PEDV-RBD基因在昆蟲桿狀病毒中的表達(dá)與鑒定

伊立超，李樂天，郝嘉翼，時小雙，張 爽，高子函，金寧一，婁安鋼*，李 昌* (.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉33000；.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 長春獸醫(yī)研究所 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 人獸共患病毒病防控關(guān)鍵技術(shù)研究創(chuàng)新單元，吉林 長春 30)

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是尼多病毒目(Nidoviridae)、冠狀病毒科(Coronaviridae)的α-冠狀病毒屬成員，能夠引起新生仔豬急性腹瀉、嘔吐、脫水甚至死亡。1971年英國首次報道了PEDV，1978年該病在英國[1]和比利時[2]暴發(fā)期間進(jìn)行了病原鑒定，我國于1984年確定豬群存在PEDV感染[3]，2013年美國首次從豬中分離到PEDV[4]。豬群感染PEDV后，其免疫力大幅度下降，導(dǎo)致繼發(fā)感染其他病原體，使得病情更加復(fù)雜[5-6]。

1.2治療方法:對照組患者給予吸氧、保持呼吸道通暢,抗感染,平喘,祛痰,適當(dāng)強心,利尿,糾正水、鹽、電解質(zhì)及酸堿平衡紊亂等綜合治療。觀察組在對照組基礎(chǔ)上,另外給予低分子肝素鈣4000U皮下注射,2次/d,再給予前列地爾10μg靜脈注射,1次/d,總療程10d。

PEDV表面具有一個18～23 nm纖突的囊膜結(jié)構(gòu)，纖突呈花瓣狀，由核心向四周呈放射狀分布，纖突末端呈球狀；病毒直徑為95～190 nm，是一種單股正鏈、不分節(jié)段RNA病毒。PEDV基因組大小約為28 kb，含有7個開放閱讀框，分別編碼大小為150 ～ 220 kDa的病毒纖突糖蛋白(S)、20～30 kDa的次要嵌合蛋白(M)、7 kDa的主要嵌膜蛋白(E)、58 kDa的核衣殼蛋白(N)與其他蛋白。PEDV整個基因組的編碼順序為5′UTR-ORF1a/1b-S-ORF3-E-M-N-3′UTR[7-8]。病毒表面的纖突蛋白(spike，S)具有介導(dǎo)細(xì)胞附著和膜融合的作用[9]。某些哺乳動物冠狀病毒的S蛋白能被相關(guān)的蛋白酶切割成S1和S2；S1具有受體結(jié)合位點，S2具有融合活性。S1區(qū)內(nèi)318～510氨基酸殘基可與ACE2[10-12]的肽酶域緊密結(jié)合。該片段為受體結(jié)合域(receptor-binding domain，RBD)，是決定病毒-受體相互作用的關(guān)鍵序列，也決定著病毒的宿主范圍和嗜性[13]。

目前預(yù)防PED的疫苗常用甲醛氫氧化鋁滅活苗，但疫苗株與近期流行株同源性較低，能保護(hù)仔豬免受PEDV流行株感染的高效廉價的疫苗需求更加迫切[14]。為此，本試驗針對高發(fā)的GⅡ-a型流行株P(guān)EDV的S蛋白中的RBD，應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行PEDV受體結(jié)合區(qū)(PEDV-RBD)基因表達(dá)，為PEDV診斷和亞單位疫苗研制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種及試劑T4DNA連接酶、DNA Marker、Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞購自TaKaRa公司；pFastBacTM雙載體、EcoR Ⅰ、Xba Ⅰ、DH10 Bac感受態(tài)購自Thermo Scientific公司；Anti-strep tag抗體購自Abcam；PEDV S蛋白抗體購自云之羽生物；HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG、FITC標(biāo)記山羊抗鼠IgG購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 目的基因設(shè)計與合成參考GenBank登錄的PEDV S蛋白基因序列(AKN45969.1)，選取其RBD基因序列，在序列上游添加EcoR Ⅰ酶切位點，下游添加Xba Ⅰ酶切位點，設(shè)計完成后，進(jìn)行桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)偏愛密碼子優(yōu)化，由南京金斯瑞公司合成。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定將合成的基因PEDV-RBD亞克隆至桿狀病毒雙表達(dá)載體的PH啟動子下游，命名為pFBD-PER，用EcoR Ⅰ、Xba Ⅰ進(jìn)行雙酶切鑒定。

