酶解對(duì)猴頭菇多糖結(jié)構(gòu)特征及免疫活性的影響

余蕊宏,孫夢(mèng)珂，雷 博，陳仕雄，張浚文，劉曉盼，任 喆，黃一帆，秦 韜 (福建農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院) 福建省獸醫(yī)中藥與動(dòng)物保健重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

猴頭菇(Hericiumerinaceus)屬擔(dān)子菌綱、多孔菌目、猴頭屬，是一種傳統(tǒng)的食用菌和藥用菌，具有滋補(bǔ)身體、助消化等功效[1]。多糖(polysaccharide)作為猴頭菇中的主要活性成分之一，是一類(lèi)廣泛存在于動(dòng)植物中的天然高分子活性物質(zhì)[2]。大量研究表明，猴頭菇多糖(Hericiumerinaceuspolysaccharide,HEP)具有增強(qiáng)免疫力[3]、抗氧化[4]、降血脂[5]等生理功能，具有較高的藥用價(jià)值和保健價(jià)值。

多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，包括相對(duì)分子質(zhì)量、構(gòu)象、糖鏈類(lèi)型等[6]。相對(duì)分子質(zhì)量是影響多糖物理特性和生理活性的主要因素[7]，不同相對(duì)分子質(zhì)量的多糖具有不同的結(jié)構(gòu)特征及功能特性，但大相對(duì)分子質(zhì)量的多糖由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜、水溶性差等缺點(diǎn)，極大地限制了多糖的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)降解后的多糖，其相對(duì)分子質(zhì)量和黏度均得到降低，往往表現(xiàn)出更強(qiáng)的生物活性[8]。酶解法是多糖降解的一種常見(jiàn)方法，主要通過(guò)改變分子的結(jié)構(gòu)特征來(lái)提高其生物活性，具有專(zhuān)一性強(qiáng)、高效性、降解條件溫和等優(yōu)點(diǎn)[9]。目前，國(guó)內(nèi)外研究表明[10-11]，酶解修飾不僅可以改變多糖的相對(duì)分子質(zhì)量大小，還可以顯著增強(qiáng)其生物活性，但關(guān)于猴頭菇酶解多糖(enzymatic hydrolysis ofHericiumerinaceuspolysaccharide,EHEP)的生物活性尚不清楚。

巨噬細(xì)胞(macrophages)屬于免疫細(xì)胞，具有識(shí)別、吞噬及清除病原微生物和凋亡的機(jī)體細(xì)胞，是機(jī)體抵抗感染的第1道防線(xiàn)[12]。當(dāng)病原微生物等外源物質(zhì)侵入機(jī)體時(shí)，巨噬細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量具有生物活性的分子，比如一氧化氮(NO)、活性氧和細(xì)胞免疫因子等[13]，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。鑒于巨噬細(xì)胞在機(jī)體免疫系統(tǒng)中的重要地位，本研究采用酶解法制備EHEP，以巨噬細(xì)胞RAW 264.7為靶細(xì)胞，深入研究EHEP對(duì)巨噬細(xì)胞的生物學(xué)功能及其在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中的作用，為酶解多糖的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料HEP由實(shí)驗(yàn)室制備[14](糖含量為81.3%)；內(nèi)切-1,5-α-阿拉伯聚糖酶(10 U/mg)購(gòu)自Megazyme公司；PBS緩沖液購(gòu)自Solarbio公司；DMEM培養(yǎng)液和雙抗(青、鏈霉素)均購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司；NO檢測(cè)試劑盒和噻唑藍(lán)(MTT)均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜(DMSO)、脂多糖(LPS)、FITC-dextran均購(gòu)自Sigma公司；FITC-CD40和FITC-CD86抗體均購(gòu)自eBioscience公司。

