的特異性、敏感性以及良好的重復(fù)性，最低能檢測(cè)出稀釋度1∶128的ASFV陽性血清，與商品化試劑盒的符合率達(dá)到100%。

3.1.2 p54蛋白 曹琛福等[37]用原核表達(dá)的p54蛋白作為包被原建立的競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，特異性為100%，敏感性為96.22%，與商品化試劑盒符合率達(dá)到98.13%。TESFAGABER等[38]原核表達(dá)了p54蛋白并制備了特異性單抗，建立了基于單克隆抗體的競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(cELISA)，該方法敏感性為92.5%，特異性為98.9%。

KAZAKOVA等[42]以原核表達(dá)的俄羅斯流行株Stavropol 2008的p30蛋白中部親水片段為基礎(chǔ)建立的免疫印跡抗體檢測(cè)方法，特異性為98.75%，敏感性為100%。吳競(jìng)等[43]用原核表達(dá)的p30蛋白作為包被原建立的間接ELISA檢測(cè)方法，特異性良好，對(duì)陽性豬血清靈敏度可達(dá)1∶1 600。孫燕燕等[44]使用金納米顆粒標(biāo)記原核表達(dá)的p30蛋白作為檢測(cè)探針，制備了檢測(cè)試紙，與商品化試劑盒作比對(duì)，敏感性為95.52%，特異性為92%。徐黎暉等[45]使用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了ASFV的p30蛋白，純化后將其作為包被原建立的ASFV抗體間接ELISA檢測(cè)方法，可檢測(cè)到稀釋度為1:128的ASFV陽性血清，與商品化試劑盒相比符合率為98.9%。榮明軒等[46]使用不帶組氨酸標(biāo)簽的p30蛋白建立的檢測(cè)ASFV特異性抗體的間接ELISA方法，在檢測(cè)臨床樣本時(shí)可有效消除帶有組氨酸標(biāo)簽的基因工程疫苗免疫后所造成的假陽性反應(yīng)。ZHANG等[47]針對(duì)p30蛋白制備了單克隆抗體，利用這些單克隆抗體研制了用于ASFV快速檢測(cè)的信號(hào)放大膠體金試紙條，檢出限為2.16 ng。

3.1.4 pp62蛋白 pp62蛋白作為蛋白前體，在病毒粒子成熟的過程中被蛋白酶pS273R切割為p35蛋白、p15蛋白和p8蛋白共3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白[48]。研究表明，p15蛋白是pp62蛋白產(chǎn)生抗原性的主要成熟蛋白[41]。GALLARDO等[49]建立了基于pp62重組蛋白(昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng))的ELISA檢測(cè)方法，通過檢測(cè)425份田間豬血清樣本和253份狀態(tài)不佳的田間樣本(37 ℃放置30 d)，發(fā)現(xiàn)其敏感性和特異性均優(yōu)于OIE推薦的使用易感細(xì)胞培養(yǎng)的全病毒作為包被原建立的ELISA方法。

3.1.5 pB602L蛋白 IRUSTA等[50]發(fā)現(xiàn)，使用ASFV的康復(fù)豬血清能與大腸桿菌表達(dá)的pB602L蛋白發(fā)生較強(qiáng)反應(yīng)。王鵬飛[51]用原核表達(dá)的pB602蛋白建立了間接ELISA法檢測(cè)ASFV特異性抗體，與商品化試劑盒檢測(cè)結(jié)果相比符合率為95%。

3.1.6 pK205R蛋白 鄔旭龍等[52]用原核表達(dá)的pK205R蛋白作為包被原建立的間接ELISA檢測(cè)方法，特異性良好，對(duì)陽性豬血清靈敏度可達(dá)1∶2 560，與商品化試劑盒符合率為100%。肖景景等[53]用原核系統(tǒng)表達(dá)了K205R蛋白，并將其作為抗原建立了ELISA抗體檢測(cè)方法，與商品化試劑盒符合率為98.3%。

3.1.7 pA104R蛋白 王兆貴等[54]利用原核表達(dá)的pA104R蛋白作為抗原，建立了ASFV抗體檢測(cè)間接ELISA方法，該方法的敏感性和特異性分別為97.2%和97.4%，與商品化試劑盒符合率為94.7%。

3.2 非洲豬瘟病毒檢測(cè)靶標(biāo)篩選及其應(yīng)用

不同ASFV毒株之間基因組大小不同，所編碼的開放閱讀框(open reading frame，ORF)在151～167個(gè)位點(diǎn)之間[4]。ALEJO等[48]用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)ASFV的病毒粒子進(jìn)行分析，共鑒定到68種豐度較高的蛋白質(zhì)，其中44個(gè)蛋白質(zhì)是新發(fā)現(xiàn)的，而且新發(fā)現(xiàn)的蛋白中50%左右功能未知。KOLLNBERGER等[55]率先使用康復(fù)豬血清篩選了Ba71V毒株的cDNA文庫，鑒定到14個(gè)由病毒感染所引發(fā)的能產(chǎn)生抗體反應(yīng)的病毒蛋白質(zhì)，即p30蛋白(CP204L)、p54蛋白(E183L)、p72蛋白(B646L)、A104R蛋白、p10(K78R)蛋白、F334L蛋白、K196R蛋白、NP419L蛋白、B602L蛋白、C44L蛋白、CP312R蛋白、K145R蛋白、E184L蛋白和K205R蛋白。

