石榴花水提物活性成分檢測及抗炎作用

阿得力江·吾斯曼，張震平，特列克·阿依恒別克，艾米娜什·哈力別克，況 玲，賽福丁·阿不拉 (新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 地方藥用植物研究室，新疆 烏魯木齊 830052)

石榴花為石榴科(Punicaceae)石榴屬(PunicaL.)植物石榴(PunicagranatumL.)的干燥花瓣[1]?；ɡ贋榧t色，也有瑪瑙、粉紅、黃色和白色等，常呈四棱形，枝端多為刺狀，具有良好的食用和藥用價值[2]。石榴花是新疆常用藥材之一，2005年石榴花被載入《中華本草·維吾爾藥卷》中，據(jù)記載石榴花的主要有出汗止血、收斂止瀉等功效[3]。石榴花外用于口舌發(fā)痛、出血、口臭、牙痛及肛門直腸痔瘡和瘙癢等疾病的治療[4]。石榴的皮、葉、果實、種子部分的研究較多，但對石榴花瓣的研究較少[5]。目前已從石榴花中提取的化合物有沒食子酸、鞣花酸、甲基鞣花酸等，分離出的活性成分有多酚類，據(jù)報道這些活性成分具有抗炎抗氧化、降糖調(diào)脂，緩解胰島素抵抗等功效[6-7]。

SARKER等[8]采用角叉菜膠所致鼠足腫脹動物模型觀察石榴花的抗炎作用，結(jié)果表明200 mg/kg石榴花石油醚-醋酸乙酯、二氯甲烷、甲醇提取物，對角叉菜膠所致大鼠足腫脹炎癥模型的抑制率分別為26.92%，27.97%，21.85%，表現(xiàn)出良好的鎮(zhèn)痛抗炎作用。XU等[9]研究表明，石榴花乙醇提取物能夠顯著降低LPS誘導(dǎo)的炎癥模型巨噬細(xì)胞IL-6、IL-1β和TNF-α等細(xì)胞因子的分泌及幾種炎性介質(zhì)的表達(dá)，表現(xiàn)出良好的抗炎作用。但對石榴花水提物的抗炎功效未見報道。

因此，本試驗提取了石榴花水提物，對水提物中多糖、黃酮、生物堿、皂苷、多酚、蛋白等活性成分含量進(jìn)行了檢測；通過急性毒性試驗進(jìn)行安全性檢測；通過耳廓腫脹試驗及相關(guān)細(xì)胞因子和HE染色切片檢測，確定了石榴花水提物對二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹的抑制作用及抑制效果，以及石榴花水提物中所含活性成分和石榴花水提物的抗炎效果，為石榴花的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物25只雌性ICR小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(新)2019-0001。

1.2 藥物及試劑石榴花購自新疆維吾爾自治區(qū)民族醫(yī)院；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所)；磷酸氫二鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、香草醛(上海麥克林生化科技有限公司)；BCA試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；地塞米松(廣西華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司)；二甲苯，多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司)；TNF-α，IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)；乙醇、甲醇、苯酚、濃硫酸、三氯甲烷、高氯酸、冰乙酸等試劑均為分析純。

1.3 石榴花水提物的制備稱取已干燥粉碎過的石榴花300 g，過24目篩，經(jīng)蒸餾水浸泡2 h，于95℃，料液比1∶10的條件下提取2 h，重復(fù)2次，合并提取液并濃縮至1 kg/L，對濃縮液高壓滅菌，冷卻后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 石榴花水提物各有效成分含量的測定

1.4.1多糖含量的檢測 通過苯酚硫酸法[10]，用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用紫外-可見光分光光度計測定D490 nm值，檢測石榴花水提物中多糖含量。

（3）當(dāng)前，全市各縣城鎮(zhèn)污水處理率較低，仍然存在污水直排水功能區(qū)現(xiàn)象，嚴(yán)重污染了水功能區(qū)的水環(huán)境。各級政府應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)污水處理廠的規(guī)劃與建設(shè)，同時做好污水管網(wǎng)建設(shè)，以提高污水的處理率和處理質(zhì)量。

1.4.2黃酮含量的檢測 通過亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法[10]，用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用紫外-可見光分光光度計測定D510 nm值，檢測石榴花水提物中黃酮含量。

1.4.3生物堿含量的檢測 通過酸性染色比色法[11]，用鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用紫外-可見光分光光度計測定D418 nm值，檢測石榴花水提物中生物堿含量。

1.4.4多酚含量的檢測 通過福林酚法[12]，用沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用紫外-可見光分光光度計測定D765 nm值，檢測石榴花水提物中多酚含量。

1.4.5皂苷含量的檢測 通過香草醛高氯酸法[13]，用人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用紫外-可見光分光光度計測定D454 nm值，檢測石榴花水提物中皂苷含量。

