脂肪變性對(duì)蛋雞原代肝細(xì)胞相關(guān)炎性因子表達(dá)的影響

郭連營(yíng)，黃 橙，劉 平，莊 煜，胡國(guó)良，郭小權(quán) (江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 江西省畜禽疫病診斷與防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330045)

蛋雞脂肪肝出血綜合征(fatty liver hemorrhage syndrome，F(xiàn)LHS)是一種以脂質(zhì)蓄積引起肝臟脂肪變性為特征的營(yíng)養(yǎng)代謝病，在養(yǎng)殖業(yè)中易造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境、遺傳等是其形成的主要因素[1-2]。FLHS的發(fā)病機(jī)制尚未完全解釋，但游離脂肪酸增多，肝臟脂質(zhì)代謝紊亂是其形成的主要機(jī)理[3-4]。在肝細(xì)胞中，游離脂肪酸可通過(guò)一系列反應(yīng)合成甘油三脂(TG)。隨著TG在肝臟的逐漸堆積、肝臟對(duì)脂肪酸的β氧化能力的減弱以及脂質(zhì)過(guò)氧化程度的增強(qiáng)導(dǎo)致肝臟抗氧化能力減弱，細(xì)胞活性氧(ROS)的生成增加觸發(fā)炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生。當(dāng)?shù)半u發(fā)生FLHS時(shí)，肝臟脂肪蓄積，同時(shí)引起細(xì)胞因子和炎癥物質(zhì)的產(chǎn)生，因此進(jìn)一步研究炎癥介質(zhì)和FLHS引起的脂肪變性發(fā)生的關(guān)系，對(duì)FLHS進(jìn)行早期干預(yù)和靶向治療具有一定意義。

目前，對(duì)于蛋雞FLHS的研究多基于通過(guò)飼喂特殊飼料飲食、藥物、基因改造等方法構(gòu)建的動(dòng)物模型，但動(dòng)物模型的建立存在一定的缺點(diǎn)，如研究周期長(zhǎng)、存在個(gè)體差異等；而構(gòu)建體外肝細(xì)胞模型，具有環(huán)境可控、試驗(yàn)時(shí)間短、節(jié)約試驗(yàn)成本、個(gè)體樣本與試驗(yàn)批次之間的誤差小、針對(duì)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[5]。其中相對(duì)于細(xì)胞系，原代肝細(xì)胞培養(yǎng)雖有難度但可保持正常的細(xì)胞形態(tài)更能反應(yīng)生物體內(nèi)壞境，獲得的數(shù)據(jù)具有更好相關(guān)性等特點(diǎn)[6]。

本研究通過(guò)提取高產(chǎn)蛋雞原代肝細(xì)胞利用油酸/棕櫚酸誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h建立FLHS細(xì)胞模型，同時(shí)觀察脂肪酸引起肝細(xì)胞炎癥通路和脂肪代謝變化，以揭示脂肪變性對(duì)蛋雞原代肝細(xì)胞相關(guān)炎性因子表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物34～40周齡海蘭褐蛋雞購(gòu)自江西省吉安市某蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 主要試劑及儀器胎牛血清(Biological Industries公司)，油酸(Sigma公司)，DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液、PBS緩沖液(Hyclone公司)，Ⅳ型膠原酶、青鏈霉素(100×)、L-谷氨酰胺、維生素C、轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛源胰島素、棕櫚酸、牛血清白蛋白(不含脂肪酸)、戊巴比妥鈉、肝素鈉、油紅O染色液、曲拉通Triton X-100均購(gòu)自Solarbio公司。ROS、丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)康寧公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，顯微鏡(日本Nikon公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Thermo公司)。

1.3 蛋雞原代肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)蛋雞原代肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[7-8]的方法進(jìn)行。將提取的雞原代肝細(xì)胞以1×106/mL的濃度接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將細(xì)胞置于37℃、飽和濕度、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每24 h換液1次。

1.4 蛋雞原代肝細(xì)胞FFA模型的構(gòu)建當(dāng)細(xì)胞貼壁至70%時(shí)(約24 h)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液，換成無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h，使細(xì)胞均一化。之后再次換液，正常組(Con組)為無(wú)血清貼壁培養(yǎng)液，脂肪肝造模組(FFA組)為添加1 mmol/L油酸/棕櫚酸(2∶1)的貼壁培養(yǎng)液，造模培養(yǎng)24 h。

1.5 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)新鮮分離的肝細(xì)胞在培養(yǎng)24 h時(shí)以及在添加FFA造模后24 h的細(xì)胞置于倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.6 抗氧化指標(biāo)及ROS的測(cè)定肝細(xì)胞中MDA含量、CAT和 SOD活力的測(cè)定按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。細(xì)胞中ROS的測(cè)定按照試劑盒說(shuō)明書操作，流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)500 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm處測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光值。

