• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    甘薯貯藏根淀粉代謝相關(guān)基因表達(dá)分析

    2019-12-24 01:11秦楨李愛賢侯夫云董順旭王慶美
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年11期
    關(guān)鍵詞:甘薯

    秦楨 李愛賢 侯夫云 董順旭 王慶美

    摘要:甘薯淀粉含量高,是一種重要的糧食作物和工業(yè)原料。然而,甘薯貯藏根發(fā)育過(guò)程中淀粉代謝途徑相關(guān)基因晝夜周期變化規(guī)律尚不完全清楚。為探討甘薯貯藏根發(fā)育過(guò)程中淀粉代謝相關(guān)基因晝夜周期變化規(guī)律,本研究以4個(gè)不同淀粉含量的甘薯品種為試驗(yàn)材料,采用qRT-PCR法對(duì)淀粉代謝相關(guān)基因全天的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明:IbAGPa、IbSS、IbGBSSⅠ、IbSBEⅠ、IbSBEⅡ、Ibα-amylase基因的表達(dá)均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。淀粉合成相關(guān)基因(IbAGPa、IbSS、IbGBSSⅠ、IbSBEⅠ、IbSBEⅡ)的表達(dá)高峰出現(xiàn)在12時(shí)到15時(shí),淀粉降解相關(guān)基因(Ibα-amylase)的表達(dá)高峰出現(xiàn)在15時(shí)之后。在不同淀粉含量的甘薯品種中,淀粉代謝相關(guān)基因的表達(dá)在整個(gè)晝夜周期內(nèi)都發(fā)生周期性的變化,且表達(dá)趨勢(shì)相似。本研究進(jìn)一步豐富了我們對(duì)甘薯貯藏根淀粉代謝調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

    關(guān)鍵詞:甘薯;貯藏根;淀粉代謝相關(guān)基因;qRT-PCR;晝夜周期變化

    中圖分類號(hào):S531:S786文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A文章編號(hào):1001-4942(2019)11-0008-05

    Expression of Starch Metabolism Related

    Genes in Storage Roots of Sweet Potato

    Qin Zhen, Li Aixian*, Hou Fuyun, Dong Shuxu, Wang Qingmei

    (Crop Research Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences/Scientific Observing and

    Experimental Station of Tuber and Root Crops in Huang-Huai-Hai Region, Ministry of Agriculture, Jinan 250100, China)

    Abstract Sweet potato is an important food crop and industrial raw material because of its high starch content. In order to explore the diurnal cycle of genes related to starch metabolism pathway in the development of storage roots of sweet potato, four cultivars with different starch content were selected as experimental materials. The expression patterns of starch metabolism related genes were analyzed by qRT-PCR. The results showed that genes of IbAGPa, IbSS, IbGBSSⅠ, IbSBEⅠ, IbSBEⅢ and Ibα-amylase had an increased expression followed by a decreasing trend. The expression peak of the genes related to starch synthesis (IbAGPa, IbSS, IbGBSSⅠ, IbSBEⅠ and IbSBEⅡ) appeared at 12 noon to 3 pm, and the expression peak of the starch degradation-related gene (Ibα-amylase) appeared after 3 pm. The results showed that the expression of starch metabolism related genes changed periodically throughout the diurnal cycle and that of the expression was similar in sweet potato cultivars with different starch contents. This study further enriched our understanding of the regulation mechanism of starch metabolism in the storage roots of sweet potato.

    Keywords Sweet potato; Storage roots; Genes related to starch metabolism; qRT-PCR; Diurnal cycle change

    甘薯是重要的農(nóng)作物和工業(yè)原料。甘薯薯塊中淀粉含量高,主要由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成[1]。在高等植物中,淀粉的生物合成發(fā)生在質(zhì)體中,需要一系列生物合成酶的配合,包括腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合成酶(SS)、顆粒淀粉合成酶(GBSS)、淀粉分支酶(SBE)、淀粉去分支酶(DBE)[2]。淀粉代謝相關(guān)基因在植物中得到了廣泛的研究[3,4]。轉(zhuǎn)基因玉米植株中ZmAGPase基因的過(guò)表達(dá)可以改善玉米的籽粒性狀[5];在馬鈴薯[6]和劍蘭[7]塊莖中,通過(guò)RNAi技術(shù)完全抑制AGPase基因的表達(dá),可以使淀粉不能形成。利用RNAi技術(shù)抑制IbGBSSI基因表達(dá),可產(chǎn)生無(wú)直鏈淀粉轉(zhuǎn)基因甘薯[8]。通過(guò)調(diào)控甘薯中IbGBSS基因的表達(dá),可以得到直鏈淀粉-支鏈淀粉比例不同的淀粉[9]。Miao等從香蕉果實(shí)中克隆了6個(gè)MaGBSS基因,它們分別在不同發(fā)育階段對(duì)淀粉積累起促進(jìn)作用[10]。Chen等發(fā)現(xiàn)CmSBEs基因表達(dá)量在板栗子葉發(fā)育過(guò)程中顯著增加,且淀粉總量的增加主要是支鏈淀粉的合成[11]。馬鈴薯塊莖中淀粉分支酶Ⅱ(StSBEⅡ)的過(guò)表達(dá)可增加支鏈淀粉的短鏈分支[12]。Schwall等通過(guò)RNAi技術(shù)同時(shí)抑制StSBEⅠ和StSBEⅡ基因的表達(dá),成功地開發(fā)了一種生產(chǎn)直鏈淀粉含量高的淀粉的方法[13]。

