水皰性口炎病毒核蛋白的納米抗體和多聚抗核蛋白納米抗體的原核表達(dá)及功能驗(yàn)證

郭玉堃，馬英先，常雯茹，明勝利，楊國宇，郭豫杰 (河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生物化學(xué)與營養(yǎng)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046)

水皰性口炎(vesicular stomatitis,VS)是由水皰性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV) 引起多種哺乳動(dòng)物人畜共患的一種急性、高度接觸性傳染病，馬、牛、豬等動(dòng)物較易感。以舌、唇、口腔黏膜、乳頭和蹄冠等處上皮發(fā)生水皰為主要特征[1]。VSV 為彈狀病毒科、水皰病毒屬的成員，VSV 基因組為不分節(jié)段的線性單股負(fù)鏈RNA[2]，長約11 kb。從 3′端→5′端依次排列著 N、NS(P)、M、G、L 等 5 個(gè)不重疊的基因，分別編碼核蛋白、磷酸蛋白、基質(zhì)蛋白、糖蛋白、及 RNA 聚合酶蛋白[3]。

核蛋白在病毒免疫和診斷上具有重要的意義。核蛋白在不同種群中的保守性很強(qiáng)，且核蛋白抗原性高，進(jìn)入體內(nèi)的核蛋白作為優(yōu)勢(shì)抗原被 VSV 特異性細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞識(shí)別，發(fā)揮殺傷細(xì)胞作用，參與免疫反應(yīng)。刺激機(jī)體后會(huì)產(chǎn)生非中和抗體[4]，在臨床實(shí)踐中，通過檢測(cè)核蛋白的抗體就可區(qū)分是 VSV 感染還是疫苗免疫，這在 VSV 的臨床診斷及防治中具有重要的意義。N 基因編碼的病毒核蛋白由 422 個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量為 47 kDa。每個(gè)病毒粒子含有 1 258 個(gè)拷貝[5]。

在 VSV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的過程中，核蛋白優(yōu)先和前導(dǎo) RNA 結(jié)合，形成核蛋白 RNA 復(fù)合體[6]，該復(fù)合體與病毒基因組 RNA 結(jié)合，形成了能夠保護(hù)病毒 RNA 免受核酸酶消化的復(fù)合物[7]，作為 RNA 合成的模板。N、P 和 L 是 VSV 轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必需的3種蛋白[8]，以N-RNA 作為模板，同時(shí)以 L 蛋白、P 蛋白作為聚合物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，能夠合成結(jié)構(gòu)完整的 RNA 鏈。因此，N、P 和 L 為干預(yù)病毒生命周期提供了可能靶點(diǎn)[9]。

HAMERS等[10]在單峰駝以及雙峰的亞洲駝和南美駱駝的血清中發(fā)現(xiàn)一種天然缺失輕鏈的重鏈抗體(HCAb)，克隆重鏈抗體的可變區(qū)得到僅由一個(gè)重鏈可變區(qū)組成的單域抗體，稱為VHH 抗體(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody)，又稱為納米抗體(nanobody)，其晶體結(jié)構(gòu)呈橢圓形，直徑 2.5 nm，長 4 nm，是最小的功能性抗原結(jié)合片段[11]。

與傳統(tǒng)抗體相比，VHH 具有相對(duì)分子質(zhì)量小、易表達(dá)、高特異性、高親和力、高溶解性、穩(wěn)定性、免疫原性低、可識(shí)別獨(dú)特構(gòu)象的抗原表位、組織滲透性強(qiáng)、可穿透或轉(zhuǎn)移進(jìn)入血腦屏障等優(yōu)點(diǎn)[12-15]，使其作為一種小型化的基因工程抗體在基礎(chǔ)研究、藥物開發(fā)等領(lǐng)域具有廣闊的前景[16-18]。近期有研究表明，在胞漿中表達(dá)的 VHHs 可以通過阻斷參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的界面，或通過在酶的活性中心結(jié)合，或通過識(shí)別或穩(wěn)定其目標(biāo)的不同構(gòu)象而起到分子擾動(dòng)作用[19]。HANKE等[20]研究表明，抗VSV 核蛋白的納米抗體通過阻斷mRNA 轉(zhuǎn)錄來阻止病毒基因的表達(dá)：抗 VSV 核蛋白的納米抗體可與聚合酶輔因子 P 競爭結(jié)合，這將阻止 P 介導(dǎo)的聚合酶 L 進(jìn)入RNA 模板，通過阻止 P 與核衣殼結(jié)合來抑制病毒轉(zhuǎn)錄。VHH 可能為潛在的靶向 RNA 轉(zhuǎn)錄的抗病毒藥物提供線索[21]。然而，由于納米抗體小，其血清半衰期短、與抗原的結(jié)合力通常比通過免疫動(dòng)物獲得的完整抗體的親和力低很多[22]。

