補(bǔ)骨脂富含的異戊烯基成分對(duì)CYP1A1活性的影響及分子對(duì)接驗(yàn)證

秦子飛,王培樂(lè),邢晗,韓立,卞華,楊晶,張曉堅(jiān)

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450052;2.河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 南陽(yáng) 473004;3.河南省精準(zhǔn)臨床藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450052)

CYP1A1是一種重要的細(xì)胞色素P450酶,主要分布于肝臟、腸道等器官[1]。它可以通過(guò)結(jié)構(gòu)中血紅素的鐵離子傳遞電子,氧化多環(huán)芳烴類(lèi)物質(zhì)、黃曲霉毒素等致癌物,在致癌物的活化和解毒過(guò)程中起著重要的作用[2]。此外,雌激素經(jīng)CYP1A1氧化形成非致癌性的2-羥基雌激素,經(jīng)CYP1B1催化生成致癌性的4-羥基雌激素。雌激素的氧化代謝產(chǎn)物具有DNA損傷效應(yīng),與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān),高4-羥基雌激素/2-羥基雌激素比值已經(jīng)成為判斷腫瘤形成的重要標(biāo)志[3]。因此,CYP1A1在外源物清除及內(nèi)源物水平穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。

補(bǔ)骨脂是我國(guó)常用傳統(tǒng)中藥,具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、補(bǔ)脾健胃之功效,臨床上常用于治療骨質(zhì)疏松、骨折等疾病[4-7]。香豆素、異戊烯基成分等是補(bǔ)骨脂的主要成分,也可能是其發(fā)揮藥效的活性成分[8]。已有研究表明補(bǔ)骨脂所含的香豆素Bakuchicin(補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物)能顯著抑制CYP1A的活性,對(duì)CYP1A1和CYP1A2均表現(xiàn)出競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用,抑制常數(shù)Ki值分別為0.11、0.32 μmol·L-1[9]。此外,補(bǔ)骨脂富含的異戊烯基黃酮類(lèi)成分的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物6-Prenylnaringenin,可以通過(guò)作用于CYP1A1和CYP1B1,調(diào)節(jié)雌激素的羥基化代謝,進(jìn)而起到植物雌激素樣作用[10]。補(bǔ)骨脂富含的成分可能通過(guò)藥物-藥物相互作用或改變內(nèi)源物代謝影響機(jī)體的生理狀態(tài)。

目前,關(guān)于補(bǔ)骨脂富含的異戊烯基成分對(duì)CYP1A1的抑制活性評(píng)價(jià)未見(jiàn)報(bào)道,這也增加了其可能出現(xiàn)不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)?；诖四康?本實(shí)驗(yàn)將重點(diǎn)探討補(bǔ)骨脂富含的異戊烯基成分對(duì)CYP1A1的抑制活性評(píng)價(jià),并結(jié)合分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,以期發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂中具有抑制CYP1A1活性的小分子化合物,為臨床解釋補(bǔ)骨脂不良反應(yīng)和合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用(UHPLC-TQD-MS)儀:色譜系統(tǒng)為Waters ACQUITY I-Class超高效液相色譜儀(包括二元梯度泵,自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱),質(zhì)譜系統(tǒng)為Waters TQD三重四級(jí)桿質(zhì)譜,配套Masslynx 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);BP211D精密電子天平購(gòu)于北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;MTC-100恒溫振蕩器購(gòu)于杭州米歐儀器有限公司;QL-861渦旋儀購(gòu)于海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司;3K-15高速冷凍離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)Sigma公司。

