長角血蜱磷酸丙糖異構(gòu)酶的真核表達(dá)及免疫保護(hù)力分析

吳品興，梁 娜，董紅猛，肖舒文，胡永紅 (河北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024)

長角血蜱(Haemaphysalislongicornis)隸屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)、蛛形綱(Arachnida)、蜱螨亞綱(Acari)、寄螨總目(Parasitiformes)、蜱目(Ixodida)、硬蜱科(Ixodidae)[1]，在全世界呈廣泛性分布[2-4]。長角血蜱作為重要的病原體載體，可引起立克次體病[5]、人單核細(xì)胞埃立克體病[6]、犬焦蟲癥[7]、泰勒蟲病[8]及發(fā)熱伴血小板減少綜合征[9]等，對人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展帶來極大危害。目前，化學(xué)防治仍然是控制蜱類的重要方式[10]，但長期使用會導(dǎo)致環(huán)境污染和蜱抗藥性的產(chǎn)生[11]，因此，疫苗接種已成為有效的蜱類防治策略之一。

磷酸丙糖異構(gòu)酶(triosephosphate isomerase，TIM)是一種催化磷酸二羥丙酮(DHAP)和甘油醛-3-磷酸(GAP)互逆轉(zhuǎn)化的酶，在糖酵解過程中有重要的地位[12]。已有研究證實(shí)，剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)[13]、日本血吸蟲(Schistosomajaponicum)[14]、微小扇頭蜱(Rhipicephalusmicroplus)[15]中TIM對宿主具有免疫保護(hù)力，而蜱中相關(guān)研究報(bào)道甚少。畢赤酵母(Pichiapastoris)是一種工業(yè)化的甲基營養(yǎng)型酵母，具有易操作，穩(wěn)定表達(dá)，高密度發(fā)酵及翻譯后修飾(例如糖基化，多肽折疊和甲基化)的優(yōu)點(diǎn)[16]，并且在畢赤酵母中表達(dá)的重組蛋白不會遇到內(nèi)毒素污染[17]。因此，本研究采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對長角血蜱TIM進(jìn)行表達(dá)和純化，通過蜱叮咬試驗(yàn)分析免疫保護(hù)力，為進(jìn)一步篩選抗蜱疫苗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物新西蘭大白兔(約2 kg)購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。所有動物試驗(yàn)方案經(jīng)河北師范大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn) (2020LLSC05)。

長角血蜱采集于中國小五臺山國家自然保護(hù)區(qū)。非寄生期蜱放置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)(濕度為75%，溫度為(25±1)℃)。

1.2 主要試劑Pme I(Thermo)、質(zhì)粒提取試劑盒(Axygen)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Axygen)、Zeocin(上海生工)、大腸桿菌DH5α感受態(tài)(北京全式金)、酵母提取物(Oxid)、蛋白胨(Oxid)、胰蛋白胨(Oxid)、葡萄糖(國藥)、山梨醇(Amresco)、弗氏佐劑(Sigma)。

1.3 基因合成按照畢赤酵母密碼子偏好性優(yōu)化TIM基因，經(jīng)北京華大基因合成，連入真核質(zhì)粒pPICZaA，獲得真核重組質(zhì)粒pPICZaA-TIM。

1.4 質(zhì)粒提取與線性化取1 μL pPICZaA-TIM轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)，取100 μL涂含25 mg/L Zeocin的LB平板。37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。挑單菌落加入含25 mg/L Zeocin的LB中37℃，180 r/min過夜培養(yǎng)，按照axygen質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒線性化(Pme I酶，37℃水浴，酶切3 h)。按照Axygen瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書回收線性化質(zhì)粒，用無水乙醇沉淀，加入無菌水重懸。