泰州大橋針對不同等級風(fēng)險建立了層次分明的責(zé)任體系：重大風(fēng)險需上報上級主管部門，同時風(fēng)險控制措施的實施由公司安全辦公室直接負(fù)責(zé)；較大風(fēng)險由公司安全部門直接負(fù)責(zé)；一般風(fēng)險由基層管理單位負(fù)責(zé)人負(fù)責(zé)；可忽略風(fēng)險由生產(chǎn)現(xiàn)場作業(yè)人員根據(jù)需要合理控制.

1.4 重組桿粒的制備將質(zhì)粒pFBD-PER轉(zhuǎn)化到DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞中，制備含有10 mg/L 四環(huán)素、50 mg/L 硫酸卡鈉霉素、7 mg/L 慶大霉素、40 mg/L IPTG和100 mg/L X-Gal 藍(lán)白斑篩選平板。將熱激后的感受態(tài)細(xì)胞涂布在平板上，在37℃溫箱中倒置培養(yǎng)48 h。挑取較大的白色菌落到液體三抗(四環(huán)素(10 mg/L)、硫酸卡鈉霉素(50 mg/L)、慶大霉素(7 mg/L)培養(yǎng)基中，在37℃、220 r/min搖床培養(yǎng)12 h。按照表1引物進(jìn)行菌液PCR鑒定，將鑒定正確的菌株提取桿粒，命名為Bacmid-PER。

表1 引物信息

1.5 重組桿狀病毒的拯救在6孔板中27℃培養(yǎng)Sf9細(xì)胞至80%，更換2 mL完全培養(yǎng)基(含1.5%胎牛血清Grace's培養(yǎng)基)，使用雙無Grace's培養(yǎng)基稀釋4 μg陽性重組桿粒Bacmid-PER與4 μL CellfectinTMⅡ Reagent混勻，靜置20 min后，緩慢均勻加入6孔板中，27℃培養(yǎng)6 h，換液為Sf-900 Ⅱ完全培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)5～7 d，每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，待大部分細(xì)胞出現(xiàn)病變時，收取上清為第1代重組桿狀病毒，命名為rBV-PER，然后繼續(xù)盲傳3代。

1.6 間接免疫熒光法(IFA)鑒定PEDV-RBD蛋白的表達(dá)將Sf9細(xì)胞均勻鋪入6孔板，待細(xì)胞長至70%，接種重組桿狀病毒rBV-PER，每孔20 μL。27℃培養(yǎng)48 h后棄掉培養(yǎng)基,用4%多聚甲醛固定液固定30 min，Trion X-100透化處理10 min，PBS清洗1次。5%脫脂乳封閉1 h，1∶1 000稀釋Anti-strep tag抗體，1∶1 000稀釋抗PEDV S蛋白抗體，各室溫孵育2 h;PBS清洗1次,用1∶2 000稀釋FITC-標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，室溫避光孵育1 h，PBS清洗1次后，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.7 Western blot檢測PEDV-RBD蛋白的表達(dá)收集感染rBV-PER的Sf9細(xì)胞，細(xì)胞破碎處理后，12 000 r/min離心2 min,收取上清制備蛋白樣品。通過SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上，以1∶1 000稀釋的Anti-strep tag為抗體，1∶1 000稀釋抗PEDV S蛋白抗體，1∶5 000稀釋的山羊抗鼠IgG為二抗，分別進(jìn)行Western blot鑒定。

楚合磊等[6]總結(jié)了國內(nèi)外廢橡膠與廢塑料在制造阻尼材料方面的研究和應(yīng)用的成果。分別介紹了廢橡膠作為減震降噪的阻尼材料在工程和工業(yè)中的研究應(yīng)用，廢膠粉與廢塑料共混改性型阻尼材料、樹脂型廢膠粉阻尼材料的研究應(yīng)用。研究表明，廢橡膠和廢塑料制造阻尼材料用于生產(chǎn)實踐,不僅可以起到減震降噪作用,而且能夠節(jié)約資源,具有顯著的環(huán)保效益，對于資源的可持續(xù)性發(fā)展具有重要意義。

