Wnt/β-catenin信號通路主要成員及在昆蟲中的功能

趙特， 李瑞， 付曉政， 邱琪琪， 王夢珂， 周琳

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/河南省新型農(nóng)藥創(chuàng)制與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南省綠色 農(nóng)藥創(chuàng)制工程技術(shù)研究中心, 河南 鄭州 450002)

Wnt一詞來源于Integration1(Int-1)基因和wingless(wg)基因。1982年NUSSE等[1]對小鼠乳腺腫瘤研究時(shí)發(fā)現(xiàn)一種可以在細(xì)胞間傳遞增殖分化信號的蛋白，并命名為Int-1，該基因的異常激活會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生；隨后發(fā)現(xiàn)Int-1基因就是果蠅中的無翅基因[2]，因而統(tǒng)一命名為Wnt。Wnt是一類分泌性糖蛋白，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、遷移、極性化和不對稱分裂。由Wnt配體蛋白激活的信號通路主要有3條：(1)Wnt/β-catenin信號通路(Canonical Wnt/β-catenin Pathway)；(2)平面細(xì)胞極性通路(Planar Cell Polarity Pathway)；(3)Wnt/Ca2+通路。目前對Wnt/β-catenin通路研究比較多，它是一個(gè)復(fù)雜的蛋白作用網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，各種蛋白質(zhì)之間彼此聯(lián)系、相互制約，共同調(diào)控多種生命過程。本文就Wnt/β-catenin信號通路的主要成員、作用機(jī)制及其昆蟲中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并對其在未來的研究方向提出展望，以期為Wnt信號通路功能的拓展研究提供指引。

1 Wnt/β-catenin信號通路的主要成員

1.1 受體和配體

Wnt蛋白作為Wnt信號通路的配體，通過與膜表面受體結(jié)合而發(fā)揮作用，其在進(jìn)化上高度保守，目前在哺乳動(dòng)物中已被發(fā)現(xiàn)19種，大約可以分為12個(gè)亞家族。Wnt蛋白由350～400個(gè)氨基酸組成，含一段疏水的信號肽，富含半胱氨酸殘基，這些半胱氨酸殘基之間可以形成二硫鍵，指揮著Wnt蛋白的正確折疊和運(yùn)輸[3]。Wnt蛋白是一類分泌型糖蛋白，具有分泌型生長因子的特點(diǎn)。Wnt蛋白被分泌后，既可與自身細(xì)胞的膜受體結(jié)合發(fā)揮自分泌調(diào)節(jié)作用，也可與鄰近細(xì)胞的膜受體結(jié)合發(fā)揮旁分泌作用。由于其脂質(zhì)化修飾，Wnt蛋白分子的溶解性并不強(qiáng)，雖然其近距離作用可以通過擴(kuò)散和旁分泌來實(shí)現(xiàn)，但其長距離作用需要依賴其他分子協(xié)助。N-糖基化和棕櫚?；荳nt蛋白2種重要的修飾方式，對Wnt的分泌和行使正常功能都十分重要，例如小鼠Wnt3a的糖基化修飾對Wnt蛋白的分泌是必不可少的[4]，位于N端第77位半胱氨酸(C77)棕櫚?；娜笔в绊懫浠钚訹5]，第209位絲氨酸(S209)棕櫚酰化的缺失導(dǎo)致Wnt蛋白滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)無法正常分泌[6]。