1.5 畢赤酵母X33感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化將畢赤酵母X33在YPD固體平板劃線培養(yǎng)，挑單菌落于YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在進(jìn)行大量培養(yǎng)，離心收集菌體，用預(yù)冷的無菌水重懸洗滌，離心，再用預(yù)冷的1 mol/L山梨醇重懸洗滌、離心，菌體用1 mol/L山梨醇重懸待用。

將線性化質(zhì)粒與X33感受態(tài)混合，冰浴5 min，轉(zhuǎn)入預(yù)先冰浴的電擊杯中，按照電擊儀的預(yù)設(shè)程序電擊(2 mm電擊杯，電擊條件：2 000 V、25 uF、200 Ω；電擊時間5.1 ms)，電擊后立即加入1 mL 預(yù)冷的1 mol/L山梨醇，然后轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，30℃復(fù)蘇2～3 h，涂Zeocin質(zhì)量濃度為0.1 g/L的YPDS平板，30℃培養(yǎng)3～5 d。

1.6 表達(dá)檢測將單菌落接種到BMGY培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min培養(yǎng)2 d后，離心，菌體用BMMY培養(yǎng)基重懸并開始誘導(dǎo)TIM表達(dá)，之后每24 h補(bǔ)加終濃度為1%的甲醇，取誘導(dǎo)3 d的樣品SDS-PAGE檢測。

將小量表達(dá)量較高的菌種接入BMGY中培養(yǎng)2 d，按1%接種到500 mL BMGY中培養(yǎng)2 d，離心菌體用500 mL BMMY重懸并誘導(dǎo)培養(yǎng)，每24 h 補(bǔ)加終濃度1%的甲醇，誘導(dǎo)3 d，離心收集上清。

1.7 純化蛋白將誘導(dǎo)上清分別用0.80，0.45，0.22 μm 濾膜過濾，上鎳柱純化，利用不同濃度咪唑(25，50，100，150，250 mmol/L)進(jìn)行梯度洗脫，SDS-PAGE檢測純化情況。

1.8 重組蛋白rTIM的免疫原性分析將純化的rTIM樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，之后按照海綿濾紙、凝膠、PVDF膜、海綿濾紙順序放入半干轉(zhuǎn)膜儀，22 v，轉(zhuǎn)膜30 min。PVDF膜用TPBS清洗3次，封閉液常溫封閉2 h后，一抗(1∶2 000)常溫孵育30 min，4℃靜置過夜，第2天進(jìn)行常溫孵育1 h。再用TPBS清洗3次，用含辣根過氧化物酶的羊抗兔二抗(1∶2 000)孵育2 h，用TPBS清洗3次，置于化學(xué)發(fā)光成像儀中進(jìn)行成像。同時，用新西蘭大白兔陰性血清孵育作對照。

1.9 免疫動物將新西蘭大白兔隨機(jī)分為2組(對照組和試驗(yàn)組)，每組3只新西蘭大白兔。試驗(yàn)組中，將0.5 mL rTIM (0.1 g/L)與等體積弗氏完全佐劑混合，注射新西蘭大白兔；2周后將0.5 mL rTIM (0.1 g/L)與等體積弗氏不完全佐劑混合，注射新西蘭大白兔；2周后進(jìn)行第3次免疫，方法同上。同時，0.5 mL PBS與佐劑混合免疫新西蘭大白兔做對照。

1.10 血清的ELISA檢測一免前及一免疫后每隔7 d，自新西蘭大白兔耳緣靜脈采血，4℃靜置離心取血清。使用純化rTIM進(jìn)行96孔板包被，4℃過夜；經(jīng)洗液清洗3次，加入封閉液封閉1 h；用洗液清洗3次，加入待測血清孵育45 min，洗液清洗3次，加入用含辣根過氧化物酶的羊抗兔二抗(1∶2 000)孵育30 min，洗液清洗3次，加入顯色液顯色再加終止液終止反應(yīng)，置于酶標(biāo)儀中讀取D450 nm值，并在1∶25 600的血清稀釋倍數(shù)下作圖。