2.8 PER蛋白表達(dá)的條件優(yōu)化將30，48，72，96 h按照接毒量1，5，8，10 MOI收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液3 000 r/min 離心5 min，收集上清液，進(jìn)行Western blot鑒定，同時使用β-actin作為內(nèi)參(圖8)進(jìn)行修正，選擇表達(dá)量較高的48，72 h的目的條帶和內(nèi)參條帶，用Image J進(jìn)行灰度分析，內(nèi)參修正后，用GraphPad Prism 6.02作圖分析，t檢驗顯示每兩組均滿足P<0.001，差異極顯著，表明10 MOI、48 h的表達(dá)量為最高(圖9)。

2 結(jié)果

2.1 目的基因測序結(jié)果分析本研究所選取的目的基因序列來自于我國南方流行株(GenBank登錄號：AKN45969.1)，為GⅡ-a型流行株，將其與NCBI上已知的我國比較典型的其他毒株的PEDV-RBD序列進(jìn)行基因進(jìn)化分析(圖1)，同源性分析顯示，該氨基酸序列與其他分離株的同源性為93.3%～100.0%，表明RBD基因氨基酸序列具有一定的保守性。

圖1 PEDV-RBD基因分析

2.2 目的基因設(shè)計與合成以PEDV流行株(NCBI ID：AKN45969.1)S蛋白為基礎(chǔ)，利用信號肽預(yù)測工具，保留氨基酸殘基1～18位置作為信號肽，507～640位置為RBD(圖2A)，同時，N端添加Kozak起始序列、Twin-Strep 標(biāo)簽，兩端分別添加酶切位點EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ(圖2B)。

圖2 PEDV-RBD基因結(jié)構(gòu)示意圖

夕陽透過玻璃窗，使整個房子變成了暖調(diào)子，爐上飄著煙，兩老正忙著把拉長的面一片一片地揪下來，扔進(jìn)飄著肉香的鍋里。才讓抽著煙，給我們講述他和張偉的故事。此時此刻我只有一個心愿，回去一定要幫他找到張偉。

Adachi等[14]指出，硅質(zhì)巖的Al/(Al+Fe+Mn)比值由0.01(純熱水成因)至0.60(純生物成因)，并且其比值隨距熱水系統(tǒng)中心距離的增加而變大[15]。研究區(qū)硅質(zhì)巖的Al/(Al+Fe+Mn)比值為0.16～0.48，平均為0.36。在Fe-Mn-Al三角判別圖解(圖2a)中，K6001G01和K9001E01落在熱水成因硅質(zhì)巖區(qū)，K7001H01、K7001H02和M5001G01落入非熱水成因硅質(zhì)巖區(qū)。

M.DL5000 DNA Marker；1.重組質(zhì)粒；2.重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物圖3 pFastBacTMDual-PER酶切鑒定結(jié)果

2.5 重組桿狀病毒rBV-PER的獲得重組桿粒Bacmid-PER轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞7 d內(nèi)產(chǎn)生P1代毒，轉(zhuǎn)染120 h后Sf9細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞變圓、體積變大、破裂，細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞核明顯增大(圖5A)。P3代重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞48 h，出現(xiàn)典型CPE(圖5B)，而正常細(xì)胞無變化(圖5C)，表明重組桿狀病毒rBV-PER拯救成功。

M.DL2000 DNA Marker；1.菌液PCR；2.空白對照圖4 Bacmid-PER菌液PCR鑒定結(jié)果

2.4 重組桿粒Bacmid-PER的鑒定利用表1引物對Bacmid-PER菌液進(jìn)行PCR擴增，結(jié)果顯示，應(yīng)用引物PH-F和M13-R得到約為1 000 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致(圖4)，表明重組桿粒Bacmid-PER構(gòu)建成功。

A.重組桿粒Bacmid-PER轉(zhuǎn)染120 h的Sf9細(xì)胞病變；B.P3代重組桿狀病毒感染48 h的Sf9細(xì)胞病變；C.正常的Sf9細(xì)胞圖5 重組桿狀病毒的拯救(400×)