Wnt蛋白受體主要有2類：Fzd(Frizzled)和輔助受體LRP5/6(Low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6)。Fzd受體是一類7次跨膜的蛋白，結(jié)構(gòu)上與G蛋白偶聯(lián)受體相似，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)10個(gè)成員，并編號至Fzd10(Fzd1、Fzd2、Fzd3、Fzd4、Fzd5、Fzd6、Fzd7、Fzd8、Fzd9、Fzd10)。Fzd胞外N端是高度保守的富含半胱氨酸的配體結(jié)合區(qū)稱之為CRD(Cystine Rich Domain)，能與Wnt蛋白結(jié)合[7]。胞內(nèi)C端是同樣保守的KTXXXW motif結(jié)構(gòu)域，能夠作用于蓬亂蛋白Dvl，通過將胞外信號傳遞到Dvl進(jìn)而阻斷β-catenin的降解調(diào)節(jié)靶標(biāo)基因的表達(dá)[8-10]。LRP5/6是一種單次跨膜的輔助受體，屬于低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LDL-receptor-related protein)，其胞內(nèi)區(qū)域大約含有200個(gè)氨基酸，其中包含5個(gè)PPPS/TPxS/T模體，可與Axin和GSK-3等蛋白相互作用[11-12]。胞外區(qū)由表皮生長因子結(jié)構(gòu)域(Epidermal Growth Factor Like，EGF)和低密度脂蛋白受體(Low Density Lipoprotein Receptor，LDLR)結(jié)構(gòu)域組成，其中EGF為Wnt的結(jié)合位點(diǎn)[13]。當(dāng)有Wnt信號存在時(shí)，Wnt與Fzd和LRP5/6結(jié)合并相互作用，三者形成復(fù)合物并將信號從胞外傳入胞內(nèi)。

1.2 β-catenin

β-catenin是Wnt信號通路向細(xì)胞核內(nèi)傳遞過程中的重要信號分子，Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵就是胞漿中是否存在穩(wěn)定的β-catenin。β-catenin最開始是作為粘合連接(Adhesion Junction)的一員被發(fā)現(xiàn)，而后發(fā)現(xiàn)是果蠅中Armadillo蛋白的同源物，并且是Wnt信號通路的核心成員[14]。β-catenin屬于犰狳家族蛋白，由位于染色體3p21-22的CTNNbl基因編碼，其N末端有130個(gè)氨基酸，富含Ser、Thr位點(diǎn)，調(diào)控分子的穩(wěn)定性；C末端由100個(gè)氨基酸組成，負(fù)責(zé)激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，能夠結(jié)合一系列通用的轉(zhuǎn)錄輔助因子如組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶、染色質(zhì)重塑因子等促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的開始和延伸；中間是由550個(gè)氨基酸組成的中間連接臂重復(fù)區(qū)，其分成12個(gè)Arm重復(fù)區(qū)(R1～R12)，每個(gè)重復(fù)區(qū)含有3個(gè)螺旋，12個(gè)重復(fù)區(qū)形成一個(gè)棒狀的超螺旋結(jié)構(gòu)，能避免蛋白水解[15]。當(dāng)沒有Wnt配體時(shí)，Wnt/β-catenin信號通路處于關(guān)閉的狀態(tài)，β-catenin N末端的4個(gè)Ser、Thr位點(diǎn)會(huì)被由Axin、APC、GSK-3和CK1等組成的壞復(fù)合物磷酸化，進(jìn)而在E3泛素化酶的作用下被泛素化標(biāo)記，最終被蛋白酶體識別并降解。

1.3 Axin和APC

Axin和APC是Wnt信號通路2個(gè)重要的負(fù)調(diào)控因子。作為破壞復(fù)合物的支架蛋白，Axin是非折疊蛋白，沒有固定的三級結(jié)構(gòu)，含有與Wnt信號途徑多個(gè)成員相互結(jié)合的功能區(qū)域。其N末端為G蛋白信號肽調(diào)控因子(RGS)結(jié)構(gòu)域，也是APC與Axin的結(jié)合位點(diǎn)；C末端是Axin形成同源寡聚體的區(qū)域，也叫DIX結(jié)構(gòu)域(Dishevelled/Axin Homologous Domain)；中間為GSK-3、β-catenin和CK1的結(jié)合區(qū)域。Axin的這些結(jié)構(gòu)域?qū)φ{(diào)節(jié)β-catenin水平是至關(guān)重要的。例如APC需要與Axin的RGS位點(diǎn)結(jié)合才能促進(jìn)GSK-3對β-catenin的磷酸化[14]；若DIX結(jié)構(gòu)域缺失，即使Axin能夠結(jié)合GSK-3和β-catenin，也不能下調(diào)β-catenin的水平[16]。Axin除了作為破壞復(fù)合物的支架蛋白下調(diào)β-catenin的水平外，還存在一個(gè)與此獨(dú)立的機(jī)制下調(diào)β-catenin：Axin具有核輸出信號序列NES(Nuclear Export Sequenc)和核定位序列NLS(Nuclear Localization Sequence)，能夠作為一種分子伴侶，通過核質(zhì)穿梭協(xié)同β-catenin在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中的分布，促進(jìn)β-catenin定位于細(xì)胞質(zhì)中[17]。

