呂茂杰,王顯兵,孫 晨,3,張 英,車艷杰*,丁 壯,鮑恩東,3* (1.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林 長春 13006;.天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司 生物制品研究院,天津 300308;3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 10095)
豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)[1]的主要病原,該病主要表現(xiàn)為體質(zhì)量下降、呼吸困難、黃疸以及間質(zhì)性肺炎、淋巴結(jié)腫大、肝炎和腎炎等癥狀[2]。PCV2主要感染斷奶仔豬和育肥豬,自1991年在加拿大發(fā)生后,迅速蔓延到各養(yǎng)豬國家,成為目前危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一[3]。豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)是豬支原體肺炎(Mycoplasmalpneumoniaof swine,MPS)(又稱豬氣喘病,也稱地方性肺炎)的主要病原。該病的主要特點為傳染性高、發(fā)病率高和死亡率低,主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難等癥狀,造成食欲減退、生長阻滯、飼料轉(zhuǎn)化率降低及上市時間延遲[4-5]。副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis,HPS)引起的豬多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎,主要臨床癥狀為發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、消瘦、跛行、共濟失調(diào)和被毛粗亂等;剖檢病理變化表現(xiàn)為胸膜炎、肺炎、心包炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等[6-9]。此外,HPS還可引起敗血癥,并且可留下后遺癥,即母豬流產(chǎn)、公豬慢性跛行。HPS的血清型復(fù)雜多樣,按瓊脂擴散血清分型方法,至少可分為15種血清型,另有20%以上的分離株不可定型,目前我國以4,5型最為流行,其次為12,13,14型,而其他血清型均較少[10-11]。
PCV2感染豬后破壞其免疫系統(tǒng),產(chǎn)生免疫抑制,增加了豬對多種病原體的易感性,易與豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬瘟病毒(CSFV)和HPS、豬鏈球菌等混合感染,引發(fā)難以控制的嚴重疾病[12-17]。Mhp很容易引起豬群繼發(fā)感染其他疾病,常與豬流感病毒(SIV)、PRRSV、PRV和PCV2等病毒性疾病和巴氏桿菌病、胸膜肺炎、鏈球菌病和副豬嗜血桿菌病等細菌性疾病混合感染,形成豬呼吸系統(tǒng)疾病綜合征(porcine respiration disease complex,PRDC)[18]。HPS已成為我國各豬場保育仔豬死亡的一個主要原因,一些免疫抑制性的病毒,如PRRSV、PCV等經(jīng)常與該菌混合感染[19],疫苗接種己成為預(yù)防和控制該病的主要措施[20-21]。
鑒于3種病原混合感染的普遍性,目前在臨床實際生產(chǎn)中使用的疫苗多為單價疫苗或二聯(lián)苗,對于3種抗原的三聯(lián)疫苗的使用尚未見報道。本研究通過將PCV2桿狀病毒載體表達的Cap蛋白抗原、Mhp抗原和HPS 4,5型抗原按照一定比例混合,加入適宜佐劑制備PCV2、Mhp、HPS三聯(lián)滅活疫苗,通過對免疫仔豬的安全性、抗體水平和攻毒保護效果的評價,表明該三聯(lián)疫苗的安全性和有效性良好,為實現(xiàn)“一針三防”奠定基礎(chǔ)。