    植物中淀粉的生物合成和降解受到多重調(diào)控。Smith利用基因芯片技術(shù)分析了擬南芥葉片全天的轉(zhuǎn)錄組,表明淀粉代謝相關(guān)基因的表達(dá)受到晝夜周期的影響[14]。基因表達(dá)分析顯示,籽粒莧AcSS基因在種子成熟過(guò)程中呈現(xiàn)組成型表達(dá)[15]。在擬南芥葉片中,AtGBSSⅠ基因表達(dá)受Myb型轉(zhuǎn)錄因子CCA1和LHY的調(diào)控,在晝夜周期中呈現(xiàn)節(jié)律振蕩[16]。然而,關(guān)于甘薯貯藏根中淀粉代謝相關(guān)基因晝夜周期變化規(guī)律的研究尚未見報(bào)道。因此,我們選擇4個(gè)淀粉含量不同的甘薯品種,研究淀粉代謝相關(guān)基因的晝夜周期變化規(guī)律。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    本試驗(yàn)選用4個(gè)甘薯品種(濟(jì)薯25,淀粉含量22.6%;漯徐薯8號(hào),淀粉含量為25.2%;鄭薯20,淀粉含量12.6%;紅香蕉,淀粉含量13.5%),在山東省泰安市山東果樹研究所金牛山實(shí)驗(yàn)站栽培。幼苗移栽后第106 d為貯藏根膨大階段,每3 h(6時(shí)至21時(shí))收集發(fā)育的貯藏根。對(duì)每個(gè)品種從10個(gè)甘薯貯藏根中選擇中間大小的3個(gè)樣品,以減少取樣誤差。甘薯貯藏根用蒸餾水沖洗,切成小塊(直徑0.5 cm),冷凍于液氮中,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 RNA提取

    用天根生化科技有限公司的多糖多酚RNA提取試劑盒,按照說(shuō)明書操作,提取RNA。

    1.3 qRT-PCR驗(yàn)證

    用Primer Premier軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR引物(表1)。用羅氏LightCycler? 480II儀器進(jìn)行定量分析。定量PCR分析程序?yàn)?5℃變性15 s;然后是95℃ 15 s,55℃ 15 s,72℃ 15 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。用IbActin作為內(nèi)參基因。用2-ΔΔCT對(duì)定量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 IbAGPα和IbAGPβ基因的表達(dá)分析

    腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)催化葡萄糖-1-磷酸和ATP生成腺苷二磷酸葡萄糖,是高等植物淀粉生物合成的前體。AGPase是由兩個(gè)大亞基和兩個(gè)小亞基構(gòu)成的異源四聚體,大亞基是酶的調(diào)節(jié)中心,小亞基是酶的催化中心。本研究發(fā)現(xiàn),4個(gè)甘薯品種貯藏根中IbAGPase大亞基(IbAGPα)的表達(dá)在晝夜周期中呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),在12時(shí)至15時(shí)達(dá)到表達(dá)的高峰(圖1A)。IbAGPase小亞基(IbAGPβ)在晝夜周期中表達(dá)量變化不明顯(圖1B)。Smith在擬南芥中的研究發(fā)現(xiàn)AtAGPase大亞基在晝夜周期中呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)[14],這與我們的研究結(jié)果一致;擬南芥葉片AtAGPase小亞基的轉(zhuǎn)錄水平也呈現(xiàn)周期變化不明顯的趨勢(shì),然而,其表達(dá)量明顯低于甘薯。