1.7 油紅染色按照油紅O染色(細(xì)胞專用)說(shuō)明書進(jìn)行操作，棄掉經(jīng)過(guò)FFA誘導(dǎo)處理后24 h的細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS清洗2次，用10%多聚甲醛固定15～25 min，棄固定液，用雙蒸水潤(rùn)洗2次，加入60%異丙醇溶液作用5 min后棄去，加入油紅染色液浸染10～20 min，棄油紅染液，利用60%異丙醇和雙蒸水清洗多次去掉浮色，加入Mayer蘇木精染色浸染5 min用雙蒸水洗掉浮色，1%鹽酸溶液藍(lán)化，雙蒸水清洗至無(wú)多余染液，晾干，封片，顯微鏡下觀察。

1.8 炎性相關(guān)因子的測(cè)定將FFA誘導(dǎo)處理以及正常培養(yǎng)的細(xì)胞，棄上清后，向每組培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞6孔板中每孔分別加入1 mL TRIzol試劑收集細(xì)胞樣品至相應(yīng)的離心管中，分別提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定其mRNA的濃度，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，采用SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)相關(guān)炎性因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)、γ-干擾素(IFN-γ)、IL-18、IL-1β、IL-8、IL-2的表達(dá)量。根據(jù)GenBank中TNF-α、IFN-γ、IL-18、IL-1β、IL-8、IL-2 mRNA序列和引物涉及原則，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，熒光定量PCR反應(yīng)體系為10 μL，反應(yīng)程序：95℃ 30 s;95℃ 5 s，62℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。采用ABI 7500 Real-time PCR system PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)進(jìn)行熒光定量PCR。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析對(duì)每組細(xì)胞6孔板中的6個(gè)樣品分別收集進(jìn)行各指標(biāo)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的測(cè)定。用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，運(yùn)用ANOVA檢驗(yàn)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05表示試驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異顯著，P<0.01表示試驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 原代肝細(xì)胞形態(tài)觀察及脂肪變性模型建立結(jié)果如圖1A所示，正常肝細(xì)胞在培養(yǎng)24 h時(shí)呈多邊形，接連成片，排列緊密，常見(jiàn)雙核，呈現(xiàn)典型的上皮細(xì)胞形態(tài)。在添加油酸/棕櫚酸培養(yǎng)24 h的FFA組細(xì)胞(圖1B)，細(xì)胞內(nèi)脂滴逐漸蓄積呈明顯的空泡化現(xiàn)象，但視野中細(xì)胞核清晰可見(jiàn)。

A.Con組；B.FFA組圖1 24 h肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(200×)

2.2 油紅O染色觀察正常組細(xì)胞僅見(jiàn)少量橘紅色脂滴，F(xiàn)FA組細(xì)胞可見(jiàn)大量紅色脂滴甚至出現(xiàn)脂滴融合現(xiàn)象，細(xì)胞核呈藍(lán)色(圖2)。

2.3 肝細(xì)胞的氧化損傷和抗氧化能力流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示(圖3)，與Con組相比，F(xiàn)FA組細(xì)胞內(nèi)ROS水平呈極顯著上升(P<0.01)。FFA組細(xì)胞內(nèi)MDA含量極顯著升高(P<0.01)；CAT和SOD活力顯著下降(P<0.05)。

A.ROS含量；B.MDA含量；C.CAT活性；D.SOD活性圖3 油酸/亞油酸誘導(dǎo)24 h肝細(xì)胞抗氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

2.4 炎性基因的表達(dá)與對(duì)照組(Con組)相比，抑炎因子IL-2在FFA組的表達(dá)量顯著下降，促炎因子IL-18、IL-8、IL-1β、TNF-α、IFN-γ的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，其中IL-18、IFN-γ的表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組，IL-1β的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(圖4)。

A.IL-2;B.IL-18;C.IFN-γ;D.TNF-α;E.IL-8;F.IL-1β圖4 油酸/亞油酸誘導(dǎo)脂肪變性對(duì)相關(guān)炎癥因子表達(dá)的影響

3 討論

本研究采用的改良原位二步灌流法提取蛋雞原代肝細(xì)胞,并利用油酸/棕櫚酸誘導(dǎo)脂質(zhì)變性是根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期試驗(yàn)積累、對(duì)肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)以及肝細(xì)胞功能分析后確定的[7-8]，可使肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積，造成脂肪變性以模擬蛋雞體內(nèi)肝臟脂肪變性的情況。本試驗(yàn)中，經(jīng)油酸/棕櫚酸誘導(dǎo)24 h的原代肝細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞脂肪空泡化嚴(yán)重，油紅染色結(jié)果可見(jiàn)明顯增多的橘紅色脂滴，表明肝細(xì)胞脂肪變性模型成功建立。