1.1 抗原PCV2 Cap蛋白,由PCV2 RPVS0301株ORF2基因經(jīng)密碼子優(yōu)化的重組桿狀病毒RP-1株接種Sf9細胞制得,經(jīng)濃縮純化后質(zhì)量濃度為200 mg/L,批號P1901;Mhp滅活抗原,質(zhì)量濃度為3 g/L,批號M1901;HPS 4型RPBS0904-11株滅活抗原(含滅活前活菌數(shù)≥1.0×1010CFU/mL)和HPS 5型RPBS0905-3株滅活抗原(含滅活前活菌數(shù)≥1.0×1010CFU/mL),批號為H41901和H51901,均由天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司生物制品研究院制備和提供。
1.2 主要試劑Montanide IMS 1313 VG NST,批號:171115017195,購自法國SEPPIC公司;硫柳汞鈉購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司;PCV2 Cap蛋白單克隆抗體購自浙江大垚生物科技有限公司;Mhp兔源陽性血清,瓊擴效價≥1∶16,由天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司制備;HPS 4,5型兔源陽性血清,抗體效價≥1∶128;SDS-PAGE試劑購自北京索萊寶科技有限公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗鼠IgG,HRP標記山羊抗兔IgG,HRP標記山羊抗豬IgG購自KPL公司;DAB顯色液購自天根生化公司;PCV-2抗體檢測試劑盒購自北京金諾百泰生物技術(shù)有限公司;Mhp抗體檢測試劑盒購自IDEXX公司;HPS血清微量平板凝集試驗(MAT)抗體檢測方法,由本實驗室自建。
1.3 檢驗用菌毒種PCV2 RPVS0301株,F(xiàn)11代,病毒含量106.50TCID50/mL,仔豬的攻毒途徑和劑量為肌注4.0 mL和滴鼻4.0 mL;Mhp JX株,F(xiàn)8代凍干組織毒,最小發(fā)病劑量(MID)為0.005 g,攻毒劑量為100 MID;HPS 4型RPBS0904-11株,F(xiàn)5代,仔豬發(fā)病劑量為3.28×109~4.33×109CFU;HPS 5型RPBS0905-3株,F(xiàn)5代,仔豬發(fā)病劑量為1.68×109~2.21×109CFU;菌毒種均由天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司制備、鑒定、保存和供應(yīng)。
1.4 實驗動物3~4周齡健康易感豬(包括三元仔豬和長大二元仔豬),PCV2 抗原抗體、Mhp抗原抗體、HPS血清抗體及鼻拭子HPS抗原檢測陰性,PRRSV、PRV、SIV血清PCR檢測抗原均為陰性,購自天津周邊散養(yǎng)戶。
1.5 制苗用抗原的檢驗取PCV2 Cap蛋白,Mhp滅活菌體抗原,HPS 4,5型抗原經(jīng)超聲處理后,進行SDS-PAGE分析及Western blot鑒定。在15 V 30 min條件下,轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜(NC)上,4℃、5%脫脂乳封閉過夜,分別用PCV2 Cap蛋白單克隆抗體、Mhp陽性血清、HPS 4,5型陽性血清在37℃作用1 h,PBS洗膜3次,再用1∶5 000倍稀釋的HRP標記的羊抗鼠(或羊抗豬或羊抗兔)IgG 37℃作用1 h,PBS洗膜3次后,進行DAB顯色分析反應(yīng)活性。
1.6 疫苗制備將水相與佐劑按70∶30的體積比混合,500~800 r/min攪拌20~30 min。在終止攪拌前加入1%硫柳汞溶液,使其終濃度為0.005%,充分混勻。最終使每頭份疫苗中含滅活的PCV2 Cap蛋白應(yīng)不低于50 μg,Mhp菌體蛋白應(yīng)不低于100 μg,HPS 4型RPBS0904-11株至少為4.0×109CFU,HPS 5型RPBS0905-3株至少為2.0×109CFU。