    2.2 IbSS和IbGBSSⅠ基因的表達(dá)分析

    在高等植物中,有兩種不同功能和定位的淀粉合成酶:淀粉合酶(SS)和顆粒結(jié)合淀粉合酶(GBSS)。淀粉合酶主要存在于質(zhì)體基質(zhì)中,在支鏈淀粉的合成中起作用。顆粒結(jié)合淀粉合酶與淀粉顆粒緊密結(jié)合,負(fù)責(zé)直鏈淀粉的合成。顆粒結(jié)合淀粉合酶Ⅰ(GBSSⅠ)是將葡萄糖基從腺苷二磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移到葡聚糖生成直鏈淀粉的關(guān)鍵酶之一[17]。本研究發(fā)現(xiàn),四個(gè)甘薯品種貯藏根中IbSS和IbGBSSⅠ基因的表達(dá)在晝夜周期中呈周期性變化。從6時(shí)到12時(shí),IbSS基因的表達(dá)逐漸升高,并在中午12時(shí)達(dá)到高峰。然后,從12時(shí)到21時(shí),IbSS基因的表達(dá)逐漸降低(圖2A)。IbGBSSⅠ基因與IbSS基因呈現(xiàn)相似的趨勢(shì)(圖2B)。且IbGBSSⅠ基因表達(dá)量的增幅明顯低于IbSS基因。Smith等發(fā)現(xiàn)擬南芥葉片AtSS和AtGBSS基因的表達(dá)在白天先升高后降低[14]。我們的結(jié)果中也觀察到同樣的趨勢(shì),但是IbSS基因的上調(diào)相對(duì)于擬南芥發(fā)生在較晚的階段。這可能與光合產(chǎn)物從葉子到根的運(yùn)輸有關(guān)。AtGBSS基因的上調(diào)表達(dá)高于AtSS基因,這與我們的結(jié)果相反。這可能因?yàn)檫@兩種植物的淀粉成分不同有關(guān)。Zeeman發(fā)現(xiàn)擬南芥淀粉含量的增加與葉片直鏈淀粉含量的增加有關(guān)[18],而甘薯貯藏根淀粉的主要成分是支鏈淀粉[19]。

    2.3 IbSBEⅠ和IbSBEⅡ基因的表達(dá)分析

    淀粉分支酶(SBE)是淀粉生物合成的關(guān)鍵酶,通過(guò)在葡聚糖上產(chǎn)生α-1,6-糖苷鍵從而產(chǎn)生分支。IbSBEⅠ基因在甘薯塊根中有較強(qiáng)的表達(dá),其在甘薯發(fā)育的貯藏根的淀粉合成中起著重要作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn),IbSBEⅠ和IbSBEⅡ在4個(gè)甘薯品種發(fā)育的貯藏根中的表達(dá)在整個(gè)晝夜周期中呈周期性變化。從6時(shí)到15時(shí),IbSBEⅠ基因的表達(dá)逐漸升高,并在15時(shí)達(dá)到高峰,然后,從15時(shí)到21時(shí),IbSBEⅠ基因的表達(dá)逐漸降低(圖3A)。IbSBE Ⅱ基因與IbSBE Ⅰ基因表現(xiàn)出相似的趨勢(shì)(圖3B)。但I(xiàn)bSBE Ⅱ基因的上調(diào)幅度明顯高于IbSBE Ⅰ基因。我們的結(jié)果表明,IbSBE Ⅰ和IbSBE Ⅱ基因的表達(dá)在整個(gè)晝夜循環(huán)中呈先升高后降低的趨勢(shì),這與Smith等[14]的研究結(jié)果一致。

    2.4 Ibα-amylase和Ibβ-amylase基因的表達(dá)分析

    淀粉的水解依賴α-淀粉酶(α-amylase)、β-淀粉酶(β-amylase)、去分支酶和α-葡萄糖苷酶的共同作用。α-淀粉酶直接攻擊淀粉粒,水解釋放可溶性亞基,然后在其他三個(gè)酶的作用下水解成麥芽糖和葡萄糖[21]。β-淀粉酶催化淀粉粒非還原末端α-1,4糖苷鍵的水解,產(chǎn)生麥芽糖。本研究發(fā)現(xiàn),Ibα-amylase基因的表達(dá)在4個(gè)甘薯品種發(fā)育的貯藏根中隨著晝夜周期呈現(xiàn)規(guī)律性變化。從6時(shí)到18時(shí),Ibα-amylase基因的表達(dá)逐漸升高,在15時(shí)至18時(shí)達(dá)到高峰。然后,從18時(shí)到21時(shí),Ibα-amylase基因的表達(dá)逐漸降低(圖4A)。Smith研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥葉Atα-amylase基因的表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),Atα-amylase基因表達(dá)的高峰顯著早于甘薯中的結(jié)果。Ibβ-amylase基因的表達(dá)在4個(gè)甘薯品種發(fā)育的貯藏根中隨晝夜周期沒有明顯變化(圖4B)。