2.7 重組蛋白pFBD-PER的Western blot鑒定收集感染rBV-PER的Sf9細(xì)胞，用IP裂解液和超聲裂解液破碎，12 000 r/min離心2 min,收取上清制備蛋白樣品。通過SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上，以1∶1 000稀釋Anti-strep tag抗體，1∶1 000稀釋抗PEDV S蛋白抗體，1∶5 000稀釋的山羊抗鼠IgG為二抗，分別進(jìn)行Western blot鑒定，可見25 kDa的目的蛋白條帶，與理論值相符，表明PEDV-RBD蛋白成功表達(dá)并具有反應(yīng)原性(圖7)。

A.正常Sf9細(xì)胞；B.用Anti-strep tag抗體鑒定重組桿粒Bacmid-PER轉(zhuǎn)染120 h的Sf9細(xì)胞；C.用抗PEDV S蛋白抗體鑒定重組桿粒Bacmid-PER轉(zhuǎn)染120 h的Sf9細(xì)胞圖6 IFA鑒定PEDV-RBD蛋白的表達(dá)

2.6 IFA鑒定PEDV-RBD蛋白的表達(dá)利用Anti-strep tag抗體和抗PEDV S蛋白抗體對重組桿狀病毒進(jìn)行IFA鑒定，結(jié)果顯示，正常Sf9細(xì)胞未出現(xiàn)特異性熒光(圖6A)，而感染重組病毒rBV-PER的Sf9細(xì)胞出現(xiàn)特異性熒光(圖6B)，表明外源PEDV-RBD基因在桿狀病毒中成功表達(dá)。

M.蛋白Marker；1. Anti-strep tag抗體鑒定重組蛋白pFBD-PER；2. 抗PEDV S蛋白抗體鑒定重組蛋白pFBD-PER；3. 空白對照圖7 重組蛋白pFBD-PER的Western blot鑒定

1.8 PER蛋白表達(dá)的條件優(yōu)化確定蛋白為可溶性表達(dá)后，按照不同接毒量(MOI為1，5，8,10)和不同表達(dá)時間(30，48，72，96 h)進(jìn)行表達(dá)條件的優(yōu)化，以期獲得PER蛋白表達(dá)的最佳條件。接毒后按照以上時間每次收集1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，然后將細(xì)胞培養(yǎng)液3 000 r/min離心5 min，收集上清液，與內(nèi)參β-actin同時進(jìn)行Western blot鑒定，對Western blot條帶進(jìn)行灰度分析，相應(yīng)的目的條帶數(shù)值減去內(nèi)參條帶數(shù)值，重復(fù)3次，然后用GraphPad Prism 6.02作圖分析。

2.3 重組質(zhì)粒鑒定質(zhì)粒pFBD-PER用EcoR Ⅰ、Xba Ⅰ進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果顯示，可得到1條約為680 bp的目的基因條帶，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖3)。DNA測序鑒定結(jié)果進(jìn)一步表明，目的序列與原序列完全一致。

M.蛋白Marker；1～4.接毒量1，5，8，10 MOI圖8 重組蛋白pFBD-PER的表達(dá)條件優(yōu)化

1～4.接毒量1，5，8，10 MOI；注：每兩組均滿足P<0.001圖9 重組蛋白pFBD-PER的表達(dá)條件優(yōu)化灰度值分析

3 討論

S蛋白作為PEDV的重要抗原，攜帶主要的B淋巴細(xì)胞抗原表位。B細(xì)胞表位由抗原表面的親水性氨基酸組成，容易接近B細(xì)胞受體和抗體分子并被識別，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生與PEDV特異性結(jié)合的中和抗體。