1.7 疫苗安全性評價用3~4周齡三元仔豬10頭,其中5頭豬于頸部肌肉注射疫苗4.0 mL/頭(2頭份),5頭作為空白對照,連續(xù)觀察14 d。接種后觀察以下指標:連續(xù)測溫7 d;接種疫苗前后體質(zhì)量變化;接種疫苗后局部和全身不良反應(yīng)情況觀察;接種疫苗后14 d,剖檢所有實驗豬,觀察疫苗接種部位疫苗吸收、肉芽腫情況,并取接種部位組織進行HE染色和分析。
1.8 疫苗有效性評價
1.8.1疫苗免疫 將該三聯(lián)滅活疫苗頸部肌肉注射3~4周齡健康易感豬20頭,2.0 mL/頭,間隔2周采用相同的劑量和途徑進行二免。同時設(shè)攻毒對照豬20頭,空白對照豬5頭。各組豬同條件下隔離飼養(yǎng)。
1.8.2抗體監(jiān)測 采集免疫前、首免后14 d、二免后7 d、二免后14 d血清,檢測PCV2 Cap ELISA抗體效價、Mhp ELISA抗體效價和HPS 4,5型MAT抗體效價。其中,PCV2血清ELISA抗體和Mhp血清ELISA抗體按照試劑盒說明書進行判定;HPS 4,5型MAT抗體檢測中,效價≤1∶4,判為陰性,效價>1∶4判為陽性。
1.8.3PCV2攻毒保護試驗 二免后14 d,從免疫組和攻毒對照組豬中各隨機選取5頭測體質(zhì)量,分別用PCV2 RPVS0301株病毒液攻毒,8.0 mL/頭,同時設(shè)5頭空白對照。攻毒后連續(xù)觀察28 d,于28 d 測體質(zhì)量,采血分離血清,按PCV2 PCR方法檢測血清中PCV2病毒核酸;撲殺所有實驗豬,取腹股溝淋巴結(jié),按免疫組化檢測(IHC)方法檢測PCV2抗原。根據(jù)相對日增重、血清中PCV2病毒核酸和IHC結(jié)果進行判定。a.病毒核酸檢測:攻毒后28 d,采血分離血清,用PCR方法檢測血清中PCV2病毒核酸,出現(xiàn)特異性條帶,判為PCV2病毒核酸檢測陽性,否則,判為陰性。b.淋巴結(jié)IHC:攻毒后28 d,撲殺所有豬,取腹股溝淋巴結(jié),按照IHC方法進行檢測,仔豬腹股溝淋巴結(jié)濾泡內(nèi)可見棕黃色著染,判為PCV2陽性,否則,判為陰性。c.相對日增重:攻毒前與攻毒后28 d,將免疫組、攻毒對照組(不免疫)和空白對照組(不免疫、不攻毒)豬逐頭測體質(zhì)量,用SPSS軟件進行組間平均相對日增重比較,當平均相對日增重與空白對照組比較有顯著性差異時(P<0.05),判為該組仔豬生長發(fā)育不良,有PCV2引起的臨床癥狀。計算公式為:相對日增重=(攻毒后28 d體質(zhì)量-攻毒當日體質(zhì)量)÷(攻毒當日體質(zhì)量×28)。符合上述判定標準中的任意兩項時,即可判為發(fā)病或保護。
1.8.4Mhp攻毒保護試驗 二免后14 d,從免疫組和攻毒對照組豬中各隨機選取5頭,于氣管注射100 MID的Mhp強毒JX株,觀察28 d,撲殺全部實驗豬。按28評分法對各實驗豬的肺炎病變進行評分,計算肺炎病變減少率,按下述標準判定。(1)MPS病變評分標準:通過肺小葉(左尖葉、左心葉、左膈葉、右尖葉、右心葉、右膈葉和副葉)特異性病變面積占各肺小葉總面積的百分比進行量化評定。每個肺小葉未見肺炎病變?yōu)?分;病變面積占肺小葉面積的1%~25%為1分;病變面積占肺小葉面積的26%~50%為2分;病變面積占肺小葉面積的51%~75%為3分;病變面積占肺小葉面積的75%以上為4分。每個肺小葉最高病變評分為4分,7個肺葉病變評分最大為28分。如肺葉正反面均有病變,以病變面積大的一面進行計分。(2)按照以下公式計算各組免疫豬的肺炎病變減少率:肺炎病變減少率=[(對照豬肺炎病變幾何平均分-免疫豬肺炎病變幾何平均分)/對照豬肺炎病變幾何平均分]×100%。