1.11 蜱叮咬試驗(yàn)第3次免疫后10 d進(jìn)行蜱叮咬試驗(yàn)。將饑餓期長角血蜱成蜱32頭/兔(雌、雄比1∶1)喂養(yǎng)于新西蘭大白兔耳上。每天對蜱進(jìn)行觀察，并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。結(jié)果使用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將試驗(yàn)組與對照組雌蜱的叮咬數(shù)量、產(chǎn)卵量以及卵的孵化率相比，計(jì)算其免疫保護(hù)率(Eff%)=100(1-(NET×EWPF×H))[18]，其中NET代表蜱數(shù)量的降低比，EWPF代表產(chǎn)卵量的降低比，H代表卵的孵化率降低比。

2 結(jié)果

2.1 TIM序列優(yōu)化在前期克隆長角血蜱TIM基因747 bp(GenBank登錄號：MK599255)基礎(chǔ)上，根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性優(yōu)化TIM基因，序列見圖1。

陰影部分為插入pPICZaA位點(diǎn)；下劃線為起始密碼子；斜體為His標(biāo)簽；波浪線為終止密碼圖1 TIM進(jìn)行優(yōu)化后的序列和翻譯的氨基酸序列

2.2 質(zhì)粒擴(kuò)增對轉(zhuǎn)入DH5α的pPICZaA-TIM進(jìn)行菌液PCR，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，TIM目的基因大小處有1條明亮條帶，序列測序結(jié)果與TIM優(yōu)化序列完全一致(圖2)。

M.DL2000 DNA Marker；1～5.重組質(zhì)粒在DH5α中的擴(kuò)增產(chǎn)物圖2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5α中的菌液PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 重組蛋白初步表達(dá)將YPDS平板上長出的單菌落接種到BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)，離心后再轉(zhuǎn)入BMMY培養(yǎng)基中，重懸和開始誘導(dǎo)TIM表達(dá)。取誘導(dǎo)3 d的樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示，第8泳道菌株表達(dá)的目的蛋白最多，其相對分子質(zhì)量大小與預(yù)測一致，約為28 kDa(圖3)。

1～9.代表不同的單菌落；M.蛋白Marker圖3 小量表達(dá)篩選檢測

2.4 重組蛋白純化將表達(dá)量較高的8號菌種大量表達(dá)，并進(jìn)行蛋白純化，使用不同濃度的洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫，SDS-PAGE檢測。在50，100 mmol/L咪唑洗脫緩沖液下得到明顯的條帶，其蛋白相對分子質(zhì)量大小與預(yù)測一致，約為28 kDa(圖4)。

1～5.250，150，100，50，25 mmol/L咪唑洗脫緩沖液收集的重組蛋白rTIM；M.蛋白Marker圖4 不同濃度的咪唑溶液洗脫重組蛋白rTIM

2.5 重組蛋白rTIM的Western blot分析將純化的rTIM蛋白與兔抗長角血蜱血清進(jìn)行Western blot檢測(圖5)。兔抗長角血蜱血清與rTIM反應(yīng)，而重組蛋白rTIM與陰性血清不反應(yīng)，表明rTIM蛋白具有免疫原性。

M.蛋白 Marker；1.陰性血清孵育純化的rTIM；2.兔抗長角血蜱血清孵育純化的rTIM圖5 rTIM的免疫印跡分析

2.6 ELISA檢測將純化的rTIM蛋白與佐劑混合免疫注射新西蘭大白兔，一免后每隔7 d取血。ELISA檢測結(jié)果顯示，一免后14 d，與對照組相比，試驗(yàn)組新西蘭大白兔抗體水平顯著升高(P<0.05)，并隨著免疫次數(shù)持續(xù)增高，三免后趨于平穩(wěn)(圖6)。