    3 討論與結(jié)論

    已有的研究表明,淀粉合成酶可在轉(zhuǎn)錄水平、蛋白質(zhì)水平調(diào)控淀粉的合成。在植物體非光合貯藏器官中,AGPase在淀粉合成中的作用主要是通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平來(lái)調(diào)控。在小麥種子灌漿期,AGPase的含量和淀粉合成速率與AGPase基因表達(dá)水平呈正相關(guān)[22]。馬鈴薯塊莖形成時(shí),AGPase對(duì)淀粉合成的調(diào)控主要體現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平上[23]。我們的研究發(fā)現(xiàn)甘薯中IbAGPα基因的表達(dá)還受到晝夜周期的調(diào)控,說(shuō)明晝夜周期是影響甘薯貯藏根淀粉合成的一個(gè)因素。GBSSⅠ酶能夠合成顆粒淀粉,在暗周期中會(huì)降解,在光照周期中會(huì)迅速合成[14],GBSSⅠ酶的變化規(guī)律與甘薯中IbGBSSⅠ基因的表達(dá)水平一致,這表明GBSS酶活性也受到轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。SS主要在支鏈淀粉的合成中起作用,GBSS主要在直鏈淀粉合成中起作用。Ulrka等[24]研究發(fā)現(xiàn),馬鈴薯SBEⅠ以直鏈淀粉為底物,而SBEⅡ以支鏈淀粉為底物,我們的研究發(fā)現(xiàn)IbSS和IbSBEⅡ基因的表達(dá)在晝夜周期中上調(diào)的水平明顯高于IbGBSS和IbSBEⅠ基因,這與甘薯貯藏根淀粉的主要成分是支鏈淀粉相對(duì)應(yīng)[19]。

    本研究對(duì)4個(gè)淀粉含量不同的甘薯品種發(fā)育的貯藏根中淀粉代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析顯示,其在晝夜周期中從6時(shí)到21時(shí)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)高峰出現(xiàn)在12時(shí)到15時(shí),淀粉降解相關(guān)基因的表達(dá)高峰出現(xiàn)在15時(shí)之后,不同淀粉含量甘薯品種淀粉代謝相關(guān)基因表達(dá)趨勢(shì)相似,揭示了淀粉代謝相關(guān)基因在整個(gè)晝夜循環(huán)中的表達(dá)變化。本研究進(jìn)一步豐富了我們對(duì)甘薯貯藏根淀粉代謝調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

    參 考 文 獻(xiàn):

    [1]Himada T,Otani M,Hamada T,et al. Increase of amylose content of sweetpotato starch by RNA interference of the starch branching enzymeⅡgene (IbSBEⅡ) [J]. Plant Biotechnology,2006,23(1):85-90.

    [2]Jeon J S,Ryoo N,Hahn T R,et al. Starch biosynthesis in cereal endosperm [J]. Plant Physiol. Biochem.,2010,48(6):383-392.

    [3]劉美,張鳳,楊翠翠,等. 小麥種子萌發(fā)早期淀粉降解關(guān)鍵酶活性及基因表達(dá)量研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,46(9):39-45.

    [4]Mitsui T,Itoh K,Hori H,et al. Biosynthesis and degradation of starch [J]. Bulletin of the Faculty of Agriculture Niigata University,2009,33(4):431-454.

    [5]Li N,Zhang S,Zhao Y,et al. Over-expression of AGPase genes enhances seed weight and starch content in transgenic maize [J]. Planta,2011,233(2):241-250.

    [6]Müllerrber B,Sonnewald U,Willmitzer L. Inhibition of the ADP-glucose pyrophosphorylase in transgenic potatoes leads to sugar-storing tubers and influences tuber formation and expression of tuber storage protein genes [J]. EMBO Journal,1992,11(4):1229-1238.

    [7]Seng S S,Wu J,Sui J J,et al. ADP-glucose pyrophosphorylase gene plays a key role in the quality of corm and yield of cormels in gladiolus [J]. Biochemical & Biophysical Research Communications,2016,474(1):206-212.

    [8]Otani M,Hamada T,Katayama K,et al. Inhibition of the gene expression for granule-bound starch synthase I by RNA interference in sweet potato plants [J]. Plant Cell Rep.,2007,26(10):1801-1807.

    [9]Kimura T,Saito A. Heterogeneity of poly(A) sites in the granule-bound starch synthaseⅠgene in sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) [J]. Biosci. Biotechnol. Biochem.,2010,74(3):667-669.

    [10]Miao H,Sun P,Liu W,et al. Identification of genes encoding granule-bound starch synthase involved in amylose metabolism in banana fruit[J]. PLoS ONE,2014,9(2):e88077.

    [11]Chen L,Lu D,Wang T,et al. Identification and expression analysis of starch branching enzymes involved in starch synthesis during the development of chestnut (Castanea mollissima Blume) cotyledons [J]. PLoS ONE,2017,12(5):e0177792.

    [12]Brummell D A,Watson L M,Zhou J,et al. Overexpression of STARCH BRANCHING ENZYMEⅡincreases short-chain branching of amylopectin and alters the physicochemical properties of starch from potato tuber [J]. BMC Biotechnology,2015,15(1):28.

