牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒GPCR基因熒光定量PCR檢測方法的建立

原耀賢，孫銘澮，黃偉楠，李康健，何 威，付 強(qiáng)，馬春全，劉 全，馬 駿* (.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528225；2.廣東省揭陽市惠來縣溪西畜牧獸醫(yī)站，廣東 揭陽 5525；.廣州市微生物研究所有限公司，廣東 廣州 50700)

牛結(jié)節(jié)性皮膚病(lumpy skin disease，LSD)是由痘病毒科(Poxviridae)脊髓動物痘病毒亞科(Chordopoxvirinae)羊痘病毒屬(Capripoxvirus)的雙鏈DNA病毒——牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒(lumpy skin disease virus，LSDV)引起的牛病毒性疾病[1]?；疾游锏钠つw表面會形成堅硬的結(jié)節(jié)或潰瘍；發(fā)病過程中體溫上升、精神萎靡、體質(zhì)量減輕、伴有流淚、流涕和流涎。患病奶牛產(chǎn)奶量減少，母牛可能會流產(chǎn)并伴有幾個月的不發(fā)情期，公牛會暫時不育或永久不育[2]，該病嚴(yán)重時會導(dǎo)致動物死亡。因此，LSD被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須通報的疫病[3]，被我國進(jìn)境疫病名錄列為一類動物疫病。

LSD于1929年在非洲贊比亞首次被發(fā)現(xiàn)。2013—2017年LSD由非洲傳入中東，逐漸形成了全球蔓延的趨勢[4]。2019年8月，該病傳入我國，在我國新疆伊犁地區(qū)首次暴發(fā)[5]。目前，LSD已在我國幾個省份有報道發(fā)病并執(zhí)行撲殺政策[6]。因此，鑒于LSD的流行趨勢，建立一種準(zhǔn)確、快速的LSDV檢測方法具有重要意義。

實時熒光定量PCR方法(real-time quantitative PCR，qPCR)具有操作簡便、特異性強(qiáng)、敏感性高等特點，廣泛應(yīng)用于病原微生物的臨床檢測中。目前，我國針對LSDV的qPCR檢測方法的相關(guān)報道較少。因此，本研究基于LSDV的G-protein-coupled chemokine receptor(GPCR)基因，設(shè)計了針對LSDV的qPCR檢測方法，為早期感染動物的發(fā)現(xiàn)和疑似病例的診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒和疫苗山羊痘病毒(goatpoxvirus，GTPV)疫苗株(CVCC AV41)購自吉林正業(yè)生物制品股份有限公司。小反芻獸疫(peste des petits ruminants virus，PPRV)活疫苗(Clone 9株)購自天康生物股份有限公司。

1.2 主要試劑TRIzol Reagent購自Invitrogen公司；PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、DL2000 DNA Marker、Ex Taq DNA聚合酶、pMD19-T質(zhì)粒、感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)、PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green Premix DimerEraser均購自TaKaRa公司；TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒購自TIANGEN公司；膠回收試劑盒購自Axygen公司；氯仿、無水乙醇、異丙醇等試劑均為分析純，購自廣州鼎國生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成根據(jù)GenBank中公布的LSDV-GPCR基因序列進(jìn)行分析比對，合成LSDV-GPCR基因，長度為1 149 bp。以此為模板，用Beacon Designer 8.1軟件設(shè)計1對特異性引物，上游引物qGPCR-F：5′-AGTCGAATATAAAGTAATCAGTC-3′，下游引物qGPCR-R：5′-CCGCATA-TAATACAACTTATTATAG-3′，擴(kuò)增片段長度為125 bp。基因和引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建以合成的LSDV-GPCR基因為模板進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系25 μL：2×Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL(10 μmol/L)，模板1.0 μL，ddH2O 7.5 μL。擴(kuò)增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳后按照膠回收試劑盒說明書步驟，回收純化PCR產(chǎn)物，將其克隆于pMD19-T載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19T-LSDV。重組質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，將陽性重組質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品。利用分光光度計測定重組質(zhì)粒的D260 nm/D280 nm比值和濃度，根據(jù)公式：質(zhì)?？截悢?shù)(拷貝/μL)=(質(zhì)粒濃度×10-9×稀釋倍數(shù)×6.02×1023)/(660 Da/堿基×堿基數(shù))，將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度換算為拷貝數(shù)。

