生長(zhǎng)分化因子11對(duì)高糖環(huán)境中人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞凋亡的影響

游 艷，田蕭羽，曾 浪，黨瑞杰，曾邦兵，朱 彪，李云霞

與非糖尿病患者相比，糖尿病患者的甲狀腺癌發(fā)生率更高[1, 2]。高血糖是甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3]，有研究發(fā)現(xiàn)，高血糖能夠促進(jìn)人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡[4,5]。生長(zhǎng)分化因子11(growth differentiation factor 11, GDF11)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種具有“返老還童”作用的生長(zhǎng)因子，它能改善2型糖尿病小鼠胰島素抵抗，改善胰島β細(xì)胞功能、增加β細(xì)胞數(shù)量并緩解糖尿病的大血管病變及微血管病變等并發(fā)癥[6-8]。但是，GDF11對(duì)高糖環(huán)境下甲狀腺癌的作用尚不清楚。細(xì)胞凋亡過(guò)低可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的一種有效手段[9]。因此，本研究以在高糖環(huán)境中培養(yǎng)的人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞為研究對(duì)象，初步探討GDF11對(duì)高糖環(huán)境下人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器 人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞株(武漢巴菲爾生物科技有限公司)，重組人GDF11蛋白(北京百奧萊博公司)，葡萄糖(美國(guó)Sigma公司)，低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，胰酶、青霉素及鏈霉素(美國(guó)Sigma公司)，B淋巴細(xì)胞瘤2(B-cell lymphoma 2, Bcl-2)抗體(貨號(hào)：AF6139，稀釋比例:1∶1000；美國(guó)Affinity公司)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein, Bax)抗體(貨號(hào)：Ab32503，稀釋比例:1∶3000；英國(guó)Abcam公司)、β-actin 抗體(貨號(hào)：BM0627，稀釋比例為1∶200；武漢博士德公司)及山羊抗兔二抗(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；活性氧(reactive oxygen species, ROS)檢測(cè)試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京建成科技有限公司)；BCA(bicinchoninic acid)測(cè)定試劑盒(武漢博士德公司)；Trizol試劑盒(北京艾德萊生物公司)；PVDF(polyvinylidene fluoride)膜(美國(guó)Millipore公司)。

SW-CJ-1FD型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(蘇州集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司)，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，SpectraMax Gemini型熒光酶標(biāo)儀(上海美谷分子儀器)，BCM-1000A型生物凈化工作臺(tái)(蘇州安泰)，5702R型低速離心機(jī)、Biophotometer核酸蛋白測(cè)定儀(德國(guó)艾本德公司)，DYY-7C型電泳儀、DYCZ-40型轉(zhuǎn)膜儀(北京六一儀器廠)，LW300LFT型正置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.2 細(xì)胞分組 K1細(xì)胞采用含10%胎牛血清的低糖DMEM(培養(yǎng)基中葡萄糖含量為5.6 mmol/L)培養(yǎng)液培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為：對(duì)照組(Vehicle)采用低糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；高糖組(high glucose, HG)將低糖DMEM培養(yǎng)液中的葡萄糖含量提高到33 mmol/L; GDF11干預(yù)組(GDF11)HG+30 g/ml GDF11[10]。各組K1細(xì)胞加藥后繼續(xù)培養(yǎng)3 d進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(培養(yǎng)期間不換液)。

1.3 細(xì)胞凋亡率 取各組細(xì)胞，采用0.25%不含EDTA的胰蛋白酶消化后，1500 r/min離心5 min，PBS重懸細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液備用。加入Annexin V-FITC和PI，分別混勻，于室溫下避光孵育10～15 min后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。采用FlowJo 10.4軟件對(duì)流式數(shù)據(jù)進(jìn)行分析：左上象限(Q1)代表細(xì)胞死亡比例，右上象限(Q2)代表晚期凋亡比例，右下象限(Q3)代表早期凋亡比例，左下象限(Q4)為活細(xì)胞比例，細(xì)胞凋亡率= Q2+Q3。

1.4 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 取各組細(xì)胞，PBS緩沖液沖洗3遍后加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞并提取總蛋白。BCA定量試劑盒測(cè)定總蛋白濃度后，各取40 μg總蛋白，加入5倍上樣緩沖液，于100 ℃水浴10 min 使蛋白變性。凝膠電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、室溫封閉后分別滴加特異性一抗封閉過(guò)夜，再以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗振蕩封閉2 h。最后，用化學(xué)發(fā)光劑染色、顯影并采用Band Scan軟件分析膠片灰度。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子(nuclear factor erythroid 2-related factor, Nrf2)的轉(zhuǎn)錄表達(dá) 取各組細(xì)胞，Trizol試劑盒提取總RNA。然后將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的條件為：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；58 ℃，30 s；70 ℃，45 s。擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 細(xì)胞中ROS檢測(cè) 取各組細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后，1500 r/min離心10 min，PBS重懸細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液。按試劑盒說(shuō)明加液，酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