    [13]Schwall G P,Safford R,Westcott R J,et al. Production of very-high-amylose potato starch by inhibition of SBE A and B [J]. Nature Biotechnology,2000,18(5):551-554.

    [14]Smith S M,F(xiàn)ulton D C,Chia T,et al. Diurnal changes in the transcriptome encoding enzymes of starch metabolism provide evidence for both transcriptional and posttranscriptional regulation of starch metabolism in Arabidopsis leaves [J]. Plant Physiology,2004,136(1):2687-2699.

    [15]Park Y J,Nishikawa T,Tomooka N,et al. Molecular cloning and expression analysis of a gene encoding soluble starch synthaseⅠfrom grain amaranth (Amaranthus cruentus L.) [J]. Molecular Breeding,2012,30(2):1065-1076.

    [16]Tenorio G,Orea A,Romero J M,et al. Oscillation of mRNA level and activity of granule-bound starch synthaseⅠin Arabidopsis leaves during the day/night cycle [J]. Plant Mol. Biol.,2003,51(6):949-958.

    [17]Zeeman S C,Kossmann J,Smith A M. Starch: its metabolism,evolution and biotechnological modification in plants [J]. Annual Review of Plant Biology,2010,61(1):209-234.

    [18]Zeeman S C,Tiessen A,Pilling E,et al. Starch synthesis in Arabidopsis: granule synthesis,composition and structure [J]. Plant Physiology,2002,129(2):516.

    [19]史春余,姚海蘭,張立明,等. 不同類型甘薯品種塊根淀粉粒粒度的分布特征[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,44(21):4537-4543.

    [20]Hamada T,Kim S H,Shimada T. Starch-branching enzyme I gene (IbSBEI) from sweet potato (Ipomoea batatas), molecular cloning and expression analysis [J]. Biotechnology Letters,2006,28(16):1255-1261.

    [21]Sarikaya E,Higasa T,Adachi M,et al. Comparison of degradation abilities of α- and β-amylases on raw starch granules [J]. Process Biochemistry,2000,35(7):711-715.

    [22]Anderson J M, Larsen R, Laudencia D, et al. Molecular characterization of the gene encoding a rice endosperm-specific ADP-glucose pyrophosphorylase subunit and its developmental pattern of transcription [J]. Gene,1991,97(2):199-205.

    [23]Smith-White B J, Preiss J. Comparison of proteins of ADP-glucose pyrophosphorylase from diverse sources [J]. J. Mol. Evol.,1992,34(5):449-464.

    [24]Ulrka R, Lena A, Roger A. Comparion of starch branching enzyme Ⅲ from potato [J]. European Journal of Biochemistry,2001,268:6140-6145.

    收稿日期:2019-08-13

    基金項(xiàng)目:國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2018YFD1000705-8);國(guó)家甘薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-10-B07);山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系薯類創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(SDAIT-16-04);山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所學(xué)科團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(CXGC2018E01)