1.5 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將pMD19T-LSDV重組質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋，得到7.11×102～7.11×109拷貝/μL等8個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品，將其作為反應(yīng)模板。每個稀釋梯度設(shè)3個樣品重復(fù)并建立陰性對照。qPCR反應(yīng)體系為20 μL：TB Green(2×)10 μL，上、下游引物各0.8 μL(10 μmol/L)，模板1 μL，ddH2O 7.4 μL。反應(yīng)條件：95℃ 30 s，1個循環(huán)；95℃ 10 s；60℃ 30 s，共40個循環(huán)。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)為X軸，Cq值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 特異性試驗采用試劑盒提取GTPV疫苗株的基因組DNA，采用TRIzol法提取PPRV疫苗株的基因組RNA并通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取其cDNA。利用建立的qPCR方法進(jìn)行檢測，以pMD19T-LSDV重組質(zhì)粒為陽性對照，同時設(shè)立陰性對照，以驗證該檢測方法的特異性。

1.7 敏感性試驗將pMD19T-LSDV重組質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋，獲得7.11×102～7.11×109拷貝/μL等8個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品，將其作為模板，進(jìn)行qPCR的敏感性檢測。同時對相同模板進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，比較2種檢測方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗選取7.11×103～7.11×109拷貝/μL共7個濃度進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)試驗；在3個不同時間，對上述7個稀釋度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行批間重復(fù)性試驗，每個濃度進(jìn)行3次重復(fù)。根據(jù)模板Cq值計算批內(nèi)、批間的變異系數(shù)(CV)，驗證qPCR方法的可靠性和重復(fù)性。

1.9 模擬臨床樣品的檢測臨床采集牛的皮膚結(jié)節(jié)，淚拭子和鼻拭子各10份，分別添加不同濃度的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，混合均勻。采用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒提取基因組DNA，利用本試驗建立的qPCR檢測方法檢測該組模擬臨床樣品，觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線，并進(jìn)行測序以及BLAST比對分析。

2 結(jié)果

2.1 LSDV重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備以合成的GPCR基因作為模板，用普通PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1 149 bp，與預(yù)期大小相符(圖1)。將目的基因克隆至pMD19-T載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD19T-LSDV，對獲得的質(zhì)粒進(jìn)行測序及BLAST比對分析，確認(rèn)其為含有目的基因的重組質(zhì)粒。經(jīng)紫外分光光度計測定，重組質(zhì)粒的質(zhì)量濃度為91.35 mg/L，經(jīng)過公式計算得到拷貝數(shù)為7.11×1010拷貝/μL。

2.2 熒光定量PCR構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線以不同濃度的pMD19T-LSDV重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。通過分析溶解曲線可得，各模板的qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解峰整齊單一(圖2)，溶解溫度為(77.50±0.50)℃；以Cq值為縱坐標(biāo)，以不同標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋的拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的CV大于0.999(R2>0.999)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.185 2x+37.764，R2=0.999 3，擴(kuò)增效率為106.04%，梯度稀釋的模板與Cq值呈良好的線性關(guān)系(圖3)。

圖2 qPCR的溶解曲線

圖3 LSDV qPCR檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 熒光定量PCR的特異性分析利用建立的qPCR方法對LSDV和GTPV的基因組DNA，PPRV的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，該方法僅對LSDV有特異性擴(kuò)增，對GTPV和PPRV均無熒光信號(圖4)，表明該方法具有良好的特異性。