鐵蛋白(ferritin)納米顆粒通常是由 24 個(gè)亞基自組裝形成的球形籠狀結(jié)構(gòu)，鐵蛋白外殼的四級(jí)結(jié)構(gòu)由 8 個(gè)親水通道和 6 個(gè)疏水通道組成,主要負(fù)責(zé)蛋白籠內(nèi)外的物質(zhì)交換[23]。從羊駝中中分離出來的鐵蛋白[24](GenBank 登錄號(hào)：WP_014835352.1)，進(jìn)行截短后留下包含 97 個(gè)氨基酸的鐵蛋白的結(jié)構(gòu)域，稱為赤鮮素蛋白(rubrerythrin)[25]，赤鮮素蛋白在化學(xué)結(jié)構(gòu)及相對(duì)分子質(zhì)量等方面比普通鐵蛋白簡單且小的多，更利于高效表達(dá)與純化。本試驗(yàn)將羊駝的抗VSV核蛋白納米抗體序列(GenBank 登錄號(hào)：ANJ89064.1)，命名為 VSVNb，串聯(lián)在截短型鐵蛋白赤鮮素蛋白的 C 端[26]，并按照大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化，命名為 FnL-VSV。

將納米抗體和鐵蛋白融合表達(dá)，形成 24 聚體，可有效降低小分子納米抗體蛋白的降解，提高蛋白的有效濃度[27-29]，使融合蛋白具有更高的抗原識(shí)別能力，同時(shí)作為靶向 RNA 轉(zhuǎn)錄的抗病毒藥物的潛在可能也可增加其藥物濃度增強(qiáng)抗病毒效果；因融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的增加， 在動(dòng)物體內(nèi)的半衰期也會(huì)延長，所以融合蛋白是一種既能增強(qiáng)親和力又能延長納米抗體半衰期的研究策略[30-31]，期望其能夠有效地用于疾病診斷和體內(nèi)治療中[32-33]。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；IPTG 購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Prestained Protein Marker Ⅰ 購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；硫酸銨購自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；Ni2+購自 QIAGEN 公司；BCA 蛋白定量測(cè)定試劑盒購自北京鼎國昌盛有限公司；辣根過氧化物酶(HRP) 標(biāo)記試劑盒(SureLINKTM HRP Conjugation Manual)購自北京西美杰科技有限公司；VSV 毒株為本實(shí)驗(yàn)室保存；JET BIOFIL 96 孔酶標(biāo)板購自廣州潔特生物過濾股份有限公司；TMB 顯色液、終止液購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 基因的設(shè)計(jì)與合成將羊駝的抗VSV核蛋白納米抗體序列(GenBank 登錄號(hào)：ANJ89064.1)命名為 VSVNb，為便于純化，在 VHH 基因 3′端加6×HE，委托南京金斯瑞公司進(jìn)行合成(圖 1A)并構(gòu)建到載體 pET21b 上，重組載體命名為 pET21b-VSVNb。

將赤鮮素蛋白基因(GenBank 登錄號(hào)：WP_014835352.1)根據(jù)鐵蛋白的結(jié)構(gòu)域截短后進(jìn)行大腸桿菌密碼子優(yōu)化，和從羊駝中獲得的抗VSV核蛋白納米抗體序列(GenBank 登錄號(hào)：ANJ89064.1)進(jìn)行合成，為方便后期親和標(biāo)簽 HE 的切除，在截短型鐵蛋白基因 5′端加上 TEV 酶切位點(diǎn)；為便于純化，在 TEV 基因 5′端加上 6×HE，委托南京金斯瑞公司進(jìn)行合成(圖 1B)并構(gòu)建到載體 pET21b 上，重組載體命名為 pET21b-FnL-VSV。

A.VSVNb蛋白序列N端至C端有抗VSV核蛋白納米抗體、6×HE 親和標(biāo)簽；B.FnL-VSV蛋白序列 N 端至 C 端有 6×HE 親和標(biāo)簽、TEV 酶切位點(diǎn)、截短的鐵蛋白赤鮮素蛋白、抗VSV核蛋白納米抗體圖1 融合蛋白 VSVNb 和 FnL-VSV 基因設(shè)計(jì)圖

