流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群的常見(jiàn)問(wèn)題及其解決方案

段萃娟，凌愛(ài)琴，張 翠，王瑞玲，宋 娜，王玉飛

淋巴細(xì)胞亞群是構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)的主要細(xì)胞群，參與機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫，它可通過(guò)流式細(xì)胞儀被檢測(cè)，臨床上多用于監(jiān)測(cè)腫瘤、感染、移植、過(guò)敏患者的免疫狀況。流式細(xì)胞儀(flow cytometer，F(xiàn)CM)集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)的研究[1-4]。本研究對(duì)解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科2018年流式細(xì)胞儀日常檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群過(guò)程中遇到的常見(jiàn)問(wèn)題進(jìn)行分析、總結(jié)，并提出解決方案，以提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 樣本與儀器設(shè)備 選取2018年檢測(cè)的淋巴細(xì)胞亞群樣本14 236例?？崭共杉疎DTA-K2抗凝靜脈血3 ml。使用邁瑞B(yǎng)riCyteE6流式細(xì)胞儀,試劑均為深圳邁瑞公司產(chǎn)品：四色流式試劑CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC，CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC，F(xiàn)low-Count標(biāo)準(zhǔn)熒光微粒及FACS溶血素(10×)。

1.2 方法

1.2.1 流式細(xì)胞儀質(zhì)控測(cè)試 采用Flow-Count標(biāo)準(zhǔn)熒光微粒，通過(guò)MRFlow軟件自動(dòng)完成對(duì)儀器的質(zhì)量控制。

1.2.2 樣品制備 取2只檢測(cè)管，分別標(biāo)記A和B，A管內(nèi)加入20 μl CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC抗體，B管內(nèi)加入20 μl CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC抗體，然后分別加入50 μl EDTA抗凝靜脈血至管底。試管在旋渦混勻器上輕旋混勻，室溫避光孵育15 min；向試管內(nèi)加入1×溶血素450 μl，在旋渦混勻器上輕旋混勻，室溫避光孵育15 min；待紅細(xì)胞充分裂解后，渦旋混勻，分別上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 流式分析 應(yīng)用MRFlow軟件自動(dòng)分析，CD45/SSC散點(diǎn)圖建立P1門(mén)選中淋巴細(xì)胞，CD3/CD4、CD3/CD8、CD4/CD8、CD3/CD19、CD3/CD16+56散點(diǎn)圖建立十字門(mén)圈定對(duì)應(yīng)區(qū)域的細(xì)胞(以CD3/CD4為例)。A管建立CD45/SSC、CD3/CD4、CD3/CD8、CD4/CD8散點(diǎn)圖，B管建立CD45/SSC、CD3/CD19、CD3/CD16+56散點(diǎn)圖，從而獲得淋巴細(xì)胞各亞群的絕對(duì)計(jì)數(shù)和百分比。

2 結(jié) 果

2.1 CD45-SSC門(mén)散點(diǎn)圖分群不清 正常情況下，CD45/SSC散點(diǎn)圖中可圈出CD45淋巴細(xì)胞(圖1A)，但是在1例腎病綜合征患者進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)時(shí)，散點(diǎn)圖中無(wú)法圈出CD45淋巴細(xì)胞(圖1A)，絕對(duì)計(jì)數(shù)和分類結(jié)果均受影響。

2.2 十字門(mén)分類散點(diǎn)圖分群不清 正常情況下，CD3/CD4、CD3/CD8、CD4/CD8、CD3/CD19、CD3/CD16+56散點(diǎn)圖可用十字門(mén)進(jìn)行明確的區(qū)域劃分(圖1)。在檢測(cè)時(shí)，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)散點(diǎn)圖彌散、蔓延其他區(qū)域，無(wú)法明確分區(qū)的情況(圖1B)，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞各亞群分類有誤，以至于各亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)和百分比結(jié)果不準(zhǔn)確。該種情況主要見(jiàn)于溶血時(shí)間不夠、紅細(xì)胞過(guò)多或病態(tài)紅細(xì)胞導(dǎo)致的溶血不充分。

2.3 淋巴細(xì)胞亞群無(wú)法分群 部分肝移植患者在檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群時(shí)會(huì)出現(xiàn)無(wú)法分群的情況。有CD45-SSC無(wú)法分群(圖2A)，部分患者CD3、CD4、CD8、CD19及CD16+56散點(diǎn)圖無(wú)法分群(以CD3/CD4、CD3/CD19散點(diǎn)圖為例，見(jiàn)圖2B、3C)，而不能獲得絕對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果。