APC是一個(gè)相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)，通過與Axin和GSK-3等結(jié)合形成功能復(fù)合體來調(diào)節(jié)胞質(zhì)中β-catenin的蛋白水平[18]。APC中含有多個(gè)能與β-catenin結(jié)合的獨(dú)立保守的結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域含有15～20個(gè)氨基酸(20-mer)[19]，此外這些結(jié)構(gòu)域之間還有2～3個(gè)大約16個(gè)氨基酸的Axin結(jié)合結(jié)構(gòu)域：絲氨酸-丙氨酸-蛋氨酸-脯氨酸Ser-Ala-Met-Pro(SAMP)重復(fù)序列。GSK-3或CK1對β-catenin磷酸化后緊接著會(huì)對APC的20-mer磷酸化，被磷酸化的20-mer會(huì)與β-catenin結(jié)合，而APC和Axin與β-catenin的結(jié)合區(qū)域存在重疊，APC對β-catenin的親和力更高，會(huì)替代Axin與β-catenin結(jié)合，從而釋放出Axin與新的未被磷酸化的β-catenin結(jié)合[18]。

1.4 GSK-3和CK1

GSK-3(果蠅中為Shaggy)和CK1是Wnt/β-catenin信號通路2個(gè)重要的磷酸化激酶，根據(jù)磷酸化的底物不同發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用。

GSK-3是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，具有α螺旋的C端和β折疊的N端2個(gè)結(jié)構(gòu)域，其結(jié)合口袋ATP(AMP-NP的同系物)位于2個(gè)結(jié)構(gòu)域之間，該催化區(qū)域主要由Lys85、Thr138、Asp133和Gin185等氨基酸殘基組成[20]。在Wnt/β-catenin信號通路中，GSK-3不僅可以磷酸化β-catenin促進(jìn)其被降解從而發(fā)揮負(fù)調(diào)控的作用，也可以通過磷酸化LRP6發(fā)揮正向調(diào)控因子的作用。當(dāng)有Wnt信號存在時(shí)，Dvl與Fzd結(jié)合并招募Axin/GSK-3到細(xì)胞膜上與LRP6結(jié)合，進(jìn)而磷酸化LRP6上的PPPSPxS位點(diǎn)，LRP6一旦被磷酸化后將招募更多的Axin/GSK-3到細(xì)胞膜上參與該位點(diǎn)的磷酸化，阻止了GSK-3對β-catenin的磷酸化，使得β-catenin能在胞質(zhì)中積累而不被分解，達(dá)到正向調(diào)控的作用[11-12,21]。此外，Dvl或Axin也可能將CK1招募到細(xì)胞膜上參與磷酸化LRP6[11,22]。

CK1因其對酪蛋白的磷酸化而得名，是最早被分離出絲氨酸/蘇氨酸蛋白活性之一的蛋白激酶，廣泛存在于真核生物中，目前在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)7種亞型，包括α、β、γ1、γ2、γ3、δ和ε。這些亞型的N端均含有一個(gè)約為290個(gè)氨基酸殘基組成的高度保守的激酶結(jié)構(gòu)域，C端序列差異較大，根據(jù)不同成員亞細(xì)胞定位及酶活性調(diào)節(jié)不同長度從40到180個(gè)氨基酸不等。CK1可作為負(fù)調(diào)控因子直接參與β-catenin的磷酸化反應(yīng)，當(dāng)沒有Wnt信號時(shí)，CK1會(huì)對β-catenin的氨基端第45位絲氨酸(Ser45)磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致第33位絲氨酸(Ser33)、第37位絲氨酸(Ser37)和第41位蘇氨酸(Thr41)被GSK-3磷酸化[18]，其中S33/S37位點(diǎn)被磷酸化后會(huì)被E3泛素連接酶β-Trcp識別并與之結(jié)合，泛素化后的β-catenin在蛋白酶體的作用下被降解[23]。CK1也可作為正向調(diào)控因子參與LRP6的磷酸化，抑制破壞復(fù)合物的形成[22]。另外，CK1和GSK-3也對Axin和APC磷酸化，加強(qiáng)他們與β-catenin之間的相互作用[24]。Axin被磷酸化后會(huì)增強(qiáng)它與β-catenin的親和力，有助于促進(jìn)β-catenin的降解。APC被磷酸化后會(huì)與Axin競爭性的結(jié)合到β-catenin上，這將導(dǎo)致磷酸化的β-catenin從復(fù)合體中釋放出來并進(jìn)行下一步的泛素化。