1.3 重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)與純化將質(zhì)粒 pET21b-VSVNb 和 pET21b-FnL-VSV 轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，在含Amp 100 mg/L 的LB 平板上挑取含重組質(zhì)粒的單個(gè)菌落，接種于含 100 mg/L Amp 的 2 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。將得到的菌液按體積比 1∶100 接種于含 100 mg/L Amp 的 100 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)至D600 nm值為 0.6～0.8，進(jìn)行 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)結(jié)束后，菌液離心收集沉淀，10 mL PBS 重懸菌體，加溶菌酶(1 g/L)冰浴30 min 后，低溫超聲波破碎菌體(超聲時(shí)間 5 s，間歇 10 s，120 次)。將破碎液高速離心后分別收集上清和沉淀。含 VSVNb 的上清通過金屬鰲合親和層析技術(shù)純化得到目的蛋白，含F(xiàn)nL-VSV 的上清通過 30%硫酸銨進(jìn)行鹽析純化獲得目的蛋白。純化后蛋白脫鹽、濃縮、定量至 1 g/L。每一步操作均留樣，進(jìn)行 SDS-PAGE 分析，檢測(cè)重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化效果。

1.4 融合蛋白 FnL-VSV 電鏡觀察純化的融合蛋白 FnL-VSV，在 pH 7.4 的 PBS 溶液中通過透射電鏡觀察鐵蛋白納米籠形成情況：取 10 μL 濃縮后的純化蛋白滴到銅網(wǎng)上，靜置 10 min，用濾紙從銅網(wǎng)的一邊吸取液體；然后再滴加 10 μL 1%磷鎢酸染色液，靜置 2 min，再用濾紙從銅網(wǎng)的一邊吸取染色液；將銅網(wǎng)置于玻璃平皿中，自然晾干；將制備好的銅網(wǎng)固定在樣品握持桿的樣品臺(tái)上，插入到樣品室內(nèi)，抽真空后，進(jìn)行觀察和分析純化的融合蛋白是否形成納米顆粒。

1.5 融合蛋白 VSVNb 和 FnL-VSV 進(jìn)行 HRP 標(biāo)記將脫鹽、定量為 1 g/L 的 VSVNb 和 FnL-VSV 蛋白通過 HRP 抗體標(biāo)記試劑盒分別進(jìn)行標(biāo)記，操作方法按照說明書進(jìn)行，標(biāo)記好的抗體記作 VSVNb-HRP 和 FnL-VSV-HRP。

1.6 直接 ELISA

1.6.1不同濃度的納米抗體 VSVNb 和 FnL-VSV 與病毒識(shí)別 VSV 經(jīng)蔗糖超速密度梯度離心純化，稀釋至 5 mg/L，每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加 100 μL，4℃過夜。次日取出，平衡至室溫，棄去孔內(nèi)溶液，每孔加入 150 μL 封閉液，37℃溫育2 h后，取出平衡至室溫，棄去孔內(nèi)溶液，室溫倒扣至干燥完成。

取出包被板及相關(guān)試劑，平衡至室溫；每孔加入 100 μL 不同稀釋度的 VSVNb-HRP 和FnL-VSV-HRP 抗體，進(jìn)行 1∶10，1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640，1∶1 280，1∶2 560，1∶5 120，1∶10 240倍比稀釋；覆膜，37℃孵育 1 h；取出，棄掉孔內(nèi)液體，每孔加入 350 μL 洗液洗板，重復(fù) 5 次后，在吸水紙上拍干；每孔加入TMB 底物 A 和底物 B 各 50 μL，覆膜，37℃避光孵育 15 min；每孔加入 50 μL 終止液，顏色由藍(lán)色迅速變?yōu)辄S色；使用酶標(biāo)儀檢測(cè)D450 nm值，15 min內(nèi)完成。

1.6.2納米抗體VSVNb 和 FnL-VSV與不同質(zhì)量濃度的病毒識(shí)別 VSV 經(jīng)蔗糖超速密度梯度離心純化，稀釋至不同質(zhì)量濃度，即0.312 5，0.625，1.25，2.5，5，10，20，40，80，160，320，640，1 280 mg/L，每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加 100 μL，4℃過夜。次日取出，平衡至室溫，棄去孔內(nèi)溶液，每孔加入 150 μL 封閉液，37℃溫育 2 h后，取出平衡至室溫，棄去孔內(nèi)溶液，室溫倒扣至干燥完成。