1.4.6蛋白含量的檢測 按照BCA試劑盒操作說明，采用紫外-可見光分光光度計測定D562 nm值，檢測石榴花水提物中蛋白含量。

1.5 石榴花水提物的急性毒性試驗取14只雌性小鼠，體質(zhì)量18～22 g，隨機(jī)分為5組。禁食12 h但不禁水，1～5組分別灌喂1 600，800，400，200，100 g/L石榴花水提物，0.5 mL/只，灌喂前后稱重。灌喂后觀察小鼠精神狀態(tài)，3 h后添加飼料，觀察小鼠采食情況，如有小鼠死亡解剖，觀察內(nèi)臟。

1.6 石榴花水提物對小鼠耳廓腫脹的影響取25只雌性小鼠，體質(zhì)量18～22 g，每組5只。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，試驗前小鼠禁食不禁水12 h，根據(jù)體質(zhì)量和性別隨機(jī)分為生理鹽水模型對照組(Control，10 mL/kg)、地塞米松陽性對照組(DXM，600 mg/kg)、石榴花水提物高、中、低劑量組(500，100，50 g/L)，所有組灌胃量均為0.5 mL/只。每組連續(xù)灌胃7 d，最后1 d給藥1 h后，將100 %二甲苯0.2 mL均勻涂抹于每只小鼠左耳廓兩面致炎，右耳不做任何處理作為對照。致敏30 min后乙醚麻醉小鼠，后頸椎脫臼處死，剪下雙耳，采用直徑為7 mm的打孔器在左右耳的同樣部位打下耳片。稱重，以下耳片的質(zhì)量差作為耳腫脹度，計算腫脹抑制率[14]。

耳腫脹抑制率=(模型組腫脹度-給藥組腫脹度)/模型組腫脹度。

1.7 石榴花水提物對血清中細(xì)胞因子的影響致敏30 min后乙醚麻醉小鼠，眼球取血，后頸椎脫臼處死，分離血清，按ELISA試劑盒操作說明進(jìn)行，檢測小鼠血清中細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的含量[15]。

1.8 石榴花水提物對小鼠耳廓腫脹的影響將打孔稱重后的腫脹模型小鼠左耳迅速放入4%多聚甲醛固定液中，制作石蠟切片，HE染色，顯微鏡下觀察病理變化。

2 結(jié)果

2.1 石榴花水提物各有效成分含量的測定如圖1所示，以葡萄糖、蘆丁、鹽酸小檗堿、沒食子酸、人參皂和牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)分別制作多糖、黃酮、生物堿、多酚、皂苷和蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2均大于0.995說明可行度高，偏差較小，能夠準(zhǔn)確反映出樣品中各有效成分含量。石榴花水提物各有效成分檢測結(jié)果顯示，石榴花水提物中含量最多的活性成分分別為多糖和多酚，含量分別為(43.84±1.94)%，(22.44±1.62)%，其次分別為生物堿、黃酮、皂苷和蛋白，含量均低于10%(圖2)。

A.多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線；B.黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線；C.生物堿標(biāo)準(zhǔn)曲線；D.多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線；E.皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線；F.蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線圖1 各活性成分標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果

圖2 石榴花水提物各活性成分含量測定結(jié)果

2.2 石榴花水提物對小鼠的急性毒性試驗結(jié)果石榴花水提物在預(yù)試驗給藥劑量為1 600 ～100 g/L均未出現(xiàn)死亡及中毒現(xiàn)象，依照《中華人民共和國獸藥典·2015 年版》中獸藥急性毒性預(yù)試驗評價標(biāo)準(zhǔn)，可判斷石榴花水提物為無嚴(yán)重急性毒性的物質(zhì)。

2.3 石榴花水提物對小鼠耳廓腫脹的影響結(jié)果如表1所示，與模型組相比，高劑量組能顯著抑制小鼠耳廓腫脹(P<0.05)，且高劑量組的抑制效果最好；與地塞米松相比較，高、中、低劑量組無顯著性差異(P>0.05)。

表1 石榴花水提物對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

2.4 石榴花水提物對小鼠血清細(xì)胞因子分泌的影響如圖3所示，與模型組相比，石榴花水提物及陽性藥物地塞米松能顯著降低模型小鼠血清IL-6、TNF-α的分泌量(P<0.05)。石榴花水提物高劑量組(500 g/L)和中劑量組(100 g/L)IL-6和TNF-α的分泌量顯著低于模型組和地塞米松組，能夠顯著抑制耳腫脹模型小鼠體內(nèi)IL-6和TNF-α的生成，石榴花水提物低劑量組(50 g/L)也有一定的抑制作用，對TNF-α的抑制效果和地塞米松組無顯著性差異；對IL-6的抑制效果顯著高于地塞米松組。結(jié)果表明，石榴花水提物對IL-6和TNF-α均具有抑制作用且呈一定劑量依賴型。