1.5 Dvl

多功能支架蛋白Dvl(在果蠅中為Dsh)是機(jī)體組織細(xì)胞中廣泛存在的包漿蛋白，對Wnt/β-catenin信號通路在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)到至關(guān)重要，由670個(gè)氨基酸殘基組成，含有3個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域：N端有與部分Axin蛋白相同的51個(gè)氨基酸DIX(Dishevelled, Axin)區(qū)；中間為PDZ(Postsynaptic Density 95, Disc Large, Zona Occludens-1)區(qū)，是由80～90個(gè)氨基酸組成的存在于PSD-95和ZO-1等50多種蛋白內(nèi)的基本序列；C端為DEP(Dishevelled, Egl-10, Pleckstrin)區(qū)，是能夠結(jié)合Dvl，EGL10以及Pleekstrin蛋白的部位[25]。另外，在PDZ的前后還各有一個(gè)小的結(jié)構(gòu)域分別稱為B(Basic Domain)和PR(Proline Rich Domain)[26]。Fzd在胞內(nèi)的C端可與Dvl的PDZ和DEP相互作用并將其招募到細(xì)胞膜上[27]，而Dvl的DIX區(qū)域可與Axin的DIX區(qū)域結(jié)合將其招募到細(xì)胞膜上形成Dvl-Axin多聚體，繼而與Axin相互作用的CK1、GSK-3等也定位到細(xì)胞膜上，同時(shí)促進(jìn)Wnt-Fz-LRP5/6復(fù)合物的形成[28]。此外,Dvl上也存在NES和NLS，可以進(jìn)出入細(xì)胞核中，在核內(nèi)Dvl能與β-catenin相互作用促進(jìn)形成穩(wěn)定的β-catenin/TCF復(fù)合物，激活靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄[25]。

1.6 TCF/LEF

TCF/LEF家族是調(diào)控Wnt信號通路下游靶基因的重要的轉(zhuǎn)錄因子(果蠅中為Pangolin)，其家族成員包括TCF1(TCF7)、TCF3(TCF7L1)、TCF4(TCF7L2)和LEF1(TCF7L3)，在結(jié)構(gòu)上有多個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，通過與DNA或蛋白質(zhì)結(jié)合調(diào)控靶基因的表達(dá)。DBD是一個(gè)可以與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，由高度保守的HMG框和一段富含堿性氨基酸的Basic tail組成。其中，HMG結(jié)構(gòu)可以介導(dǎo)TCF/LEF識別特定的靶標(biāo)序列，另外還能使靶標(biāo)序列DNA發(fā)生折疊，這有助于其他轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。在Wnt信號通路關(guān)閉的狀態(tài)下，TCF/LEF通過DBD結(jié)構(gòu)域結(jié)合在WRE序列上并與一些轉(zhuǎn)錄抑制因子Groucho家族成員形成復(fù)合物合，抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[29]。TCF/LEF與β-catenin的結(jié)合位點(diǎn)位于N端，在Wnt信號通路開啟的狀態(tài)下，β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核通過取代轉(zhuǎn)錄抑制因子與TCF/LEF結(jié)合并招募一系列的轉(zhuǎn)錄輔助因子，開啟下游基因的轉(zhuǎn)錄。目前，多種轉(zhuǎn)錄輔助因子的作用已經(jīng)被證明，例如CBP(CREBBP)和p300可以結(jié)合β-catenin的C端從而乙?；M蛋白，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄[30]，而Bcl9可以與β-catenin的N端結(jié)合形成復(fù)合物，這對于絕大部分下游基因的轉(zhuǎn)錄是必要的[31]。