2.4 淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)假性減低 當(dāng)患者血細(xì)胞出現(xiàn)聚集狀態(tài)時(shí)，淋巴細(xì)胞不能充分地同特異性熒光標(biāo)記抗體相結(jié)合，從而導(dǎo)致淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果假性降低。圖2A就是一例不明原因無(wú)法分群而導(dǎo)致的絕對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果假性減低，在審圖時(shí)發(fā)現(xiàn)結(jié)果異常。

2.5 解決方案

2.5.1 上機(jī)前溶血素清洗 上機(jī)前在試管內(nèi)加入雙倍體積溶血素(900 μl)，震蕩混勻，待紅細(xì)胞充分裂解管中液體變得透亮后上機(jī)檢測(cè)，同時(shí)調(diào)整儀器的體積倍數(shù)；或者加入溶血素后150 g離心5 min，小心吸取450 μl上清棄除，以保持上樣前體積倍數(shù)不變。如果結(jié)果不理想可再次重復(fù)操作。該方法主要適用于利用體積法絕對(duì)計(jì)數(shù)的流式細(xì)胞儀，可以解決其十字門(mén)分類散點(diǎn)圖分群不清的問(wèn)題(圖1D)。

2.5.2 樣品制備前生理鹽水清洗 在樣本制備前，取200 μl全血加入800 μl生理鹽水，震蕩混勻后150 g離心5 min，小心吸取上清棄除，重復(fù)操作一次后，將剩余的200 μl沉淀混勻。此后再按照1.2.3的方法制備樣品及上機(jī)檢測(cè)。該方法可以解決高凝狀態(tài)標(biāo)本、藥物等不明原因引起CD45-SSC門(mén)散點(diǎn)圖分群不清、淋巴細(xì)胞亞群無(wú)法分群以及淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)假性減低的問(wèn)題(圖1C、圖2D、圖2E、圖2F)。

3 討 論

隨著流式細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，流式細(xì)胞儀的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，流式細(xì)胞儀的品牌及種類也越來(lái)越多。目前流式細(xì)胞儀測(cè)量淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)的單平臺(tái)方法有兩種，一種是基于Trucount管的微球法，另一種是基于流量傳感器的體積法，這兩種方法之間具有較好的一致性[5]。我們使用的是邁瑞B(yǎng)riCyte E6流式細(xì)胞儀，其絕對(duì)計(jì)數(shù)方法是基于流量傳感器的體積法，具有較好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性[6-8]。但是，由于體積法為了保證樣本體積精確，加溶血素后直接上機(jī)，易導(dǎo)致檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)散點(diǎn)圖分群不清的問(wèn)題，對(duì)此，我們根據(jù)BriCyte E6流式細(xì)胞儀絕對(duì)計(jì)數(shù)原理提出了相應(yīng)的解決方法：(1)上機(jī)前溶血素清洗。上機(jī)前在試管內(nèi)加入雙倍體積溶血素(900 μl)，震蕩混勻，待紅細(xì)胞充分裂解管中液體變得透亮后上機(jī)檢測(cè)，同時(shí)調(diào)整儀器的體積倍數(shù)；或者加入溶血素后150 g離心5 min，小心吸取450 μl上清棄除，以保持上樣前體積倍數(shù)不變。如果結(jié)果不理想可再次重復(fù)操作。該方法主要適用于利用體積法絕對(duì)計(jì)數(shù)的流式細(xì)胞儀，可以解決其十字門(mén)分類散點(diǎn)圖分群不清的問(wèn)題(圖1D)。(2)樣品制備前生理鹽水清洗。在樣本制備前，取200 μl全血加入800 μl生理鹽水，震蕩混勻后150 g離心5 min，小心吸取上清棄除，重復(fù)操作1次后，將剩余的200 μl沉淀混勻。此后再制備樣品及上機(jī)檢測(cè)。該方法可以解決高凝狀態(tài)標(biāo)本、藥物等不明原因引起CD45-SSC門(mén)散點(diǎn)圖分群不清、淋巴細(xì)胞亞群無(wú)法分群以及淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)假性減低的問(wèn)題(圖1C、圖2D、圖2E、圖2F)。