rTIM.試驗(yàn)組血清；Control.對照組血清；箭頭表示免疫注射時間圖6 免疫rTIM的新西蘭大白兔血清ELISA檢測結(jié)果

2.7 免疫rTIM疫苗的新西蘭大白兔對長角血蜱雌蜱的影響rTIM雌蜱叮咬數(shù)據(jù)分析如表1所示。在吸血時間上，rTIM試驗(yàn)組(8.0±0.23) d與對照組(7.21±0.25) d相比無顯著性差異。試驗(yàn)組雌蜱飽血體質(zhì)量、產(chǎn)卵量和卵孵化率分別為(163.30±1.40) mg，(52.23±1.41) mg，(29.26±2.43)%，與對照組相比差異顯著(P<0.05)，分別減少11.02%，16.00%和44.69%。根據(jù)免疫效率計(jì)算公式，得到rTIM試驗(yàn)組的免疫效率為58.40%。

表1 免疫rTIM疫苗的新西蘭大白兔對長角血蜱雌蜱的影響

3 討論

長角血蜱能夠攜帶和傳播多種病原體，對人類健康以及畜牧業(yè)的發(fā)展造成了嚴(yán)重的危害[19-21]，因此針對長角血蜱的防治刻不容緩。TIM是一種重要的糖酵解途徑酶，在糖酵解過程中起著至關(guān)重要的作用[22]，對于能量的生成十分重要[23]。因此，根據(jù)TIM特性開展寄生蟲防治的研究已在多個物種報(bào)道。

趙正虎等[24]利用剛地弓形蟲TIM進(jìn)行原核表達(dá)和免疫原性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TIM可引起宿主產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。ZINSSER等[25]對曼氏血吸蟲(Schistosomamansoni)TIM進(jìn)行生物分析，發(fā)現(xiàn)其是研制曼氏血吸蟲疫苗的潛在靶標(biāo)。與原核表達(dá)相比較，真核表達(dá)具有一定的優(yōu)勢，特別是對目的蛋白修飾上。畢赤酵母具有真核翻譯后修飾如糖基化、二硫鍵形成及蛋白水解加工的能力[26]。本研究對TIM進(jìn)行表達(dá)純化，發(fā)現(xiàn)純化蛋白的主帶上有1條小帶，可能是畢赤酵母對目標(biāo)蛋白修飾引起的。Western blot結(jié)果說明rTIM具有免疫原性。ELISA檢測結(jié)果表明，重組蛋白rTIM能有效引起宿主產(chǎn)生體液免疫。蜱叮咬試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，rTIM可顯著抑制雌蜱的飽血體質(zhì)量、產(chǎn)卵量和卵孵化率，且分別減少11.02%，16.00%和44.69%。TIM是糖酵解關(guān)鍵酶，推測其誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生的TIM抗體及免疫細(xì)胞[27]在蜱吸血過程中進(jìn)入蜱體內(nèi)，影響了長角血蜱對宿主血液的利用，抑制了相應(yīng)的糖代謝過程，無法將其轉(zhuǎn)化為自身的營養(yǎng)物質(zhì)，從而影響了雌蜱飽血體質(zhì)量、產(chǎn)卵量及卵的孵化。特別是試驗(yàn)組中卵孵化率與對照組相比減少44.69,%，推測TIM主要影響了長角血蜱胚胎發(fā)育過程。這與SARAMAGO等[28]的研究相似，微小扇頭蜱TIM單克隆抗體可抑制胚胎蜱細(xì)胞系 (BME26)的細(xì)胞增殖，這可能是因?yàn)榕咛グl(fā)育過程需要糖代謝產(chǎn)生ATP供能，而TIM功能損傷影響了能量產(chǎn)生[29]。本試驗(yàn)首次利用畢赤酵母對長角血蜱TIM進(jìn)行真核表達(dá)，結(jié)果表明， TIM可部分保護(hù)宿主免受蜱侵害，可作為抗蜱疫苗的候選蛋白。