1.2 主要儀器ABT 320-4M電子天平購(gòu)自科恩公司；真空冷凍干燥機(jī)購(gòu)自CHRiST公司；傅里葉紅外光譜儀、Multiskan Mk3酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo公司；臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)自BECKMAN公司；NovoCyte流式細(xì)胞儀購(gòu)自艾森生物有限公司；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自西德Haraneus公司。

1.3 EHEP的制備用pH 4.0的緩沖液將內(nèi)切-1,5-α-阿拉伯聚糖酶配制成質(zhì)量濃度為5 g/L的酶溶液，同法配制4 g/L的HEP溶液，再按酶溶液:HEP溶液體積比1∶10的比例混勻。靜置5 min后，40℃反應(yīng)1 h，沸水浴10 min后靜置1 h，4 000 r/min離心10 min，收集上清液置于100～500 kDa透析袋中透析。24 h后，冷凍干燥，即得EHEP。

1.4 相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定將質(zhì)量濃度為1 g/L的HEP與EHEP溶液，通過(guò)高效凝膠色譜法測(cè)定其相對(duì)分子質(zhì)量。色譜條件為：色譜柱選用安捷倫KS-805、KS-804和KS-802三根串聯(lián)，流動(dòng)相為雙蒸水，流速為1 mL/min，檢測(cè)器為安捷倫1260 Infinity液相色譜儀配示差折光檢測(cè)器，柱溫為70℃，檢測(cè)器溫度為50℃。

1.5 紅外光譜分析稱(chēng)取1 mg的HEP和EHEP樣品，分別與100 mg KBr粉末混合，研磨均勻后壓片。將制好的壓片放入紅外光譜儀內(nèi)進(jìn)行掃描，掃描范圍為4 000～400 cm-1，并對(duì)所得的紅外吸收?qǐng)D譜進(jìn)行分析。

1.6 掃描電鏡分析取少量HEP和EHEP分別黏在帶有導(dǎo)電膠的處理片上，用洗耳球吹去浮樣，經(jīng)噴金處理后，置于掃描電鏡的樣品室中掃描分析，觀察HEP與EHEP的表面形貌。

1.7 原子力電鏡分析將樣品HEP和EHEP分別配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的溶液，滴在新剝離的云母片上，經(jīng)氮?dú)飧稍锖蟊恢糜谠恿︼@微鏡上觀測(cè)。

1.8 HEP和EHEP對(duì)RAW 264.7細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性

1.8.1RAW 264.7細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW 264.7采用DMEM完全培養(yǎng)液(含10% FBS、1%雙抗)于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)80%以上時(shí)，PBS洗滌2次，加入0.25%的胰蛋白酶作用30 s，最后用DMEM完全培養(yǎng)液終止消化，并接種于新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.8.2MTT法檢測(cè)RAW 264.7細(xì)胞的增殖活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期的RAW 264.7細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞密度為1×105/mL，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入含有HEP和EHEP的培養(yǎng)液(終質(zhì)量濃度為0.391，0.781，1.563，3.125，6.250，12.500，25.000 mg/L)，另設(shè)空白組。孵育24 h 后，除去上清后，每孔加入10 μL MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)孵育4 h后，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min使沉淀完全溶解，最后于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定490 nm處的D值，并計(jì)算細(xì)胞增殖率。

細(xì)胞增殖率=加藥組D值/空白組D值×100%。

1.8.3試驗(yàn)分組 根據(jù)1.8.2中RAW 264.7細(xì)胞增殖的試驗(yàn)結(jié)果，分為以下4組：Blank組、LPS組(1 mg/L)、HEP組(0.391～6.250 mg/L)、EHEP(0.391～6.250 mg/L)。