2 Wnt/β-catenin信號通路主要成員在昆蟲中的功能研究進(jìn)展

Wnt/β-catenin信號通路在昆蟲進(jìn)化過程中高度保守，參與昆蟲附肢的發(fā)育、體節(jié)的分化、翅的形成等多個(gè)生理過程，通路中任何成員都有十分重要的作用。以果蠅為例，目前在果蠅中發(fā)現(xiàn)了7種Wnt配體，即Wg、Dwnt2、Dwnt3、Dwnt4、Dwnt6、WntD/8和Wnt10。Wg控制果蠅胚胎體節(jié)的極性，并涉及氣管、中胚層、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、眼睛、附肢、翅等多個(gè)器官的發(fā)育[2,32-34]。Dwnt2(Wnt7)參與果蠅雄性生殖道的發(fā)育，Dwnt2突變體由于睪丸鞘內(nèi)肌肉細(xì)胞畸形而顯示出異常的睪丸形態(tài)，在雌性中異位表達(dá)Dwnt2可以在卵巢中誘導(dǎo)雄性特異性色素細(xì)胞，成年后的突變體不僅不育，而且表現(xiàn)出翅發(fā)育不健全[35-36]。此外，Dwnt2還參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，Dwnt2的突變會(huì)改變肌神經(jīng)接點(diǎn)突觸前運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元形態(tài)和突觸前蛋白的分布[37]。Dwnt3(Wnt5)參與果蠅唾液腺的移動(dòng)[38]，并在腹神經(jīng)索中通過與受體Derailed/Ryk結(jié)合以確保在軸突引導(dǎo)過程中正確形成連合軸突束[39]。Dwnt4(Wnt9)的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致果蠅體節(jié)分割產(chǎn)生缺陷[40]，而Dwnt4的缺失會(huì)導(dǎo)致果蠅心臟發(fā)育不健全[41]。另外，Dwnt4對于視網(wǎng)膜軸突沿著背腹軸發(fā)育具有重要的指導(dǎo)作用[42]。Dwnt6(Wnt6)在成蟲盤中的表達(dá)模式與Wg相似，它的突變導(dǎo)致果蠅缺少觸須，但對翅的發(fā)育沒有影響[43]。WntD/8涉及果蠅背腹軸的形成和先天性免疫應(yīng)答[44]。Wnt10在果蠅胚胎發(fā)育期間的多個(gè)組織中都有表達(dá)，包括內(nèi)臟、頭部、體壁中胚層和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等[45]，但對于Wnt10在這些組織中的功能還有待進(jìn)一步的研究。在果蠅中總共發(fā)現(xiàn)了4種Fzd受體：Fzd1、Fzd2、Fzd3和Fzd4。Fzd1的表達(dá)受到Engrailed轉(zhuǎn)錄因子的抑制。在胚胎表皮上提高Fzd1的表達(dá)有助于Wg的捕獲，提高Wg的穩(wěn)定性避免被降解。Fzd1的突變會(huì)導(dǎo)致果蠅復(fù)眼中的平面極性被破壞[46]。Fzd2的表達(dá)受到Wg信號的抑制，另外，F(xiàn)zd2也能保護(hù)Wg免受降解，并擴(kuò)大Wg在翅成蟲盤上的作用范圍[47]。Fzd3的表達(dá)模式與Fzd2正好相反，它在轉(zhuǎn)錄上通過Wg信號被上調(diào)。研究顯示Fzd3對果蠅的生存不是必要的，F(xiàn)zd3突變后的果蠅幾乎沒有形態(tài)缺陷，但是Fzd3的缺失可以抑制Wg等位基因突變產(chǎn)生的影響，在Wg等位基因突變體中Fzd3可能起著削弱Wg信號的作用[48]。有研究認(rèn)為，F(xiàn)zd3可能和Fzd1及Fzd2通過協(xié)同作用在成蟲盤中轉(zhuǎn)換或運(yùn)輸Wg信號[49]。在胚胎發(fā)育過程中Fzd4在中胚層，腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中以動(dòng)態(tài)模式表達(dá)[44]，對于其功能有待進(jìn)一步研究。