    作者簡(jiǎn)介:秦楨(1979—),男,助理研究員,博士,主要從事甘薯分子育種工作。E-mail:qinzhenbio@163.com

    *同為第一作者。

    通訊作者:王慶美(1964—),女,研究員,博士,主要從事甘薯育種工作。E-mail:wang-qm@163.com

    猜你喜歡
    甘薯
    甘薯病蟲害的發(fā)病規(guī)律及防治技術(shù)探討
    甘薯黑斑病的危害及其防治
    洪都拉斯Monty Farms公司被準(zhǔn)許銷售甘薯
    紫甘薯濃縮澄清汁生產(chǎn)技術(shù)
    甜甘薯
    甘薯的儲(chǔ)存
    成人精品一区二区免费| 国内精品久久久久精免费| 亚洲国产色片| 国模一区二区三区四区视频| 成人午夜高清在线视频| av国产免费在线观看| 亚州av有码| 少妇的逼好多水| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久午夜亚洲精品久久| 能在线免费观看的黄片| aaaaa片日本免费| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产亚洲欧美98| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 91麻豆av在线| 国产麻豆成人av免费视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲综合色惰| 国产一区二区在线观看日韩| 久久中文看片网| 久久人人精品亚洲av| 久久这里只有精品中国| 国产精品日韩av在线免费观看| 中文字幕熟女人妻在线| www.www免费av| 很黄的视频免费| 婷婷丁香在线五月| 99精品久久久久人妻精品| 熟女电影av网| 22中文网久久字幕| 国产一区二区三区av在线 | 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧美成人一区二区免费高清观看| 日韩高清综合在线| 人妻少妇偷人精品九色| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 欧美极品一区二区三区四区| 色尼玛亚洲综合影院| 国产单亲对白刺激| 成年女人永久免费观看视频| 日本爱情动作片www.在线观看 | 在线观看一区二区三区| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 欧美黑人欧美精品刺激| 欧美性感艳星| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 久久久精品大字幕| 免费看av在线观看网站| 午夜爱爱视频在线播放| av在线天堂中文字幕| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲色图av天堂| 国产免费男女视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产高清不卡午夜福利| 久久欧美精品欧美久久欧美| 五月伊人婷婷丁香| 久久久久久久久大av| www.色视频.com| 久久久久久久午夜电影| 日本a在线网址| 欧美成人一区二区免费高清观看| 久9热在线精品视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 欧美成人a在线观看| 国产黄色小视频在线观看| 亚洲欧美日韩高清专用| 最后的刺客免费高清国语| 1024手机看黄色片| 欧美丝袜亚洲另类 | 身体一侧抽搐| 天天一区二区日本电影三级| 久久久久久九九精品二区国产| 婷婷六月久久综合丁香| 九九在线视频观看精品| 亚洲成人中文字幕在线播放| 99国产极品粉嫩在线观看| 一a级毛片在线观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 我要搜黄色片| 三级毛片av免费| 少妇人妻精品综合一区二区 | 国产高清激情床上av| 日韩欧美 国产精品| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 日本黄大片高清| av.在线天堂| 91久久精品电影网| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲乱码一区二区免费版| 日韩中字成人| 男女边吃奶边做爰视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 听说在线观看完整版免费高清| 一进一出好大好爽视频| 99九九线精品视频在线观看视频| 欧美成人性av电影在线观看| 国产黄色小视频在线观看| 亚洲最大成人av| 给我免费播放毛片高清在线观看| 又爽又黄无遮挡网站| 又爽又黄a免费视频| 免费看日本二区| 日韩欧美国产在线观看| av黄色大香蕉| 久久久久久久久久成人| 三级国产精品欧美在线观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 伦精品一区二区三区| 国产精品久久久久久久久免| 色5月婷婷丁香| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产精品伦人一区二区| 麻豆一二三区av精品| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 男人舔女人下体高潮全视频| 日本a在线网址| 91麻豆av在线| 国产乱人伦免费视频| 午夜a级毛片| 免费看美女性在线毛片视频| 国产人妻一区二区三区在| 国产精品电影一区二区三区| 国产午夜福利久久久久久| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 久久亚洲真实| 老司机福利观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 精品一区二区三区人妻视频| 丰满的人妻完整版| 舔av片在线| 国产精品一区www在线观看 | 国产精品国产高清国产av| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产精品三级大全| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲精品456在线播放app | 久久这里只有精品中国| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 美女cb高潮喷水在线观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 精品久久久久久成人av| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 少妇熟女aⅴ在线视频| 波野结衣二区三区在线| 午夜福利在线在线| 欧美又色又爽又黄视频| av国产免费在线观看| 麻豆国产97在线/欧美| a级毛片免费高清观看在线播放| 成人午夜高清在线视频| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久久久九九精品影院| 免费看av在线观看网站| 波多野结衣巨乳人妻| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 女同久久另类99精品国产91| 美女 人体艺术 gogo| 99久国产av精品| 又爽又黄无遮挡网站| 又爽又黄无遮挡网站| 国产一区二区在线av高清观看| 久久国产乱子免费精品| 99在线人妻在线中文字幕| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 69人妻影院| 欧美zozozo另类| 给我免费播放毛片高清在线观看| 免费看美女性在线毛片视频| 国产一区二区在线av高清观看| 91久久精品国产一区二区三区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产高清有码在线观看视频| 午夜老司机福利剧场| 亚洲人成网站在线播| 内地一区二区视频在线| 国产精品伦人一区二区| 啦啦啦啦在线视频资源| 级片在线观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| av专区在线播放| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 