2 結(jié) 果

2.1 GDF11對(duì)高糖環(huán)境中人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞凋亡的影響 與Vehicle組相比，高糖環(huán)境中人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞的凋亡率降低(P<0.05)，GDF11干預(yù)升高了高糖環(huán)境中人甲狀腺乳頭狀瘤K1細(xì)胞的凋亡率(P<0.05，圖1，表2)。

圖1 各組甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞凋亡率

表2 各組甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞凋亡率、相關(guān)蛋白的表達(dá)、GDF11對(duì)Nrf2轉(zhuǎn)錄及K1細(xì)胞中ROS水平的影響

2.2 GDF11對(duì)高糖環(huán)境中人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與Vehicle組相比，高糖環(huán)境中人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax的表達(dá)比升高(P<0.05)，GDF11干預(yù)降低Bcl-2與Bax表達(dá)比(P<0.05，圖2，表2)。

圖2 各組甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.3 GDF11對(duì)高糖環(huán)境中人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞Nrf2轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響 與Vehicle組相比，高糖環(huán)境中人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞Nrf2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，GDF11干預(yù)降低高糖環(huán)境中人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞Nrf2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)(P<0.05，表2)。

2.4 GDF11對(duì)高糖環(huán)境中人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞ROS水平的影響 與Vehicle組相比，高糖環(huán)境中人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞的ROS水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，而GDF11干預(yù)顯著升高高糖環(huán)境中人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞的ROS水平(P<0.05，表2)。

3 討 論

本研究以在高糖環(huán)境中培養(yǎng)的人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)GDF11能提高K1細(xì)胞的凋亡率，降低抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax的蛋白表達(dá)比，下調(diào)Nrf2基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)并提高K1細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。

氧化應(yīng)激是由細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的ROS和氧化自由基引起的，而Nrf2是體內(nèi)調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要核轉(zhuǎn)錄因子[11]。細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)刺激Nrf2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)與核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而增加抗氧化物酶和II相解毒酶的表達(dá)，從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激和抑制腫瘤發(fā)生的作用[12]。但是，持續(xù)過(guò)度的Nrf2激活可促進(jìn)胰腺癌、肺癌和直腸癌等多種腫瘤的發(fā)生[13]。甲狀腺癌的體外研究也表明，上調(diào)Nrf2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著抑制多種類型甲狀腺癌細(xì)胞的凋亡[14]，反過(guò)來(lái)，下調(diào)Nrf2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)則促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞凋亡[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境中人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞內(nèi)Nrf2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)明顯升高，細(xì)胞凋亡率下降，這與臨床研究中發(fā)現(xiàn)人甲狀腺乳頭狀瘤組織中出現(xiàn)Nrf2高表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[16]。而GDF11干預(yù)能顯著下調(diào)Nrf2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而提高K1細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，即加重了細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體維持自穩(wěn)的一種生理機(jī)制，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的進(jìn)程中也占有重要的地位。細(xì)胞凋亡是在特定的凋亡信號(hào)刺激下，細(xì)胞發(fā)生主動(dòng)死亡的過(guò)程[17]，氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的一個(gè)重要刺激因素。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)ROS的聚集可通過(guò)降低線粒體膜電位并改變細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度來(lái)促進(jìn)人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞凋亡[9]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，GDF11干預(yù)可升高K1細(xì)胞內(nèi)被高糖刺激所降低的ROS水平并提高K1細(xì)胞凋亡率。

Bcl-2是bcl-2家族的重要成員，通過(guò)阻止線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C的釋放來(lái)抑制細(xì)胞凋亡，而Bax可與線粒體膜上的通道蛋白結(jié)合，通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，GDF11干預(yù)提高高糖環(huán)境中K1細(xì)胞凋亡率。同時(shí)，采用western blot技術(shù)檢測(cè)K1細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GDF11干預(yù)能夠降低Bcl-2與Bax的蛋白表達(dá)比，這從另一個(gè)方面佐證了GDF11干預(yù)可以促進(jìn)高糖環(huán)境中K1細(xì)胞凋亡。而Bcl-2蛋白的表達(dá)也受Nrf2的調(diào)控[19, 20]，Nrf2在GDF11干預(yù)降低高糖環(huán)境中K1細(xì)胞Bcl-2表達(dá)中的作用值得進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)GDF11可在體外促進(jìn)高糖環(huán)境中人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞凋亡，GDF11有望被開發(fā)成一種治療糖尿病伴發(fā)甲狀腺乳頭狀癌的新型藥物。