β-catenin與Lgr5在胃癌進(jìn)程中的表達(dá)及其意義

鄭艷敏，劉積平，周小嬪，趙紅艷，于美娜，牛海艷

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率在全世界居第4位，死亡率排在第2位，轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率高[1]。目前，尚缺乏治療胃癌的靶向藥物和個性化治療方案。因此，深入研究胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，早期診斷和治療對胃癌患者預(yù)后和提高其存活率具有重要意義。

Wnt信號途徑是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、運動及凋亡的重要信號傳導(dǎo)系統(tǒng)。研究證實Wnt基因異常/異位表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，參與了細(xì)胞分化、極性形成、增殖和遷移過程[2]。β-連鎖蛋白(β-catenin)是經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)通路的核心，是該信號通路激活的標(biāo)志，其高表達(dá)與多種腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)[3]。富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體5(Lgr5)是Wnt/β-catenin信號通路的靶基因，在人類不同腫瘤過表達(dá)，包括乳腺癌、直腸癌、前列腺癌[4-6]等。前期研究中，我們通過構(gòu)建慢性淺表性胃炎模型檢測Lgr5的表達(dá)情況，結(jié)果表明，持續(xù)的炎性刺激可導(dǎo)致Lgr5表達(dá)增加，Lgr5可能是一種炎性的促腫瘤因子[7]。目前，β-catenin和Lgr5在胃癌中的表達(dá)及意義可見相關(guān)報道，但關(guān)于Wnt信號通路相關(guān)靶基因在從胃炎進(jìn)展到胃癌前病變，再到胃癌過程中是否處于失調(diào)狀態(tài)則少見報道。本研究中我們采用免疫組織化學(xué)方法檢測慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎、胃癌及正常組織中β-catenin及Lgr5的表達(dá)，探索Wnt信號通路靶基因在胃炎到胃癌演變過程中的作用，為胃癌的診斷、防治和判斷預(yù)后提供新思路。

1 對象與方法

1.1 對象 收集2014-03至2015-06在武警特色醫(yī)學(xué)中心住院及門診病例105例，其中正常胃黏膜23例，慢性淺表性胃炎25例，慢性萎縮性胃炎27例，胃癌30例。其中男55例，女50例，年齡24～70歲。所有標(biāo)本用10%多聚甲醛溶液固定過夜，石蠟包埋，制成5 μm切片。

1.2 試劑和抗體 β-catenin抗體(中國博奧森公司)，工作濃度為1∶150。Lgr5抗體(Epitomics)，工作濃度為1∶200。

1.3 HE染色 活檢的胃組織石蠟包埋，切片放在60 ℃烘箱中烘烤30 min，常規(guī)脫蠟，流水沖洗10 min后，蘇木精染色3 min。隨后用流水沖洗10 min，伊紅復(fù)染2 min，流水沖洗10 min，75%乙醇脫水，二甲苯兩次透明，中性樹膠封固。每張切片在200倍顯微鏡下隨機選擇5個視野進(jìn)行觀察。

1.4 免疫組織化學(xué)染色 應(yīng)用兔超敏二步法免疫組化試劑盒行免疫組化染色，胃鏡活檢的胃組織切片用3%的H2O2封閉10 min后，用pH=6.0的枸櫞酸溶液加熱孵育15 min行抗原修復(fù)。冷卻至室溫后用5%的山羊血清37 ℃封閉30 min。分別滴加β-catenin及Lgr5一抗4 ℃過夜。PBS清洗后滴加二抗，37 ℃孵育45 min。PBS清洗后DAB顯色劑顯色，沖洗，蘇木精復(fù)染，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。在Nikon偏振光倒置顯微鏡下觀察免疫陽性反應(yīng)物的分布與定位。隨機選取5個不重復(fù)視野，鏡下計數(shù)形態(tài)完整的β-catenin及Lgr5陽性細(xì)胞，計算各組的平均陽性細(xì)胞數(shù)。用抗體稀釋液代替一抗做陰性對照，每組設(shè)置相應(yīng)的陽性對照。