欧美激情国产日韩精品一区| 大型黄色视频在线免费观看| 一区二区三区高清视频在线| 欧美日本亚洲视频在线播放| 欧美日本亚洲视频在线播放| 我的女老师完整版在线观看| 精品国产三级普通话版| 观看美女的网站| 日韩欧美精品免费久久| 听说在线观看完整版免费高清| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 一级av片app| 欧美另类亚洲清纯唯美| 内地一区二区视频在线| 午夜福利视频1000在线观看| 久久九九热精品免费| 久久久久性生活片| 亚洲图色成人| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产高潮美女av| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲七黄色美女视频| 久久久久国内视频| 精品日产1卡2卡| 精品久久久久久久久久久久久| 窝窝影院91人妻| ponron亚洲| av在线观看视频网站免费| 床上黄色一级片| 欧美一区二区国产精品久久精品| 在线观看美女被高潮喷水网站| 99热这里只有是精品在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 免费人成在线观看视频色| 亚洲av中文av极速乱 | 成年免费大片在线观看| 窝窝影院91人妻| .国产精品久久| 一区福利在线观看| 国产精品人妻久久久影院| 午夜福利在线观看吧| 日本a在线网址| 久久精品国产亚洲av天美| 免费av不卡在线播放| 亚州av有码| 日本与韩国留学比较| 日日夜夜操网爽| 无遮挡黄片免费观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 久久久久久久久久久丰满 | 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产精品女同一区二区软件 | 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲国产精品合色在线| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 久久精品国产亚洲网站| 老司机福利观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲av熟女| 天堂√8在线中文| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久精品国产自在天天线| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲精品影视一区二区三区av| 午夜老司机福利剧场| 能在线免费观看的黄片| 搡老熟女国产l中国老女人| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产一区二区在线观看日韩| 成人无遮挡网站| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 午夜福利18| 日韩欧美精品免费久久| 黄色欧美视频在线观看| 成人av一区二区三区在线看| 久久久久久久久大av| 好男人在线观看高清免费视频| 赤兔流量卡办理| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 精品欧美国产一区二区三| 看片在线看免费视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 日韩人妻高清精品专区| 变态另类丝袜制服| 精品一区二区三区视频在线| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 熟女电影av网| 久久人人精品亚洲av| 日本精品一区二区三区蜜桃| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产精品久久久久久av不卡| 亚洲av第一区精品v没综合| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 欧美不卡视频在线免费观看| 香蕉av资源在线| 亚洲黑人精品在线| av在线老鸭窝| 亚洲最大成人中文| 亚洲国产精品sss在线观看| 精品一区二区三区人妻视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 观看免费一级毛片| 又黄又爽又免费观看的视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲av免费高清在线观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 在线播放无遮挡| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久久久久久午夜电影| 亚洲四区av| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 中文字幕av成人在线电影| а√天堂www在线а√下载| 精品人妻熟女av久视频| 赤兔流量卡办理| 日本五十路高清| 日韩欧美免费精品| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 美女被艹到高潮喷水动态| netflix在线观看网站| 国产精品国产高清国产av| av福利片在线观看| 日本五十路高清| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚州av有码| 午夜激情福利司机影院| 国产成人aa在线观看| 中文字幕高清在线视频| netflix在线观看网站| 国产三级中文精品| 日韩av在线大香蕉| 精品久久久久久成人av| 精品国内亚洲2022精品成人| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 美女被艹到高潮喷水动态| 亚洲午夜理论影院| 国产精品1区2区在线观看.| 色哟哟哟哟哟哟| 国产高清激情床上av| 91久久精品国产一区二区三区| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产精品电影一区二区三区| 色哟哟哟哟哟哟| 欧美激情在线99| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 国产真实乱freesex| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 97热精品久久久久久| 亚洲成人久久爱视频| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产精品不卡视频一区二区| 在线观看66精品国产| 老熟妇仑乱视频hdxx| 色哟哟·www| 在线免费观看不下载黄p国产 | 淫秽高清视频在线观看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品 | 国内精品久久久久久久电影| 国产黄片美女视频| a级毛片免费高清观看在线播放| 欧美国产日韩亚洲一区| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 国产视频一区二区在线看| 国产精品精品国产色婷婷| 国产在视频线在精品| 小说图片视频综合网站| 美女大奶头视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 欧美3d第一页| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| www.