氧化應(yīng)激反映了機(jī)體ROS等自由基的產(chǎn)生與抗氧化系統(tǒng)清除能力之間的一種不平衡狀態(tài)[9]。線粒體是ROS主要生成部位，線粒體功能障礙可導(dǎo)致ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生，影響抗氧化酶的活性，造成氧化應(yīng)激[10-11]。SOD、CAT和MDA因?yàn)槟芮宄齊OS或間接反映損傷程度而常被用于檢測(cè)機(jī)體抗氧化能力。SOD可將超氧陰離子O2·-轉(zhuǎn)化為H2O2，而CAT可將H2O2解離為H2O。MDA作為細(xì)胞脂質(zhì)氧化的產(chǎn)物，反映了氧化應(yīng)激的狀態(tài)。在本試驗(yàn)中FFA組ROS含量顯著高于Con組，MDA含量極顯著升高，CAT和SOD活力顯著降低，表明油酸/棕櫚酸誘導(dǎo)的脂肪變性引起肝細(xì)胞線粒體功能障礙繼而引起ROS生成增多、抗氧化能力降低引起脂質(zhì)過(guò)氧化導(dǎo)致肝細(xì)胞氧化應(yīng)激，從而造成肝細(xì)胞損傷。

相關(guān)研究表明ROS在促炎反應(yīng)中起重要作用，可間接引起促炎細(xì)胞因子IL-18、IL-1β和TNF-α的分泌[12-14]，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生炎性浸潤(rùn)和壞死。IL-18可由肝臟Kupffer細(xì)胞和損傷肝細(xì)胞合成，是重要的前炎癥細(xì)胞因子，其參與的炎癥反應(yīng)也是介導(dǎo)肝損傷的重要媒介，是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中致肝細(xì)胞損傷的關(guān)鍵因子[15]。IL-18在參與誘導(dǎo)細(xì)胞因子IFN-γ分泌的同時(shí)也可產(chǎn)生大量的TNF-α、IL-8、IL-1β等炎性細(xì)胞因子，從而加劇代謝紊亂及免疫功能損傷[16]。IL-1β作為一種促炎因子，除參與組織炎癥反應(yīng)外，還可抑制肝細(xì)胞對(duì)TG等脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，脂質(zhì)通過(guò)過(guò)氧化反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞受損，引起組織炎癥和細(xì)胞凋亡。本研究FFA組細(xì)胞中IL-18、IFN-γ、IL-1β的表達(dá)量顯著升高，與之前的研究結(jié)果相似[17-19]，表明油酸/棕櫚酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變性造成肝細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激進(jìn)而促發(fā)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

TNF-α可減弱肝細(xì)胞線粒體呼吸功能，降低線粒體跨膜電位和內(nèi)外膜間的通透轉(zhuǎn)換孔道開放，是介導(dǎo)早期肝損傷反應(yīng)的一種主要炎癥因子[20]。IL-8 是一種具有趨化和激活中性粒細(xì)胞功能的炎癥趨化因子可使中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶釋放，生成活性氧化代謝產(chǎn)物，引起炎癥細(xì)胞積聚并引發(fā)炎性反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體內(nèi)肝臟脂質(zhì)蓄積和內(nèi)毒素水平升高時(shí)，將刺激促炎細(xì)胞因子TNF-α的釋放和IL-8生成并參與肝臟細(xì)胞的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加劇肝臟細(xì)胞損傷[21]。在本研究中也得出相似的結(jié)果,TNF-α，IL-8表達(dá)量均高于對(duì)照組。

同時(shí)，與對(duì)照組比較，本試驗(yàn)中炎性細(xì)胞因子IL-2在FFA組中表達(dá)水平顯著降低，這一結(jié)果與BEN等[22]的研究中IL-2作為抗炎因子結(jié)果相似。IL-2表達(dá)量顯著下降表明機(jī)體對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制作用降低，從而加快了炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，促使炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加重。但也有相關(guān)研究表明IL-2在非酒精性脂肪肝患者(NAFLD)體內(nèi)表達(dá)量上升[23-24]，這可能與IL-2作為一種多效細(xì)胞因子其具有抗炎和促炎特性有關(guān)[25-26]。總之，在本研究中利用油酸/棕櫚油酸構(gòu)建了蛋雞肝細(xì)胞脂肪變性模型，發(fā)現(xiàn)FFA組中炎癥因子IL-18、TNF-α、IL-8、IFN-γ、IL-1β的表達(dá)量增加，而抗炎因子IL-2表達(dá)量顯著降低，說(shuō)明油酸/棕櫚酸處理蛋雞原代肝細(xì)胞不僅導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪沉積與脂肪變性，還可誘發(fā)肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)繼而引起肝細(xì)胞損傷。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)利用油酸/棕櫚酸誘導(dǎo)蛋雞原代肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性后，肝細(xì)胞線粒體功能代謝障礙產(chǎn)生大量ROS，抗氧化能力減弱引起氧化應(yīng)激的增強(qiáng)，最終誘發(fā)炎癥反應(yīng)損傷機(jī)體細(xì)胞。本研究為FLHS的防治提供可靠的理論依據(jù)。