1.5 結(jié)果判斷 細(xì)胞膜、細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見均勻一致的棕色顆粒定義為染色陽性。于200倍鏡下隨機選取5個視野根據(jù)陽性細(xì)胞比例和染色強度分別行半定量評分。結(jié)果取均值。陽性細(xì)胞比例≤10%、11%～30%、31%～60%、61%～100%分別計0～3分。染色強度按無、弱(淺棕色)、中(棕色)、強(深棕色)分別記0～3分(相應(yīng)染色強度的細(xì)胞比例必須>10%)。總分為兩項計分之和，兩項計分均≥1分判斷為表達(dá)陽性[8]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計數(shù)資料采用絕對數(shù)和率表達(dá)，β-catenin和Lgr5在正常胃黏膜及不同胃病變組織中陽性表達(dá)率比較行χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色結(jié)果 正常胃黏膜中正常腺胃組織，未見異常改變；慢性淺表性胃炎組織中黏膜固有膜、黏膜肌及黏膜下炎細(xì)胞浸潤；萎縮性胃炎組織中腺體減少，炎性細(xì)胞浸潤；胃癌組織中大量纖維化，腺體呈不規(guī)則分布，細(xì)胞核分裂象增多(圖1)。

圖1 不同胃組織病理改變(HE，×200)

2.2 β-catenin在正常胃黏膜及不同胃黏膜病變組織中的表達(dá) β-catenin在正常胃黏膜少量表達(dá)，主要在胞膜上表達(dá)，陽性表達(dá)率為8.7%，在慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎及胃癌中胞膜和胞漿均表達(dá)，陽性表達(dá)率依次增高，分別為28.0%、59.3%、83.3%，β-catenin在正常胃黏膜與不同胃黏膜病變組織中陽性表達(dá)率存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05，圖2，表1)。

圖2 β-catenin蛋白在不同胃組織中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×200)

2.3 Lgr5在正常胃黏膜及不同胃黏膜病變組織中的表達(dá) Lgr5在正常胃黏膜少量表達(dá)或不表達(dá)，主要為膜表達(dá)，陽性表達(dá)率為13.0%。在慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎及胃癌中胞膜和胞漿均表達(dá)，陽性表達(dá)率依次增高，分別為32.0%、66.7%、86.7%，Lgr5在正常胃黏膜與不同胃黏膜病變組織中陽性表達(dá)率存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05，圖3，表1)。

圖3 Lgr5蛋白在不同胃組織中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×200)

表1 β-catenin和Lgr5在不同胃黏膜組織中的表達(dá)情況(n；%)

3 討 論

胃癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率高，其發(fā)病機制目前尚未完全明確，多條信號通路異?；罨谄浒l(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Wnt信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、分化、遷移等生物過程的重要信號傳導(dǎo)通路之一，在機體生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用。Wnt信號通路分為兩類：Wnt1類和 Wnt5a類，前者包括Wnt1，Wnt3a等，主要激活經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路[9]，后者包括Wnt5a，Wnt11等，主要激活非經(jīng)典Wnt信號通路(包括Wnt/JNK通路和Wnt/Ca2+通路[10])。

β-catenin是一種重要的黏附因子，廣泛存在于各種細(xì)胞中，是Wnt信號通路的關(guān)鍵因子，其主要表達(dá)于細(xì)胞膜中，少量表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，與細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等生理過程密切相關(guān)。正常細(xì)胞中沒有Wnt/β-catenin信號通路，因為胞質(zhì)中的β-catenin通過泛素化與蛋白酶體途徑降解。Wnt/β-catenin信號通路激活過程是Wnt配體與低密度脂蛋白(lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP-5/6)受體或卷曲蛋白(frizzled，F(xiàn)ZD)受體結(jié)合導(dǎo)致蓬松蛋白(dishevelled，DVL)磷酸化、多聚泛素化，從而抑制由軸蛋白(Axin)、腸腺瘤樣息肉蛋白(APC)和糖原合成激酶GSK-3β組成的復(fù)合物的活性，使β-catenin不能被GSK-3β磷酸化，導(dǎo)致β-catenin在胞漿內(nèi)積聚并移向核內(nèi)，與T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子/淋巴樣增強因子結(jié)合調(diào)節(jié)下游靶基因表達(dá)，如細(xì)胞周期素D1(cyclinD1)，基質(zhì)金屬蛋白酶-7(MMP-7)、C-myc等[11]。越來越多的研究證實，通路中各因子的不恰當(dāng)激活如Wnt1高表達(dá)和β-catenin膜表達(dá)缺失或核異位表達(dá)等均可導(dǎo)致Wnt通路異常激活，使腫瘤細(xì)胞的粘連性下降，最終導(dǎo)致侵襲性生長和轉(zhuǎn)移，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[12, 13]。