色视频.com| 国产中年淑女户外野战色| 免费无遮挡裸体视频| 国产男人的电影天堂91| 国产单亲对白刺激| 在线a可以看的网站| АⅤ资源中文在线天堂| 国产v大片淫在线免费观看| 永久网站在线| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 久久国内精品自在自线图片| 特级一级黄色大片| 88av欧美| 如何舔出高潮| 国产乱人视频| 日韩高清综合在线| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产亚洲91精品色在线| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产高清视频在线播放一区| 日韩av在线大香蕉| 午夜视频国产福利| 国产伦精品一区二区三区视频9| 午夜激情福利司机影院| 国产视频一区二区在线看| 天美传媒精品一区二区| 啦啦啦韩国在线观看视频| 高清日韩中文字幕在线| 九色国产91popny在线| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲精品粉嫩美女一区| 午夜免费男女啪啪视频观看 | aaaaa片日本免费| 亚洲精品一区av在线观看| xxxwww97欧美| 一a级毛片在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 99热网站在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲午夜理论影院| 两个人视频免费观看高清| 精品福利观看| 午夜福利视频1000在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 日本五十路高清| 国产精品伦人一区二区| 久久99热这里只有精品18| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产亚洲91精品色在线| 亚洲午夜理论影院| 久久久久久久精品吃奶| 日韩中文字幕欧美一区二区| 久9热在线精品视频| 嫩草影视91久久| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 久久人人精品亚洲av| 成熟少妇高潮喷水视频| 丰满人妻一区二区三区视频av| 成人综合一区亚洲| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 天天一区二区日本电影三级| 欧美一级a爱片免费观看看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲三级黄色毛片| 极品教师在线免费播放| 国产毛片a区久久久久| 亚洲精品久久国产高清桃花| 日本黄大片高清| 欧美xxxx性猛交bbbb| 午夜免费成人在线视频| 午夜福利成人在线免费观看| 日日撸夜夜添| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 可以在线观看的亚洲视频| 1000部很黄的大片| 韩国av在线不卡| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 欧美中文日本在线观看视频| 日韩精品有码人妻一区| 99久国产av精品| av天堂在线播放| 欧美中文日本在线观看视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲图色成人| 少妇的逼好多水| 欧美日本视频| 一个人观看的视频www高清免费观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 精品人妻熟女av久视频| 日本色播在线视频| 又爽又黄a免费视频| 哪里可以看免费的av片| 欧美人与善性xxx| 亚洲精品影视一区二区三区av| 免费观看在线日韩| 99热6这里只有精品| 精华霜和精华液先用哪个| 色尼玛亚洲综合影院| 十八禁网站免费在线| 国产欧美日韩精品一区二区| 校园人妻丝袜中文字幕| 全区人妻精品视频| 久久精品国产亚洲网站| 婷婷六月久久综合丁香| 日日夜夜操网爽| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲不卡免费看| 我的女老师完整版在线观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲精品国产成人久久av| 欧美日韩国产亚洲二区| 日韩欧美精品免费久久| 国产三级中文精品| 免费黄网站久久成人精品| 精品乱码久久久久久99久播| 人人妻人人看人人澡| 91久久精品国产一区二区成人| 日本-黄色视频高清免费观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 黄片wwwwww| 老师上课跳d突然被开到最大视频| АⅤ资源中文在线天堂| 日本熟妇午夜| 在现免费观看毛片| 无遮挡黄片免费观看| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲最大成人av| h日本视频在线播放| 国产真实乱freesex| 日本色播在线视频| 亚洲在线自拍视频| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 免费av不卡在线播放| 能在线免费观看的黄片| 男人舔女人下体高潮全视频| 99热精品在线国产| а√天堂www在线а√下载| 日本黄色视频三级网站网址| 麻豆av噜噜一区二区三区| 日日撸夜夜添| 在线观看舔阴道视频| 毛片一级片免费看久久久久 | 97热精品久久久久久| 亚洲专区中文字幕在线| 免费黄网站久久成人精品| 少妇的逼好多水| 黄色配什么色好看| 在现免费观看毛片| 日本色播在线视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 一级毛片久久久久久久久女| av.在线天堂| 成年免费大片在线观看| 日韩欧美三级三区| 亚洲无线观看免费| 国产精华一区二区三区| 国产精品无大码| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 欧美性感艳星| 亚洲电影在线观看av| 美女高潮的动态| 久久中文看片网| 亚洲午夜理论影院| 99riav亚洲国产免费| av在线观看视频网站免费| 天堂影院成人在线观看| 亚洲无线在线观看| 在线观看66精品国产| 亚洲人成伊人成综合网2020| 久久这里只有精品中国| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 免费搜索国产男女视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| 欧美极品一区二区三区四区| 床上黄色一级片| 亚洲av五月六月丁香网| 乱系列少妇在线播放| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 美女免费视频网站| 国产色婷婷99| 日韩av在线大香蕉| 男人舔奶头视频| av黄色大香蕉| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产午夜福利久久久久久| 干丝袜人妻中文字幕| 国产三级在线视频| 亚洲美女视频黄频| 成年免费大片在线观看| 亚洲18禁久久av| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 成人av在线播放网站| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 欧美国产日韩亚洲一区| 免费高清视频大片| 国产色爽女视频免费观看| 国产亚洲91精品色在线| 中文字幕av在线有码专区| 免费看美女性在线毛片视频| 99久久精品一区二区三区| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 成人永久免费在线观看视频| 久久久久久久午夜电影| 欧美人与善性xxx| 男女视频在线观看网站免费| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 好男人在线观看高清免费视频| 神马国产精品三级电影在线观看| 如何舔出高潮| 亚洲综合色惰| 成人一区二区视频在线观看| 男女边吃奶边做爰视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 欧美成人性av电影在线观看| 看十八女毛片水多多多| 成人无遮挡网站| 身体一侧抽搐| 无人区码免费观看不卡| 日日啪夜夜撸| 成人二区视频| 婷婷六月久久综合丁香| 国产高清三级在线| 哪里可以看免费的av片| 日韩国内少妇激情av| 禁无遮挡网站| 午夜福利高清视频| 成年免费大片在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 老司机福利观看| 久久久成人免费电影| 亚洲在线观看片| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 久久精品91蜜桃|