REIS等[56]使用感染弱毒株NH/P68后不同時(shí)間點(diǎn)采集的豬血清來評(píng)估前面提到的14個(gè)病毒蛋白中除K145R蛋白和E184L蛋白以外的剩余12個(gè)病毒蛋白所引發(fā)的IgG1、IgG2和IgM反應(yīng)強(qiáng)度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p54蛋白、pK205R蛋白、pA104R蛋白和pB602L蛋白能引發(fā)強(qiáng)的IgG應(yīng)答，使用pK205R蛋白能在感染早期敏感地檢測(cè)到IgM反應(yīng)。通過進(jìn)一步比較無癥狀感染豬和慢性感染豬對(duì)于這12個(gè)蛋白的IgG反應(yīng)差異發(fā)現(xiàn)，在慢性感染組中針對(duì)pNP419L蛋白、pCP312R蛋白、p72蛋白、pK196R蛋白和pK205R蛋白的抗體滴度顯著高于無癥狀組，而針對(duì)pA104R蛋白的抗體滴度在無癥狀感染組中更高。使用p54蛋白、pK205R蛋白、pA104R蛋白和pB602 L蛋白既能檢測(cè)到IgG反應(yīng)又能檢測(cè)到IgM。GALLARDO等[57]用原核系統(tǒng)表達(dá)的這4種蛋白建立了ELISA抗體檢測(cè)方法，研究發(fā)現(xiàn)與OIE推薦的方法相比較，用p54蛋白和pK205R蛋白和pB602L蛋白作為包被原檢測(cè)效果更好；單獨(dú)使用pA104R蛋白靈敏度與OIE推薦的方法基本一致。CAPPAI等[58]于2017年使用商品化試劑盒檢測(cè)了113份野豬的血液和肺臟樣本，發(fā)現(xiàn)該試劑盒敏感性為81.8%，特異性為95.9%。該試劑盒檢測(cè)的靶標(biāo)是針對(duì)p72蛋白的抗體，是目前在歐盟廣泛使用的試劑盒[59]。

總之，目前商品化ASFV抗體檢測(cè)試劑盒常用的檢測(cè)靶標(biāo)為p30蛋白、p62蛋白、p72蛋白等(表1)。除了上述常見靶標(biāo)，中國(guó)國(guó)內(nèi)的多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)將p35蛋白[60]、pA104R蛋白[61]、D1133L蛋白[62]、EP364R蛋白[63]和K145R蛋白[64]作為靶標(biāo)建立ASFV抗體檢測(cè)的ELISA方法，取得了敏感、特異的檢測(cè)效果。

表1 商品化非洲豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒常用檢測(cè)靶標(biāo)Table 1 The common detection targets of commercial kit of African swine fever virus antibody detection

4 非洲豬瘟病毒抗體檢測(cè)的主要檢測(cè)方法

目前，ASFV抗體檢測(cè)以血清學(xué)檢測(cè)為主，常用的方法有ELISA[19]、IB、IFA和IPT[20]。OIE推薦使用ELISA作為抗體篩選試驗(yàn)，IB、IFA、IPT作為確認(rèn)試驗(yàn)，4種檢測(cè)方法各自特點(diǎn)見表2。

表2 非洲豬瘟病毒抗體檢測(cè)4種檢測(cè)方法的比較Table 2 Comparison of 4 detective methods of detecting antibody to African swine fever virus

5 非洲豬瘟病毒抗體檢測(cè)的未來發(fā)展方向

ASFV抗體檢測(cè)主要應(yīng)用在豬群的健康監(jiān)測(cè)方面，因此更加靈敏、快速和低成本是開發(fā)新抗體檢測(cè)方法的發(fā)展方向。目前，市場(chǎng)上的實(shí)時(shí)、快速的ASFV抗體檢測(cè)產(chǎn)品主要為定性產(chǎn)品，以基于膜的金標(biāo)層析為主，近年來中國(guó)國(guó)內(nèi)也有多個(gè)課題組制備了膠體金免疫層析試紙和量子點(diǎn)免疫層析試紙，為以后現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供技術(shù)儲(chǔ)備[31,44,65]。免疫層析試紙?jiān)陟`敏、快速和低成本上具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)，但是也存在定量檢測(cè)受限和敏感性稍低的缺點(diǎn)[66]。因此，將來的研究可以在以下4個(gè)方面加以改進(jìn)：

(1)由于IgM比IgG出現(xiàn)更早，因此在抗原選擇上可以加入pK205R蛋白，再加上IgG反應(yīng)較強(qiáng)的若干個(gè)蛋白，推測(cè)可以達(dá)到更快、更靈敏的檢測(cè)效果。(2)采用更加敏感的新型納米材料如磁性納米顆粒、熒光微球、量子點(diǎn)等作為標(biāo)記物。(3)利用更加精密的試紙信號(hào)讀取設(shè)備，增加比色卡進(jìn)行粗略半定量或者配備讀數(shù)儀，對(duì)反應(yīng)曲線判讀獲得定量結(jié)果。(4) “半自動(dòng)定量”，除加樣外，其他步驟均實(shí)現(xiàn)半自動(dòng)或全自動(dòng)定量檢測(cè)。

毋庸置疑，即時(shí)、即地、精準(zhǔn)、快速、自動(dòng)化將是未來ASFV抗體檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展方向，配套的檢測(cè)儀器、設(shè)備也日漸傾向于微型化、便攜化。