取出包被板及相關(guān)試劑，平衡至室溫；每孔加入 100 μL 稀釋度為 1∶2 000 的 VSVNb-HRP 和 FnL-VSV-HRP 抗體；覆膜，37℃孵育1 h；取出，棄掉孔內(nèi)液體，每孔加入 350 μL 洗液洗板，重復(fù) 5 次后，在吸水紙上拍干；每孔加入 TMB 底物 A 和底物 B 各 50 μL，覆膜，37℃避光孵育 15 min；每孔加入 50 μL 終止液，顏色由藍(lán)色迅速變?yōu)辄S色；使用酶標(biāo)儀檢測(cè)D450 nm值，15 min內(nèi)完成。

2 結(jié)果

2.1 融合蛋白 VSVNb 和 FnL-VSV 的表達(dá)與純化重組質(zhì)粒 pET21b-VSVNb 轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)，經(jīng) 0.5 mmol/L IPTG 18℃、12 h誘導(dǎo)表達(dá)。超聲破碎分別收集上清和沉淀，SDS-PAGE 檢測(cè)結(jié)果顯示,誘導(dǎo)后的全菌和破碎后上清樣品在 15.95 kDa 處有與預(yù)期大小一致的蛋白條帶(圖2A)。結(jié)果表明，重組蛋白為可溶性表達(dá)，純化效率較高。

重組質(zhì)粒 pET21b-FnL-VSV 轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)，經(jīng) 0.5 mmol/L IPTG 18℃、12 h 誘導(dǎo)表達(dá)。超聲破碎分別收集上清和沉淀，SDS-PAGE 檢測(cè)結(jié)果顯示誘導(dǎo)后的全菌和上清、沉淀、鹽析及脫鹽樣品在 29.04 kDa 處有與預(yù)期大小一致的蛋白條帶(圖2B)。結(jié)果表明，重組蛋白部分可溶性表達(dá)，純化效率很高。

A.融合蛋白 VSVNb(M.蛋白Marker；1.誘導(dǎo)前全菌；2.誘導(dǎo)后全菌；3.破碎后上清；4.破碎后沉淀；5.濾液；6～11.分別為10，10，20，50，50，100 mmol/L 咪唑洗雜蛋白)；B.融合蛋白FnL-VSV(M.蛋白Marker；1.誘導(dǎo)前全菌；2.誘導(dǎo)后全菌；3.破碎后上清；4.破碎后沉淀；5.30%鹽析后上清；6.30%鹽析后沉淀；7.脫鹽蛋白；8.定量蛋白 1 g/L)圖2 融合蛋白 VSVNb和 FnL-VSV的表達(dá)與純化

2.2 融合蛋白 FnL-VSV電鏡結(jié)果透射電鏡觀察結(jié)果表明，本研究制備的重組蛋白 FnL-VSV 在生理?xiàng)l件下能夠正確折疊，自發(fā)組裝并形成粒徑約為20 nm的納米顆粒，大小、形狀、結(jié)構(gòu)與預(yù)期相符(圖 3)。

圖3 融合蛋白FnL-VSV 透射電鏡圖

2.3 直接 ELISA 結(jié)果

2.3.1不同濃度的納米抗體 VSVNb 和 FnL-VSV 與病毒識(shí)別 用 VSV 毒株、VSVNb-HRP 抗體和 FnL-VSV-HRP抗體進(jìn)行直接 ELISA 檢測(cè)，結(jié)果表明，在抗原濃度一定的情況下，融合蛋白 VSVNb-HRP及 FnL-VSV-HRP 均能與特異抗原在較低濃度條件下相結(jié)合，說明具有較高活性。制備的抗體經(jīng)過 HRP 標(biāo)記后，可以用于 VSV 毒株的識(shí)別，并且 HRP 標(biāo)記的VSVNb 納米抗體從1 000 mg/L倍比稀釋 1∶10～1∶10 240 間均可以識(shí)別毒株，如圖 4A 所示，HRP 標(biāo)記的 FnL-VSV 鐵納米抗體從1 000 mg/L倍比稀釋1∶10～1∶10 240 間均可以識(shí)別毒株，如圖 4B 所示，F(xiàn)nL-VSV-HRP較VSVNb-HRP直接 ELISAD450 nm值大很多，說明 FnL-VSV-HRP 敏感性及活性更好。