1.8.4RAW 264.7細(xì)胞表面分子CD40和CD86的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期的RAW 264.7細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞密度為1×106/mL，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入含有HEP和EHEP的培養(yǎng)液(終質(zhì)量濃度為0.391，0.781，1.563，3.125，6.250 mg/L)。孵育24 h后，收集上清液備用，用PBS清洗2次，每孔各加入1 μL FITC-CD40和FITC-CD86，4℃避光孵育30 min后，PBS清洗2次，棄上清，用500 μL PBS重懸后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8.5RAW 264.7細(xì)胞吞噬功能的檢測(cè) 參照1.8.4方法接種細(xì)胞于6孔板中。孵育24 h后，收集上清液備用，并用PBS清洗2次，每孔加入400 μL FITC-dextran，37℃避光孵育30 min后，加入PBS清洗3次，棄上清，用500 μL PBS重懸后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8.6NO的測(cè)定 收集1.8.4或1.8.5中各組的細(xì)胞上清液，每組取出50 μL上清液轉(zhuǎn)移至另一新的96孔板中，并用完全培養(yǎng)液稀釋NaNO2標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為0，10，20，40，60，80,100 mg/L。在各孔中依次加入Griess Reagent Ⅰ、Griess Reagent Ⅱ試劑后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)540 nm波長(zhǎng)處的D值。最后，以NaNO2標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，D值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算出各組上清液中NO的含量。

2 結(jié)果

2.1 HEP和EHEP的相對(duì)分子質(zhì)量分析多糖相對(duì)分子質(zhì)量的大小是影響其生物活性的主要因素之一，不同相對(duì)分子質(zhì)量的多糖具有不同的生物活性，因此采用高效凝膠色譜法測(cè)定HEP和EHEP的相對(duì)分子質(zhì)量。葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=53.9-8.3x+0.53x2-0.015x3+0.000 17x4，將HEP和EHEP的洗脫體積代入到方程中，得到HEP的相對(duì)分子質(zhì)量為4.3×104kDa，EHEP的相對(duì)分子質(zhì)量為1.25×104kDa。

2.2 HEP和EHEP的紅外光譜分析紅外光譜可用于來(lái)鑒定化合物和官能團(tuán)結(jié)構(gòu)。如圖1所示，HEP與EHEP都包含3 600～3 200 cm-1的O-H吸收峰以及3 000～2 800 cm-1和1 410 cm-1的C-H伸縮振動(dòng)和變角振動(dòng)特征吸收峰[4]，這3種峰均屬于多糖的特征峰，表明HEP與EHEP均為多糖類(lèi)物質(zhì)。HEP和EHEP分別在1 573.55，1 572.99 cm-1處有吸收峰，可能是有結(jié)晶水的存在；在575.85，620.39 cm-1的吸收峰表明HEP和EHEP均具有α-糖苷鍵。1 200～1 000 cm-1范圍出現(xiàn)的吸收峰是由于C-OH的變角振動(dòng)引起的。與HEP紅外圖譜相比[4]，EHEP在928.03 cm-1處有吸收峰，此峰屬于β型吡喃糖伸縮振動(dòng)峰。

A.HEP紅外譜圖；B.EHEP紅外譜圖圖1 HEP和EHEP的紅外譜圖

2.3 HEP和EHEP的掃描電鏡和原子力電鏡分析掃描電鏡和原子力電鏡能觀察到多糖的微觀形貌，進(jìn)一步分析多糖的結(jié)構(gòu)特征。HEP和EHEP的掃描電鏡圖如圖2A所示，HEP的形態(tài)呈塊狀，菱角分明且表面光滑；EHEP呈不規(guī)則的形態(tài)，凹凸不平且表面粗糙，同時(shí)還出現(xiàn)帶裂痕的褶皺形貌。HEP和EHEP的原子力電鏡觀察結(jié)果如圖2B所示，兩者的空間結(jié)構(gòu)均呈近似紡錘體形狀[4]，且緊密排列在一起。HEP的高度范圍為-10.1～9.5 nm，EHEP的高度范圍為-10.3～10.7 nm。