在果蠅中總共發(fā)現(xiàn)2種APC，即APC1和APC2，其在通過Wnt信號通路調(diào)節(jié)胚胎表皮和成蟲盤發(fā)育上存在功能的冗余[50]。APC1和APC2同時(shí)沉默會(huì)導(dǎo)致整個(gè)發(fā)育過程中Armadillo在核內(nèi)積累和Wg轉(zhuǎn)導(dǎo)的組成性激活，表明APC1和APC2的聯(lián)合活性可以嚴(yán)格調(diào)控Armadillo的轉(zhuǎn)錄激活[51]。2種APC還參與幼蟲大腦的發(fā)育。研究顯示，APC1和APC2在大腦中的表達(dá)區(qū)域完全不同，APC1主要在中心體和微管中表達(dá)，APC2主要在大腦皮層中表達(dá)，然而二者在大腦中的功能仍然存在重疊。單個(gè)APC突變對大腦發(fā)育幾乎沒有影響，但是二者都突變會(huì)嚴(yán)重減少神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量，并導(dǎo)致視神經(jīng)葉發(fā)育中的嚴(yán)重缺陷[52-53]。在果蠅中還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)APC的同源物E-APC，其轉(zhuǎn)錄本在果蠅的所有發(fā)育階段中普遍存在，可以與Armadillo 結(jié)合在上皮細(xì)胞中起黏附連接的作用，也可以與Shaggy、Axin等結(jié)合影響Armadillo的穩(wěn)定性；E-APC的突變產(chǎn)生的胚胎表型與Shaggy產(chǎn)生的表型相似，即胚胎顯示出高度異常的齒狀結(jié)構(gòu)[54]。另外，E-APC還是一種高機(jī)動(dòng)蛋白，可以在不同的亞細(xì)胞位點(diǎn)之間組成性地穿梭[55]。Shaggy影響果蠅的生物鐘，Shaggy的過表達(dá)會(huì)縮短果蠅的生物鐘周期，而降低Shaggy的活性會(huì)延長周期[56]。Shaggy還調(diào)控運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的微管細(xì)胞骨架動(dòng)力系統(tǒng)，并負(fù)調(diào)控NMJ(neuromuscular junction)的增長[57]。Shaggy的突變還會(huì)導(dǎo)致果蠅有絲分裂中期延長[58]，并且無法完成減數(shù)分裂[59]。Axin作為Wnt信號通路的負(fù)調(diào)控因子，其突變導(dǎo)致Armadillo和Wg的一個(gè)靶標(biāo)基因Distalless的積累[60]，并導(dǎo)致胚胎表皮所有的齒狀結(jié)構(gòu)消失，進(jìn)而表現(xiàn)出光滑的表皮結(jié)構(gòu)，這與Wg的過表達(dá)表型相似；而Axin的過表達(dá)產(chǎn)生的表型與Wg的缺失產(chǎn)生的表型相似，即胚胎表皮覆滿齒狀結(jié)構(gòu)[61]。Dsh的突變會(huì)導(dǎo)致大部分果蠅在老熟幼蟲或化蛹早期死亡，只有少部分會(huì)發(fā)育為成蟲，這些成蟲表現(xiàn)出缺少觸角和腿部畸形[62]。Pangolin的缺失會(huì)導(dǎo)致Wg信號通路靶標(biāo)基因Distalless和Vestigial的表達(dá)量降低[63]。