圖4 融合蛋白 VSVNb(A)和FnL-VSV(B)直接 ELISA 結(jié)果

2.3.2納米抗體VSVNb和FnL-VSV與不同質(zhì)量濃度的病毒識(shí)別 用VSV毒株、VSVNb-HRP 抗體和 FnL-VSV-HRP 抗體進(jìn)行直接 ELISA 檢測(cè)，結(jié)果表明，在抗體質(zhì)量濃度一定的情況下，識(shí)別特異抗原的質(zhì)量濃度由低到高(2.5～1 280 mg/L)，說明其識(shí)別抗原的敏感性較高，識(shí)別范圍較廣(圖5A、B)。直接ELISA結(jié)果表明，融合蛋白VSVNb和FnL-VSV在VSV的檢測(cè)和研究中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

圖5 融合蛋白 VSVNb(A)和 FnL-VSV(B)直接 ELISA 結(jié)果

3 討論

VSV是一種典型的無節(jié)段 RNA 病毒，因此在抗 VSV 病毒藥物的研究中可選擇的靶點(diǎn)有限。HANKE等[20]發(fā)現(xiàn) N 蛋白的 VHH 序列中的特異性位點(diǎn)可與聚合酶輔因子P競爭結(jié)合，從而抑制病毒復(fù)制，并進(jìn)行了利用 VHH 作為細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的抗病毒藥物的研究。VHH相對(duì)分子質(zhì)量小，其半衰期較短，鐵蛋白將插入其 C 端的 VHH 序列包封到其空腔內(nèi)[34]對(duì)或可增加蛋白濃度、延長納米抗體的半衰期；對(duì)直接 ELISA 檢測(cè)來說提高了與抗原結(jié)合的親和力及敏感度[35]，可用于病毒疾病的快速診斷[36]。

外源重組蛋白在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)[37]中進(jìn)行高效表達(dá)時(shí)，由于表達(dá)過程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子，或環(huán)境不適，無法形成正確的次級(jí)鍵，從而影響重組蛋白的正確折疊，造成表達(dá)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成無活性的固體顆粒，即包涵體。以包涵體形式表達(dá)的抗體不具有活性，為了實(shí)現(xiàn)VHH抗體的可溶性表達(dá)，獲得有活性的抗體，本研究通過降低誘導(dǎo)劑濃度、降低誘導(dǎo)溫度等對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)VHH的可溶性表達(dá)。

IPTG[38]作為一種強(qiáng)誘導(dǎo)劑，在菌體中不能被代謝，可以持續(xù)地發(fā)揮作用，所以少量的IPTG 就可以起到很好的誘導(dǎo)效果。采用較低濃度的IPTG可以適當(dāng)?shù)慕档娃D(zhuǎn)錄速率，有利于蛋白的可溶性表達(dá)。所以選擇終濃度為0.5 mmol/L的IPTG作為最佳的誘導(dǎo)劑濃度。

誘導(dǎo)溫度[39]不僅影響菌體的生長，同樣影響著重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白的可溶性。有較多的蛋白在溫度較高條件下誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)容易出現(xiàn)錯(cuò)誤性折疊，形成包涵體沉淀，不利于純化且蛋白活性不高。而低溫誘導(dǎo)可以有助于蛋白的可溶性表達(dá)及形成正確的結(jié)構(gòu)，故選取18℃為納米抗體的誘導(dǎo)表達(dá)溫度。

直接ELISA方法是將抗原直接固定在固相載體上，加入酶標(biāo)記的一級(jí)抗體，即可測(cè)定抗原總量，此一級(jí)抗體的特異性非常重要。其優(yōu)勢(shì)為操作簡短，因無須使用二抗可避免交互反應(yīng)。缺點(diǎn)是試驗(yàn)所用一抗都需要用酶標(biāo)記，但不是每種抗體都適合做標(biāo)記，費(fèi)用相對(duì)提高。所以市場(chǎng)上很少運(yùn)用直接 ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)[40]。

本試驗(yàn)制備的融合蛋白 VSVNb 和 FnL-VSV 是特異性針對(duì)于VSV核蛋白的納米抗體和與截短型鐵蛋白串聯(lián)的納米抗體，將其進(jìn)行 HRP 標(biāo)記后的 VSVNb-HRP 和FnL-VSV-HRP，作為直接 ELISA 中的一級(jí)抗體，與病毒抗原識(shí)別并作用。