A.掃描電鏡圖；B.原子力電鏡圖圖2 HEP和EHEP的掃描電鏡圖和原子力電鏡圖

2.4 HEP和EHEP對(duì)RAW 264.7細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性

2.4.1細(xì)胞增殖活性 MTT法是一種快速簡(jiǎn)單檢測(cè)細(xì)胞增殖率的方法，可根據(jù)D值來(lái)判斷細(xì)胞的活性，從而間接反映細(xì)胞的增殖能力。由圖3可知，HEP和EHEP分別在0.391～3.125，0.391～25.000 mg/L質(zhì)量濃度范圍的內(nèi)細(xì)胞增殖率均顯著高于空白組(P<0.05)，且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，表明0.391～3.125 mg/L HEP和0.391～25.000 mg/L EHEP均可以顯著促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞的增殖(P<0.05)。而當(dāng)HEP的質(zhì)量濃度增加至12.500，25.000 mg/L時(shí)，細(xì)胞的增殖率均顯著低于空白組(P<0.05)。

小寫(xiě)字母相同的表示差異不顯著(P>0.05)，不同的表示差異顯著(P<0.05)。下同圖3 HEP和EHEP對(duì)RAW 264.7細(xì)胞增殖的影響

2.4.2細(xì)胞表面分子CD40和CD86的表達(dá) CD40和CD86屬于免疫球蛋白超家族成員，在刺激T細(xì)胞活化的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)量的多少與巨噬細(xì)胞的抗原提呈能力有著密切聯(lián)系。如圖4，5所示，HEP和EHEP均可以顯著促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞表面分子CD40和CD86的表達(dá)(P<0.05)，且呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)。從圖4A，B中可以看出，在0.391～6.250 mg/L質(zhì)量濃度范圍，HEP與EHEP的CD40表達(dá)率均顯著高于空白組(P<0.05)，且EHEP組的CD40表達(dá)率顯著高于同等劑量下HEP組的表達(dá)率(P<0.05)，以6.250 mg/L EHEP的CD40的表達(dá)率最高，為14.8%。從圖5A，B中可以看出，在0.391～6.250 mg/L質(zhì)量濃度范圍，HEP與EHEP的CD86表達(dá)率均顯著高于空白組(P<0.05)，以6.250 mg/L EHEP的CD86的表達(dá)率最高，為19.8%。結(jié)果表明，與HEP相比，EHEP更能增強(qiáng)RAW 264.7細(xì)胞表面分子CD40和CD86表達(dá)的能力。

圖4 HEP和EHEP對(duì)RAW 264.7細(xì)胞表面分子CD40表達(dá)的影響

圖5 HEP和EHEP對(duì)RAW 264.7細(xì)胞表面分子CD86表達(dá)的影響

2.4.3細(xì)胞吞噬活性 吞噬能力是衡量巨噬細(xì)胞活性的一個(gè)指標(biāo)，活化后的巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的吞噬能力，可通過(guò)吞噬侵入的病原體來(lái)提高機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用。由圖6可知，HEP與EHEP在0.391～6.250 mg/L 的劑量范圍內(nèi)均能不同程度增強(qiáng)RAW 264.7細(xì)胞的吞噬能力。與空白組相比，0.391，0.781，1.563，6.250 mg/L HEP的吞噬率均顯著升高(P<0.05)；0.391～6.250 mg/L EHEP的吞噬率均顯著升高(P<0.05)。與HEP組相比，0.391 mg/L EHEP的吞噬率顯著高于HEP組中所有劑量下的吞噬率(P<0.05)。結(jié)果表明，EHEP在促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞吞噬活性方面優(yōu)于HEP。