除果蠅外，Wnt信號通路在其他昆蟲中也得到了一定的研究。在赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)中，Wnt1影響胚胎期足的發(fā)育及幼蟲期足的再生能力[64-65]，對蛹期翅的發(fā)育以及羽化十分重要[66]；Wnt8的缺失會(huì)造成體節(jié)發(fā)育缺陷，Wnt8和Wnt1同時(shí)沉默會(huì)加強(qiáng)這種突變表型[67]；Fzd1的缺失導(dǎo)致足發(fā)育缺陷，F(xiàn)zd1和Fzd4同時(shí)沉默會(huì)增強(qiáng)足的缺陷表型并使后腸發(fā)育不完全，F(xiàn)zd1和Fzd2同時(shí)沉默導(dǎo)致體軸伸長缺陷[68]；Axin的沉默會(huì)導(dǎo)致胚胎期間頭部、胸部和腹部發(fā)育受阻[69]；GSK-3的沉默導(dǎo)致胚胎中糖原水平升高，發(fā)育提前終止，雌性成蟲不孕或產(chǎn)卵量大大降低[70]。在家蠶(Bombyxmori)中，Wnt1基因的缺失導(dǎo)致胚胎無法孵化，并且表現(xiàn)出體節(jié)分割和色素沉積異常[71]；GSK-3的磷酸化與家蠶的滯育過程有關(guān)[72]。在馬尾松毛蟲(Dendrolimuspunctatus)中，Wnt1的突變導(dǎo)致胚胎高致死率，并表現(xiàn)出胸足和腹足的缺失以及頭部發(fā)育畸形[73]。在美國白蛾(Hyphantriacunea)中，Wnt1影響體節(jié)分化和附肢形成，Wnt1基因的缺失會(huì)導(dǎo)致頭部畸形、體節(jié)缺失和附肢缺失，并使美國白蛾在胚胎期死亡[74]。在棉鈴蟲中，Wnt1與蛹的滯育有關(guān)[75]。在乳草長蝽(Oncopeltusfasciatus)中，Wg的沉默導(dǎo)致體節(jié)分割和眼睛的發(fā)育產(chǎn)生缺陷[76]。在雙斑蟋蟀(Gryllusbimaculatus)中，Wg參與調(diào)節(jié)附肢的再生[77]；Armadillo的沉默導(dǎo)致腹節(jié)部分節(jié)數(shù)缺失[78]。在白背飛虱中，Wg參與翅的發(fā)育和生長，Wg的沉默會(huì)導(dǎo)致翅明顯變短并表現(xiàn)畸形[79]。Wnt信號通路還與其他信號通路存在交互作用，共同調(diào)控昆蟲的發(fā)育。例如在美洲大蠊(Periplanetaamericana)中，Wnt信號通路與caudal和Notch信號通路共同在調(diào)節(jié)昆蟲發(fā)育和體節(jié)分割中發(fā)揮作用[80]。在果蠅中，Wnt與Hh(Hedgehog)信號通路共同調(diào)控成蟲腸道干細(xì)胞的自我更新、增殖和分化[81]。

3 Wnt/β-catenin信號通路的作用機(jī)制

Wnt/β-catenin信號途徑通常的作用方式分為2種。當(dāng)機(jī)體中沒有Wnt信號或Wnt受體受阻時(shí)，胞質(zhì)中游離的β-catenin將被由APC、Axin、CK1和GSK-3組成的破壞復(fù)合物結(jié)合，之后CK1對β-catenin的氨基端Ser45磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致Ser33、Ser37和Thr41被GSK-3磷酸化，S33/S37位點(diǎn)被磷酸化后會(huì)被E3泛素連接酶β-Trcp識別并與之結(jié)合，泛素化后的β-catenin在蛋白酶體的作用下被降解，因此無法進(jìn)入細(xì)胞核中。而此時(shí)在細(xì)胞核中，LEF/TCF轉(zhuǎn)錄因子家族與轉(zhuǎn)錄抑制因子Groucho結(jié)合形成復(fù)合蛋白結(jié)構(gòu)，無法作用于下游靶基因，細(xì)胞表面上處于一個(gè)相對靜止的狀態(tài)(圖1-A)[82-83]。當(dāng)有Wnt信號存在時(shí)，Wnt與細(xì)胞膜表面的Fzd受體以及輔助受體LRP5/6結(jié)合形成復(fù)合物，激活胞內(nèi)的Dvl蛋白并招募到細(xì)胞膜上，F(xiàn)zd的C端與Dvl蛋白的PDZ和DEP區(qū)域相結(jié)合并使其磷酸化，而Dvl的DIX通過與Axin的DIX區(qū)域相互作用從而將Axin招募到細(xì)胞膜上，同時(shí)與Axin結(jié)合的激酶GSK-3和CK1也轉(zhuǎn)移到膜上并磷酸化LRP5/6 C端的PPPSPxS位點(diǎn)，阻止了GSK-3對β-catenin的磷酸化，破壞復(fù)合體也無法形成。因此β-catenin不能正常降解而在胞質(zhì)中異常聚集。大量游離的β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核破壞LEF/TCF家族與轉(zhuǎn)錄抑制因子Groucho形成的復(fù)合蛋白，并與LEF/TCF家族的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，同時(shí)招募轉(zhuǎn)錄輔助因子，從而激活轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)一步激活下游靶基因的表達(dá)(圖1-B)[82-83]。