1.LSDV；2.GTPV；3.PPRV；4.陰性對照圖4 qPCR特異性試驗結(jié)果

2.4 敏感性試驗以梯度稀釋的pMD19T-LSDV重組質(zhì)粒(7.11×102～7.11×109拷貝/μL)為模板，進(jìn)行普通PCR檢測和qPCR檢測，結(jié)果顯示，普通PCR可擴(kuò)增該質(zhì)粒的最低拷貝濃度為7.11×104拷貝/μL(圖5)，建立的qPCR方法對7.11×102～7.11×109拷貝/μL的pMD19T-LSDV重組質(zhì)粒均存在有效擴(kuò)增曲線(圖6)。2種方法相比，相差100倍。表明建立的qPCR方法較普通PCR更為敏感。

1～8.分別為7.11×109 ～7.11×102拷貝/μL；9.陰性對照圖6 qPCR檢測pMD19T-LSDV的敏感性結(jié)果

M.DL2000 DNA Marker；1.陰性對照；2～9.重組質(zhì)粒pMD19T-LSDV(7.11×109 ～7.11×102 拷貝/μL)圖5 普通PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.5 重復(fù)性試驗選取拷貝數(shù)為7.11×103～7.11×109拷貝/μL的重組質(zhì)粒為模板，分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗。結(jié)果顯示，批內(nèi)、批間的CV均小于1.5%(表1)，表明建立的qPCR檢測方法具有較好的重復(fù)性。

表1 LSDV qPCR方法的重復(fù)性試驗(n=3)

2.6 模擬臨床樣品檢測用本研究建立的qPCR檢測方法對30份模擬臨床樣品進(jìn)行檢測，觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線。結(jié)果顯示，模擬臨床樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線整齊、單一(圖7)，后經(jīng)克隆測序確認(rèn)，產(chǎn)物均為LSDV目標(biāo)序列。試驗表明，建立的qPCR方法能有效地從不同臨床樣品中檢測出LSDV序列，且該方法在臨床診斷上有良好的特異性。

圖7 模擬臨床樣品的溶解曲線

3 討論

LSD的傳播對全世界多個國家造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該病嚴(yán)重影響奶牛的產(chǎn)奶量和肉牛的料肉比等價值指標(biāo)，破壞牛皮等產(chǎn)品質(zhì)量，對養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益構(gòu)成了巨大威脅。在暴發(fā)該病的初期及時進(jìn)行免疫及控制措施，能有效地減緩LSD的蔓延。而LSD的防控和診斷，是減少經(jīng)濟(jì)損失的關(guān)鍵，這依賴于對早期疑似病例的有效診斷。

針對LSD的鑒別方法主要依賴分子生物學(xué)檢測方法。目前， LSDV的檢測方法主要有抗原抗體ELISA檢測、Western blot、普通PCR、實時qPCR方法等[7]。ELISA和Western blot具有敏感性高和特異性強(qiáng)的優(yōu)點，但山羊痘病毒屬各成員之間關(guān)系密切，同源性高，且能產(chǎn)生共同的中和抗體，因此，這2種方法難以應(yīng)用于LSDV的早期鑒別診斷[8]。普通PCR方法應(yīng)用廣泛，但有速度慢、敏感性低的缺點；而qPCR技術(shù)因其快速、簡便、特異、靈敏、可定量等優(yōu)點，能為臨床的病原檢測提供更多幫助。

qPCR方法分為染料法和探針法兩種[9]。探針法通過探針可以增加反應(yīng)收集信號的特異性，缺點是要合成探針，提高了檢測單位的門檻，也使檢測成本相對提高。染料法經(jīng)濟(jì)實惠，但其特異性劣于探針法。聶福平等[10]已經(jīng)基于探針法建立了鑒別檢測LSDV野生毒株的qPCR方法，能有效區(qū)分野毒株與疫苗株。而本研究基于染料法建立的qPCR檢測方法成本低，操作簡便，能特異地檢出LSDV，并且能有效的檢測臨床樣品，對疫病的快速臨床診斷具有重要意義。

本研究建立的qPCR方法能夠快速、準(zhǔn)確的檢測出LSDV，是一種特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好的檢測方法，可以應(yīng)用于LSD的監(jiān)測與防控。