圖6 HEP和EHEP對(duì)RAW 264.7細(xì)胞吞噬功能的影響

2.4.4NO含量 NO即是一種非特異性免疫的免疫分子，也是調(diào)節(jié)獲得性免疫的信使分子，在特異性免疫中發(fā)揮重要作用。NO是巨噬細(xì)胞發(fā)揮吞噬作用的基本條件，其分泌量的多少與巨噬細(xì)胞的吞噬能力呈正比。由圖7可知，HEP及EHEP在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均可促使RAW 264.7細(xì)胞釋放NO的量增加，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)性。隨著質(zhì)量濃度的增加，HEP對(duì)細(xì)胞釋放NO的量逐漸減少，當(dāng)HEP的質(zhì)量濃度增加至3.125，6.250 mg/L時(shí)，NO的含量與空白組相比顯著降低(P<0.05)，而EHEP隨著質(zhì)量濃度的增加對(duì)細(xì)胞釋放NO的量逐漸增多，當(dāng)EHEP質(zhì)量濃度增加至6.250 mg/L時(shí)，NO的釋放量最高，為14.63 mg/L，且顯著高于HEP組中所有劑量下的NO含量(P<0.05)。

圖7 HEP和EHEP對(duì)RAW 264.7細(xì)胞生成NO含量的影響

3 討論

HEP是猴頭菇中分離出的一種具有天然活性的物質(zhì)[15]，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等[16-18]作用，但其相對(duì)分子質(zhì)量較高，不利于細(xì)胞等生物體的吸收[19]。有研究表明[10-11]，酶解法降解后的多糖具有較強(qiáng)的生物活性。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)EHEP能促進(jìn)RAW 264.7巨噬細(xì)胞分泌NO、CD40和CD86，同時(shí)還能增強(qiáng)細(xì)胞的吞噬功能，因此可將EHEP作為潛在的免疫增強(qiáng)劑。

眾所周知，多糖的結(jié)構(gòu)特征與其生物活性具有密切關(guān)系，不同種類(lèi)的多糖具有不同的結(jié)構(gòu)，因此活性也存在較大的差異。相對(duì)分子質(zhì)量是其具備生物活性的必要條件，多糖具有一定的相對(duì)分子質(zhì)量范圍，一般認(rèn)為相對(duì)分子質(zhì)量在10～500 kDa之間能保持最大活性[20]。若相對(duì)分子質(zhì)量太大，則不利于其跨越細(xì)胞膜進(jìn)入生物體內(nèi)發(fā)揮生物活性作用；若相對(duì)分子質(zhì)量過(guò)低，則無(wú)法形成產(chǎn)生活性的高級(jí)聚合結(jié)構(gòu)[19]。本研究結(jié)果顯示，采用內(nèi)切-1,5-α-阿拉伯聚糖酶對(duì)HEP進(jìn)行酶解修飾后，EHEP的相對(duì)分子質(zhì)量為1.25×104kDa。在前期的研究中[4]，HEP的相對(duì)分子質(zhì)量為4.3×104kDa，由此可以得出酶解修飾降低了HEP的相對(duì)分子質(zhì)量，這與REN等[11]的研究結(jié)果一致。我們推測(cè)可能是酶解斷裂了HEP的糖鏈，進(jìn)一步改變了其空間結(jié)構(gòu)，從而降低HEP的相對(duì)分子質(zhì)量。與HEP的紅外光譜相比[4]，EHEP在HEP的峰值處均有吸收峰，但在575.85 cm-1處不具有吸收峰，而在928.03 cm-1處具有吡喃環(huán)的特征吸收峰，表明酶解對(duì)HEP的官能團(tuán)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響。HEP的掃描電鏡圖顯示[4]，其形貌棱角分明且表面光滑。在本試驗(yàn)中，EHEP呈現(xiàn)出凹凸不平的褶皺形貌，且表面變得粗糙。HEP屬于天然高分子多糖，糖鏈間通過(guò)氫鍵交聯(lián)，經(jīng)過(guò)酶解后，導(dǎo)致糖鏈間氫鍵交聯(lián)密度變小，疇結(jié)構(gòu)變大，從而導(dǎo)致表面粗糙度增加，這與報(bào)道結(jié)果一致[21]。HEP的原子力顯微鏡圖顯示[4]，HEP的分子鏈高度為-10.3～10.7 nm，而本研究中EHEP的高度低于HEP，為-10.1～9.5 nm，與秦利鴻等[22]研究結(jié)果一致。多糖的生物活性是各級(jí)結(jié)構(gòu)之間以及各種理化性質(zhì)之間相互制約而產(chǎn)生的綜合效應(yīng)[23]，AIPIRE等[24]研究表明，烏拉爾甘草多糖是含有α、β糖苷鍵的多糖，其相對(duì)分子質(zhì)量為1.49×104Da，具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用，這與EHEP的結(jié)構(gòu)特征類(lèi)似，表明EHEP活性的增強(qiáng)與其各級(jí)結(jié)構(gòu)的改變以及相互交聯(lián)有關(guān)。