1.8.5HPS 4,5型攻毒保護試驗 二免后14 d,從免疫組和攻毒對照組豬中各隨機選取10頭,其中5頭分別腹腔注射4型RPBS0904-11株菌液3.0 mL(4.1×109CFU),另5頭分別腹腔注射5型RPBS0905-3株菌液3.0 mL(2.30×109CFU)。逐日觀察并記錄仔豬發(fā)病死亡情況至14 d。按下述標準判定:a.死亡;b.出現(xiàn)發(fā)熱癥狀,且體溫升高至40.5℃及以上,并至少持續(xù)2 d;c.出現(xiàn)精神沉郁、喜臥、食欲減退、呼吸困難、跛行等臨床癥狀;d.剖檢可見多發(fā)性漿膜炎(胸膜炎、心包炎、腹膜炎等)、關(guān)節(jié)炎和肺臟表面或腹腔內(nèi)有纖維素性滲出物。符合a判為發(fā)病,或符合d和b或c中的任何一項即可判為發(fā)病。
2.1 抗原檢驗結(jié)果經(jīng)SDS-PAGE(圖1)和Western blot(圖2)檢測,PCV2 Cap蛋白抗原出現(xiàn)28 kDa大小的特異性條帶;Mhp菌體抗原出現(xiàn)大小25~130 kDa的多條蛋白條帶(包括蛋白P36、P46、P65、P74、P97、P102、P110等);HPS 4,5型菌體抗原出現(xiàn)大小10~70 kDa 的多條條帶(包括外膜蛋白和酶)。
M.蛋白Marker;1,3,5,7.PBS對照;2.Cap蛋白;4.Mhp菌體蛋白抗原;6.HPS 4型菌體抗原;8.HPS 5型菌體抗原圖1 4種抗原的SDS-PAGE鑒定結(jié)果
M.蛋白Marker;1,4,5,8.PBS對照;2.Cap蛋白;3.Mhp菌體蛋白抗原;6.HPS 4型菌體抗原;7.HPS 5型菌體抗原圖2 4種抗原的Western blot鑒定結(jié)果
2.2 安全性評價結(jié)果
2.2.1體溫監(jiān)測 疫苗2倍劑量接種實驗豬,個別仔豬在接種疫苗后4 h體溫一過性升高(P<0.01),24 h后恢復(fù)正常,但免疫組與對照組均無顯著性差異(P>0.05)(圖3)。
圖3 體溫變化趨勢圖(**P<0.01)
2.2.2體質(zhì)量監(jiān)測 疫苗2倍劑量接種實驗豬,在免疫前和免疫后14 d對免疫組與對照組分別測體質(zhì)量,利用SPSS軟件分析顯示,免疫組與對照組平均日增重差異不顯著(P>0.05,P=0.619),表明疫苗對仔豬增重?zé)o顯著性影響(圖4)。
圖4 平均相對日增重比較結(jié)果
2.2.3臨床觀察及剖檢結(jié)果 疫苗接種實驗豬后,14 d觀察周期內(nèi)免疫組仔豬全部健活,精神狀態(tài)良好,行為、采食和糞便均正常。觀察期結(jié)束后,各組實驗仔豬注射部位未見明顯的紅腫、硬結(jié),剖檢觀察疫苗吸收良好,無殘留,無肉芽腫的形成;各主要臟器未見異常,未出現(xiàn)全身不良反應(yīng),免疫豬與對照豬相比接種部位剖檢和HE染色檢測無明顯差異;表明該疫苗接種均未引起臨床、局部和全身不良反應(yīng)(表1,圖5)。
表1 臨床觀察結(jié)果
A.免疫豬接種部位;B.免疫豬接種部位病理切片,HE染色;C.未免疫豬接種部位;D.未免疫豬接種部位病理切片,HE染色圖5 免疫豬與未免疫豬接種部位剖檢和病理分析結(jié)果
2.3 免疫豬抗體監(jiān)測疫苗首免后14 d,個別豬只PCV2 Cap ELISA抗體轉(zhuǎn)陽(S/P值≥0.4);二免后14 d,免疫組所有豬的PCV2 Cap ELISA抗體全部轉(zhuǎn)陽,S/P平均值達到1.291±0.091,對照組始終為陰性(S/P值<0.4)(圖6A);疫苗二免后7 d,免疫組所有豬的Mhp ELISA抗體全部轉(zhuǎn)陽(S/P值≥0.4),二免后14 d Mhp ELISA抗體S/P平均值達到1.133±0.150,對照組始終為陰性(S/P值<0.4)(圖6B);疫苗二免后14 d,免疫組所有豬的HPS 4,5型MAT抗體全部轉(zhuǎn)陽,分別為1∶27.9和1∶21.1,對照組始終為陰性(MAT抗體效價<1∶4)(圖6C,D)。
A,B.PCV2、Mhp ELISA抗體變化趨勢; C,D.HPS 4,5型MAT抗體變化趨勢圖6 三聯(lián)苗免疫豬抗體變化