作為經(jīng)濟社會發(fā)展處于全國較高水平、基本公共服務(wù)供給絕對量處于全國領(lǐng)先的長三角地區(qū)，其基本公共服務(wù)是不是也存在比較嚴(yán)重的發(fā)展不均衡問題？與全國相比情況如何？造成這種狀況的主要原因是什么？如何在全面小康目標(biāo)的推進(jìn)中，在區(qū)域基本公共服務(wù)的供給上不斷滿足人民群眾不斷增長的更高質(zhì)量的服務(wù)需求？對于經(jīng)濟社會發(fā)展的一體化水平較高、早已提出率先實現(xiàn)全面高水平小康社會的長三角地區(qū)來說，研究上述問題顯然可以為我們的政策實踐提供價值導(dǎo)向和重要依據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)，用PEDV S1蛋白免疫懷孕母豬，通過其初乳哺乳的仔豬可以獲得針對PEDV的被動體液免疫[15]。MAKADIYA等[16]成功構(gòu)建PEDV S1蛋白的真核表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染人胚腎HEK-293T細(xì)胞，Western blot結(jié)果顯示該蛋白能與PEDV高免血清發(fā)生特異性反應(yīng)；純化該重組蛋白后免疫懷孕母豬，在其血清中即可檢測到高滴度的PEDV中和抗體，PEDV攻毒后免疫組哺乳仔豬未表現(xiàn)出明顯臨床癥狀，且死亡率明顯降低。沈安寧[17]構(gòu)建原核表達(dá)載體，成功表達(dá)PEDV S蛋白并成功制備出單克隆抗體。王加圓[18]構(gòu)建了PEDV S1抗原位點原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體，均成功串聯(lián)表達(dá)S1抗原位點蛋白，用兩種系統(tǒng)表達(dá)的蛋白免疫小鼠后血清中均產(chǎn)生了不同程度的特異性抗體和中和抗體。吳松[19]利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了PEDV S1蛋白，免疫豬后均產(chǎn)生了特異性抗體和中和抗體。武旺盛等[20]用HEK-293T細(xì)胞成功表達(dá)了PEDV S1蛋白，用蛋白免疫巴馬小型豬后，誘導(dǎo)其產(chǎn)生黏膜免疫。

本研究針對的PEDV-RBD是重要的免疫原性區(qū)域，含有多個抗原表位[12]，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體多為中和性抗體，是阻斷病毒與細(xì)胞結(jié)合，刺激宿主免疫反應(yīng)、中和抗體及保護(hù)免疫系統(tǒng)免受病毒感染的主要成分。RBD的受體結(jié)合基序與細(xì)胞受體相互作用，介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的黏附。針對S蛋白RBD的特異性中和單克隆抗體可以有效地阻斷病毒入侵，其被認(rèn)為是一個關(guān)鍵的治療靶點[21]。但尚未見圍繞PEDV受體結(jié)合區(qū)開展表達(dá)或疫苗研究的相關(guān)報道。

（3）STA通過信道1（AP1使用的信道）向AP1發(fā)送802.11解除關(guān)聯(lián)信息，解除STA與AP1間的關(guān)聯(lián)。

本研究選用桿狀病毒作為表達(dá)系統(tǒng)，因其作為一種重要的真核表達(dá)系統(tǒng)，目前研究比較成熟且高效。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)產(chǎn)物在生物學(xué)活性、結(jié)構(gòu)與功能特性、抗原性和免疫原性與天然外源基因產(chǎn)物非常相似。桿狀病毒有很高的種屬特異性，不感染脊椎動物，其表達(dá)產(chǎn)物生物安全性較高[22]。目前已有應(yīng)用該系統(tǒng)進(jìn)行BTV、HPV疫苗研究[23-25]的報道。

本研究將PEDV-RBD基因正確插入桿狀病毒表達(dá)載體，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pFBD-PER，并獲得穿梭質(zhì)粒;利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒，成功地利用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了PEDV-RBD蛋白，所表達(dá)蛋白的相對分子質(zhì)量約為25 kDa；IFA和Western blot檢測結(jié)果均表明，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)能夠正確表達(dá)PEDV-RBD蛋白，且PEDV-RBD蛋白具有良好的抗原性。本研究首次利用昆蟲桿狀病毒真核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了PEDV-RBD蛋白，為進(jìn)一步研究PEDV-RBD蛋白的生物學(xué)功能、研發(fā)診斷試劑、制備基因工程亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)，也為利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行其他冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)提供了依據(jù)。