圖1 外周血淋巴細(xì)胞亞群分群不清散點(diǎn)圖清洗前后對(duì)比

上機(jī)前溶血素清洗主要解決藥物、血液病等原因引起的紅細(xì)胞不完全溶血、血小板碎片過(guò)多的問(wèn)題。另外，感染、炎癥、血液病等引起的白細(xì)胞增高、組織破壞引起的纖維蛋白增高也可以影響淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)結(jié)果，樣品制備前生理鹽水清洗可以解決這些問(wèn)題，特別是白細(xì)胞嚴(yán)重增高的標(biāo)本，使用生理鹽水稀釋后根據(jù)其稀釋比例調(diào)整儀器計(jì)算體積比得到絕對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果。為了保證結(jié)果的可靠性，對(duì)需要清洗標(biāo)本在實(shí)驗(yàn)室日常使用的質(zhì)控在控、運(yùn)行正常的SYSMEX XN-2000全血細(xì)胞分析儀上進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)淋巴細(xì)胞絕對(duì)值進(jìn)行比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果具有較好的一致性(ICC=0.915，P<0.001)。

肝腎移植患者術(shù)后需要定期監(jiān)測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群，評(píng)估機(jī)體免疫狀態(tài)，以期為臨床進(jìn)行免疫干預(yù)治療提供參考依據(jù)[9-12]。但是，移植患者，尤其是長(zhǎng)期生存的移植受者，由于術(shù)后長(zhǎng)期使用免疫抑制劑可能會(huì)影響到淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)結(jié)果，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞亞群無(wú)法分群的現(xiàn)象。圖2B、C即為1例肝移植術(shù)后12年的移植受者外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果圖，該患者術(shù)后長(zhǎng)期使用免疫抑制劑，突然以臨床突發(fā)蛋白尿、血尿入院，其他結(jié)果均正常。此類患者導(dǎo)致淋巴細(xì)胞亞群無(wú)法分群的具體原因目前尚不清楚，推測(cè)可能與外周血中存在干擾物質(zhì)有關(guān)，因此通過(guò)樣品制備前生理鹽水清洗可以較好地解決該類問(wèn)題。

淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)假性降低多見(jiàn)于慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)晚期患者。在CKD患者血漿中，F(xiàn)g、PT、D-D 等凝血因子升高，同時(shí)還存在TC、ET-1、Ca2+、ALB、CRP 等影響CKD 高凝狀態(tài)的危險(xiǎn)因素[13-16]。這些可使患者的外周血細(xì)胞出現(xiàn)聚集狀態(tài)，從而不能充分地同抗體相結(jié)合，導(dǎo)致絕對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果假性減低(圖2A)。樣品制備前生理鹽水清洗可去除血細(xì)胞的高聚狀態(tài)，從而可以較好地解決該問(wèn)題。

圖2 外周血淋巴細(xì)胞亞群無(wú)法分群散點(diǎn)圖清洗前后對(duì)比

邁瑞B(yǎng)riCyte E6流式細(xì)胞儀在進(jìn)行結(jié)果分析時(shí)，需要計(jì)算標(biāo)本體積和上樣管內(nèi)體積之比，正常情況為1∶10.4。為防止反復(fù)清洗過(guò)程中棄除上清造成的體積不準(zhǔn)確，在溶血素清洗過(guò)程中可以省略棄上清這一步，直接調(diào)整儀器的計(jì)算體積比從而得到可靠的計(jì)數(shù)結(jié)果。同樣，在生理鹽水清洗過(guò)程，若不能棄去與加入生理鹽水同等體積的上清，也可以根據(jù)加樣比例來(lái)調(diào)整儀器計(jì)算體積比。

由于邁瑞流式細(xì)胞儀是根據(jù)體積法進(jìn)行的計(jì)數(shù)，在樣品制備過(guò)程中需要特別注意加樣的準(zhǔn)確性，因此對(duì)操作人員的加樣要求較嚴(yán)格。在樣品制備過(guò)程中最好使用反向加樣法，反向加樣法適用于黏稠液體，不但可以保證體積的準(zhǔn)確、無(wú)氣泡，而且不用打出多余的體積。加樣前拭去槍頭外黏附的多余液體也是提高加樣準(zhǔn)確性的方法之一。

綜上所述，本研究根據(jù)所使用的流式細(xì)胞儀絕對(duì)計(jì)數(shù)原理，建立相應(yīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群常見(jiàn)問(wèn)題的處理方案，可以提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。而且由于解決方案簡(jiǎn)便可行，適合推廣應(yīng)用。