2.4 PCV2攻毒保護試驗在PCV2攻毒試驗中,免疫攻毒組平均相對日增重與空白對照組差異不顯著(P>0.05,P=0.726),攻毒對照組與空白對照組差異不顯著(P>0.05,P=0.423);血清病毒核酸PCR檢測,免疫組4/5陰性,攻毒對照組4/5陽性;免疫組化檢測,免疫組4/5陰性,攻毒對照組5/5陽性。綜合判定,疫苗免疫攻毒組為4/5保護,攻毒對照組4/5發(fā)病,空白對照組5/5正常(表2)。
表2 二免后14 d PCV2攻毒保護結(jié)果
2.5 Mhp攻毒保護試驗由表3、圖7結(jié)果顯示,疫苗免疫組豬肺炎病變減少率為61.35%。
表3 二免后14 d Mhp攻毒保護結(jié)果
2.6 HPS 4,5型攻毒保護試驗HPS 4型免疫豬5/5保護,攻毒對照豬5/5發(fā)病(表4);HPS 5型免疫豬4/5保護,攻毒對照豬4/5發(fā)病(表5);三聯(lián)苗對HPS 4,5型攻毒均達到80%的保護效果。
表4 二免后14 d HPS 4型攻毒保護結(jié)果
表5 二免后14 d HPS 5型攻毒保護結(jié)果
PCV2、Mhp與HPS混合感染給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失,因此,對3種病原的防控尤為重要,目前已上市的用于預(yù)防3種疫病的疫苗包括PCV2全病毒滅活疫苗、PCV2基因工程亞單位疫苗(大腸桿菌源和昆蟲細胞源)、Mhp滅活疫苗、HPS滅活疫苗(二價或三價)、PCV2、MPS二聯(lián)滅活疫苗和PCV2、HPS二聯(lián)滅活疫苗,主要以單苗或二聯(lián)苗為主[22-25],而對于3種抗原的三聯(lián)疫苗尚未見報道。本研究首次研制PCV2、Mhp和HPS三聯(lián)滅活疫苗,豬體試驗證明該疫苗可以提供對3種病原的有效保護。
本研究利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的PCV2 Cap蛋白抗原、Mhp滅活抗原、HPS 4型和5型滅活抗原,結(jié)合水溶性佐劑制備三聯(lián)滅活疫苗。首先對制苗用抗原進行特異性檢驗,PCV2 Cap蛋白大小為28 kDa;對于Mhp菌體抗原,已鑒定清楚的有十幾種免疫相關(guān)蛋白,主要包括細胞質(zhì)蛋白P36,膜蛋白P46、P65和P74,黏附因子P97、P102、P110和P116等[26],本研究鑒定出多條大小相似的條帶;HPS 4,5型菌體抗原的蛋白成分主要為外膜蛋白和酶[27-28],本研究出現(xiàn)相關(guān)大小的條帶;結(jié)果均表明4種制苗抗原特異性良好。在安全性檢驗中,所有免疫豬精神、采食、呼吸、糞便和行為均未見異常,與對照豬無顯著性差異,個別豬體溫在接種疫苗后有一過性升高,24 h后恢復(fù)正常,未見局部和全身不良反應(yīng),與現(xiàn)行《中國獸藥典》和《獸藥質(zhì)量標準》中豬用滅活疫苗安全性檢驗標準要求一致[29-30]。在抗體監(jiān)測中,本研究以50 μg/頭份劑量2次免疫試驗豬,PCV2 ELISA抗體于二免后7 d全部轉(zhuǎn)陽,與未免疫仔豬差異極顯著(P<0.01)。劉國民等[31]報道桿狀病毒表達蛋白以50 μg/頭份劑量1次免疫,免后30 d抗體全部轉(zhuǎn)陽。Mhp ELISA抗體于二免后14 d全部轉(zhuǎn)陽(S/P≥0.4),與未免疫組差異極顯著(P<0.01)。崔騰飛等[32]在Mhp二次免疫效果的跟蹤檢測中,抗體水平低于本研究疫苗。HPS 4,5型MAT抗體于二免后14 d達到1∶16以上,未免疫組為陰性(MAT抗體效價<1∶4)。以上結(jié)果表明疫苗免疫產(chǎn)生了針對3種病原的特異性抗體。在攻毒保護試驗中,疫苗對PCV2強毒攻擊的保護率達到80%(4/5);免疫豬較攻毒對照豬肺炎病變率減少了61.35%;疫苗對HPS 4型強毒攻擊的保護率達到100%(5/5),對HPS 5型強毒攻擊的保護率達到80%(4/5)。綜上所述,本研究制備的三聯(lián)滅活疫苗,在安全性、抗體水平和攻毒保護方面均達到較好效果,將為后續(xù)該三聯(lián)疫苗的研制奠定堅實的基礎(chǔ)。