Lgr5又名GPR49，是具有18個富含亮氨酸的重復(fù)單位和7個跨膜區(qū)域組成的大分子蛋白，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，同時也是Wnt信號通路下游的靶基因，廣泛分布于胃、腎、肝臟、卵巢等體內(nèi)多種組織和器官[14, 15]。正常情況下，Lgr5只在成人干細(xì)胞表面呈低水平表達(dá)，多位于隱窩基底部[16]。近年來研究發(fā)現(xiàn)Lgr5在食管癌、結(jié)直腸癌、肝癌等多種腫瘤中過度表達(dá)[17]，參與腫瘤干細(xì)胞異常增殖分化過程。高國安和高超[18]研究表明，Lgr5在胃癌組織中的陽性率顯著高于癌旁組織，且與腫瘤大小、分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。李京偉等[19]通過qRT-PCR和western bolt方法分別檢測不同分化程度的胃癌組織樣本和胃癌細(xì)胞株Lgr5、β-catenin、c-Myc和MMP-7表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在胃癌臨床樣本和胃癌細(xì)胞株中 Lgr5、β-catenin、c-Myc和MMP-7表達(dá)水平隨著胃癌分化程度升高而升高，說明Lgr5與β-catenin通路的異常激活可能促進(jìn)胃癌的惡化。因此，Wnt通路異常激活引起靶基因Lgr5表達(dá)增高，可能與細(xì)胞的增殖分化和惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

在本研究中，β-catenin在正常胃黏膜中屬于膜表達(dá)，在慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎和胃癌中的表達(dá)依次遞增，尤其在胃癌中是強表達(dá)，并且屬于胞膜、胞漿均表達(dá)。這與Mao等[20]在細(xì)胞水平上檢測的結(jié)果基本相似。他通過往胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)入Wnt1，證實Wnt1促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，通過蛋白和基因水平方面證實Wnt1以及β-catenin表達(dá)量相對增高，同時他還轉(zhuǎn)入siRNA干擾Wnt1發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞中Wnt1及β-catenin表達(dá)相對其他對照組減少。Lgr5在正常胃黏膜、慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎以及胃癌中的表達(dá)也是呈現(xiàn)逐級遞增。在本研究中顯示有部分慢性淺表性胃炎組織β-catenin、Lgr5表達(dá)就已經(jīng)開始增高，所以推測Wnt通路在早期就已經(jīng)激活，在持續(xù)的炎性刺激下促進(jìn)靶基因β-catenin、Lgr5表達(dá)增加，從而影響胃癌的發(fā)生和發(fā)展。由此推測lgr5、β-catenin可能是胃癌的癌干細(xì)胞標(biāo)記物，是判斷胃癌前病變Wnt/β-catenin信號通路異?；罨闹匾獦?biāo)志物。從淺表性胃炎、萎縮性胃炎到胃癌發(fā)生發(fā)展過程中Wnt/β-catenin通路處于激活狀態(tài)，其異?；罨c胃癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。本研究為胃癌發(fā)病機制的研究、靶向藥物治療和預(yù)后評估提供新思路和理論依據(jù)，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。

由于Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路除了Wnt/β-catenin通路外，還有Wnt/Ca2+信號通路及c-Jun N端激酶介導(dǎo)的細(xì)胞極性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，具體發(fā)病機制還有待于我們進(jìn)行更深入的研究。