圖1 Wnt/β-catenin信號通路作用機(jī)制Fig.1 Wnt/β-catenin signaling mechanism

4 展望

Wnt/β-catenin信號通路在生物進(jìn)化過程中高度保守參與調(diào)控多個(gè)發(fā)育過程，在昆蟲早期發(fā)育中參與胚層建立、器官發(fā)育、體節(jié)分割和背腹軸的形成等多種生物學(xué)過程，并對細(xì)胞的增殖、分化、遷移、極性化和凋亡起到十分重要的作用，是分子生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)的一大研究熱點(diǎn)。目前，對Wnt信號通路研究取得了一定的成果，但這些成果卻引發(fā)了更多有待科學(xué)家解決的問題：Wnt信號通路調(diào)控著大量與生長代謝相關(guān)的基因，只有其中少部分基因被發(fā)現(xiàn)并研究，具體還有哪些以及這些基因在生長發(fā)育等過程中分別發(fā)揮何等功能和作用有待探索；信號通路中各成員之間的作用機(jī)制并未完全闡明，并且可能還有未發(fā)現(xiàn)的相關(guān)因子在其中產(chǎn)生作用，對該途徑的組成、功能以及功能如何實(shí)現(xiàn)等一系列問題的探索還需要漫長的時(shí)間。

此外，Wnt信號通路是一個(gè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，除了本身對生物有重要的調(diào)控作用外，還與Notch、Dpp、Hh、成纖維細(xì)胞生長因子(Fibroblast Growth Factor，F(xiàn)GF)、轉(zhuǎn)化生長因子β和骨形成蛋白(Transfo-rming Growth Factor β/Bone Morphogenetic Protein，TGFβ/BMP)、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endo-theliurn Growth Factor，VEGF)等多條信號通路存在交互作用，構(gòu)成紛繁復(fù)雜的調(diào)控體系。例如Notch信號通路可以抑制神經(jīng)和肌肉前體的發(fā)育，而這種抑制受到Wnt信號的對抗；Wnt信號通路中的Dvl蛋白可以結(jié)合到Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的羧基端上，通過穩(wěn)定Notch非活化的構(gòu)象來阻斷Notch信號通路；生物體背腹軸極性的產(chǎn)生就是由于Wnt于Hh信號通路的相互對抗；FGF可以通過誘導(dǎo)E-鈣黏蛋白水平的下調(diào)，來調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)中自由存在的β-catenin的量，并以此來影響Wnt信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[84]。Wnt信號通路與其他信號通路的交互方式復(fù)雜多樣，人們對其研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，交互的具體過程和機(jī)制的認(rèn)識還不夠充分，需要更深入的研究，才能全面理解生物體內(nèi)多種信號通路如何實(shí)現(xiàn)有效分工、各司其職, 從而保證細(xì)胞、組織和生物體的正常生命活動(dòng)。這對于研究昆蟲在Wnt信號傳導(dǎo)通路中的生長發(fā)育、尋找發(fā)育調(diào)控中的重要分子及藥物標(biāo)靶等具有重要意義。