MTT法可用于檢測(cè)細(xì)胞活性的強(qiáng)弱，細(xì)胞的增殖活性與吸光度成正比[25]。因此，確定細(xì)胞的安全質(zhì)量濃度對(duì)于后續(xù)的研究具有重要作用。在本試驗(yàn)中，0.391～3.125 mg/L HEP和0.391～25.000 mg/L EHEP均可以顯著促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞的增殖(P<0.05)，為保證試驗(yàn)在同一水平上比較，取0.391，0.781，1.563，3.125，6.250 mg/L 5個(gè)劑量考察HEP和EHEP對(duì)RAW 264.7細(xì)胞的免疫活性作用。

巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，主要通過(guò)吞噬作用清除侵入體內(nèi)的病原微生物，在防御感染、自身穩(wěn)定和免疫監(jiān)視中都起著重要的作用[26]。研究發(fā)現(xiàn)[27]，多糖具有增強(qiáng)免疫如活化巨噬細(xì)胞的功能，活化的巨噬細(xì)胞可分泌NO、CD40和CD86等從而調(diào)節(jié)免疫作用。NO即是免疫分子又是信使分子，在非特異性免疫和特異性免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，HEP和EHEP均能促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞NO的釋放。與HEP相比，0.391～6.250 mg/L EHEP的NO釋放量均顯著高于同等劑量下HEP的NO釋放量(P<0.05)，表明EHEP比HEP更能促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞的活化，這與REN等[28]的研究結(jié)果一致。細(xì)胞表面共刺激因子在細(xì)胞免疫應(yīng)答中起著重要的作用，而CD分子的活性可以反映出免疫細(xì)胞的活化程度，如CD40和CD86。CD40是細(xì)胞表面的糖蛋白，主要參與B細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化[29]，CD86是CD80的配體，能夠和CD80一起調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化，在免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)中起著重要作用[30]。在本試驗(yàn)中，與空白組相比，HEP和EHEP均能促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞表面因子CD40和CD86的表達(dá)。6.250 mg/L EHEP的CD40、CD86表達(dá)率最高，且顯著高于除LPS之外的其他各組(P<0.05)。由此可以得出，EHEP對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用更強(qiáng)。

吞噬作用是巨噬細(xì)胞最重要的功能，可通過(guò)吞噬作用將病原微生物清除并維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，其吞噬作用的強(qiáng)弱反映了免疫活性的高低、也可以反映其活化的程度[31]。多糖通過(guò)活化巨噬細(xì)胞，使其吞噬功能增強(qiáng)，從而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，HEP和EHEP均能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，但EHEP表現(xiàn)出更強(qiáng)的吞噬作用，這與CHENG等[32]的研究報(bào)道一致。

綜上所述，本研究采用內(nèi)切-1,5-α-阿拉伯聚糖酶對(duì)HEP進(jìn)行酶解修飾，HEP與EHEP作用于巨噬細(xì)胞后，EHEP表現(xiàn)出更強(qiáng)的免疫活性，可顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的增殖率，提高細(xì)胞表面分子CD40、CD86的表達(dá)及吞噬作用，由此可以得出酶解修飾能夠顯著提高HEP的體外免疫活性，這可能與相對(duì)分子質(zhì)量的降低以及空間結(jié)構(gòu)的變化存在一定的關(guān)系[33-34]，但其作用機(jī)制還有待于深入研究。