A.TNF-α;B.IL-6圖3 石榴花水提物對耳腫脹小鼠促炎性細(xì)胞因子分泌的影響

2.5 石榴花水提物對小鼠耳片炎癥組織病理的影響對各組小鼠耳片進(jìn)行HE染色，200倍顯微鏡下進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，500，100 g/L劑量組及地塞米松組，耳切片可見較輕腫脹，有少量嗜中性粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞浸潤(圖4A、B、D)；低劑量組皮下組織間隙增寬、耳片組織較輕增厚、可見血管擴(kuò)張、有少量嗜中性粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞浸潤，腫脹明顯(圖4C)；模型組致炎后鼠耳切片的小鼠耳片有明顯腫脹、增厚，可見血管擴(kuò)張，有大量白細(xì)胞浸潤，耳軟骨與皮膚間組織疏松(圖4E)。結(jié)果表明，石榴花多糖對二甲苯所致小鼠耳腫脹具有良好的抑制作用。

圖4 石榴花水提物對耳腫脹小鼠促炎性細(xì)胞因子分泌的影響

3 討論

目前，天然藥物中提取到的活性成分有多糖、蛋白質(zhì)、酚類、生物堿、苷類、有機(jī)酸、揮發(fā)油等，大量研究表明這些活性成分具有不同的藥用活性作用[15]。因此，檢測藥用植物活性成分對該植物具體藥效成分的確定及進(jìn)一步研發(fā)成分商品化藥物具有重要意義。本試驗對石榴花水提物進(jìn)行了活性成分的分析，結(jié)果顯示，石榴花水提物中主要成分為多糖和多酚，其次分別為生物堿、黃酮、皂苷和蛋白，可知石榴花多糖和多酚為石榴花水提物的主要活性組成成分。

炎癥是一種病理反應(yīng)或病理過程，主要是在炎癥因子作用下發(fā)生的防御反應(yīng)[16]。建立炎癥反應(yīng)的動物模型是研究藥物抗炎作用的必要過程。該模型的建立與抗炎藥的療效評價有關(guān)[16]。在篩選抗炎藥物時，一般選用以血管通透性為主要變化的急性炎癥模型進(jìn)行評價[17]。二甲苯致耳腫脹模型具有操作簡單、穩(wěn)定性好、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點，是國內(nèi)外常用的抗炎機(jī)制模型[17]。二甲苯的作用機(jī)理是能增加毛細(xì)血管的通透性，使?jié)B入組織的液體增多，肉眼可見紅腫現(xiàn)象。

周霄楠等[18]研究觀察青黛散水煎液對體內(nèi)炎癥過程的影響，采用二甲苯致小鼠耳腫脹模型及棉球肉芽腫模型,試驗結(jié)果顯示，陽性對照組與青黛散高、低劑量(48 mg/20 g,12 mg/20 g)組的小鼠耳腫脹度均小于對照組，且差異顯著(P<0.05)。蔣吉鋒等[19]研究楊桃水提物對小鼠的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹來建立炎癥模型進(jìn)行藥物抗炎作用的檢測，試驗結(jié)果顯示，與空白對照組相比，楊桃水提物可明顯抑制二甲苯所致小鼠耳廓的腫脹度。賈小舟等[20]檢測鹽知母多糖的抗炎作用活性，建立二甲苯致小鼠耳腫脹模型，觀察鹽知母多糖對模型小鼠耳腫脹度、血清細(xì)胞因子分泌及HE染色切片，結(jié)果顯示鹽知母多糖能夠顯著降低模型小鼠耳腫脹度、血清IL-1β、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子含量，表現(xiàn)出良好的抗炎活性。賽福丁·阿不拉等[21]研究小檗果提取物的抗炎功效，采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹法觀察抗炎作用,結(jié)果顯示，與模型組相比，小檗果水提物和醇提物低劑量組明顯抑制二甲苯所致小鼠耳廓腫脹(P<0.01)。

本研究結(jié)果顯示，石榴花水提物50，100，500 g/L劑量對二甲苯所致耳腫脹均有一定的抑制作用；抑制率分別為36%，57%，71%。中、高劑量組相對模型組和陽性藥物地塞米松組能夠顯著降低血清IL-6、TNF-α的分泌量(P<0.05)；HE染色切片結(jié)果顯示，中、高劑量石榴花水提物組中嗜中性粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞相對模型組明顯減少，腫脹度明顯減輕。上述結(jié)果表明，中、高劑量石榴花水提物能夠明顯降低二甲苯所致小鼠耳腫脹程度、改善血液中免疫細(xì)胞因子水平，同時可以減少炎性細(xì)胞的浸潤，表現(xiàn)出了良好的抗炎活性，結(jié)合檢測石榴花水提物有效成分結(jié)果可判斷，其中多糖和多酚為石榴花中抗炎活性成分可能性最大。

綜上所述，石榴花水提物活性成分檢測及對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響結(jié)果可知，石榴花水提物能夠有效抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹程度，具有良好抗炎活性，其中發(fā)揮活性藥效成分為多糖和多酚可能性最大，但具體活性成分還沒得到證實，有待進(jìn)一步研究。