1.2 試劑與藥品

補(bǔ)骨脂藥材購(gòu)于河南張仲景大藥房,產(chǎn)自河南南陽(yáng)，經(jīng)王培樂(lè)博士和卞華教授鑒定為正品。補(bǔ)骨脂二氫黃酮、補(bǔ)骨脂定、異補(bǔ)骨脂查爾酮、異補(bǔ)骨脂二氫黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚(純度>98%)均購(gòu)于大連美侖生物技術(shù)有限公司(圖1);氯化鎂、NADPH、7-乙氧基試鹵靈和試鹵靈均購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司;重組CYP1A1酶購(gòu)于美國(guó)Corning公司;甲醇、乙腈和水均為色譜純,購(gòu)于北京迪科馬科技有限公司;其他有機(jī)溶劑均為分析純或以上。

圖1 補(bǔ)骨脂富含的異戊烯基成分的結(jié)構(gòu)

1.3 樣品制備

取補(bǔ)骨脂粉末(過(guò)3號(hào)篩)約0.1 g,精密稱(chēng)定,置25 mL容量瓶中,加70%乙醇水溶液20 mL,超聲30 min(30 ℃，100 kHz),待溶液冷卻至常溫,加70%乙醇水溶液,定容至刻度,搖勻,過(guò)0.22 μm微孔濾膜,取濾液即得。HPLC-UV法分析結(jié)果顯示[11],異補(bǔ)骨脂二氫黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、補(bǔ)骨脂定、異補(bǔ)骨脂查爾酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚含量分別為0.36、3.37、2.33、5.59、8.24 mg·g-1。分別精密稱(chēng)取適量補(bǔ)骨脂二氫黃酮、補(bǔ)骨脂定、異補(bǔ)骨脂查爾酮、異補(bǔ)骨脂二氫黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚標(biāo)準(zhǔn)品,加入容量瓶,加入適量甲醇溶液,配制成濃度為10 mmol·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2 方法

2.1 體外孵育體系

體外孵育體系包括Tris-HCl溶液(50 mmol·L-1,pH=7.4),氯化鎂(5 mmol·L-1),底物(7-乙氧基試鹵靈溶液)，不同濃度抑制劑(補(bǔ)骨脂提取物或不同補(bǔ)骨脂異戊烯基成分)和CYP1A1溶液,將上述溶液混合后,在恒溫(37 ℃)振蕩器內(nèi),預(yù)孵育5 min,然后加入NADPH溶液(1 mmol·L-1),正式啟動(dòng)代謝反應(yīng)[12]。孵育一定時(shí)間后,加入等體積的冰乙腈終止反應(yīng),將溶液渦旋30 s,13 800 r·min-1離心10 min,取2 μL上清液,進(jìn)樣UHPLC-TQD-MS分析。

2.2 抑制活性評(píng)價(jià)

7-乙氧基試鹵靈(1 μmol·L-1)作為CYP1A1的探針底物,被用作評(píng)價(jià)補(bǔ)骨脂異戊烯基成分對(duì)CYP1A1活性的影響[12]。將7-乙氧基試鹵靈分別與不同濃度補(bǔ)骨脂提取物(0、1、10、100 mg·mL-1)或不同補(bǔ)骨脂異戊烯基成分(0、1、10、100 μmol·L-1)混合孵育,以不加上述補(bǔ)骨脂相關(guān)成分為對(duì)照組,評(píng)價(jià)補(bǔ)骨脂及補(bǔ)骨脂異戊烯基成分對(duì)CYP1A1的抑制活性。

以不同濃度補(bǔ)骨脂提取物(0、1、2.5、5、10、20、25、50、100 mg·mL-1)及其異戊烯基成分(補(bǔ)骨脂二氫黃酮、補(bǔ)骨脂定和異補(bǔ)骨脂查爾酮濃度為0、0.1、0.2、0.4、0.8、1、10、20 μmol·L-1;異補(bǔ)骨脂二氫黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚濃度為0、1、2、4、8、10、20、40 μmol·L-1)對(duì)7-乙氧基試鹵靈代謝的抑制活性為縱坐標(biāo),抑制劑的濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行非線性擬合,得到各抑制劑對(duì)CYP1A1的IC50值。通常,IC50<1 μmol·L-1為強(qiáng)抑制活性;IC50在1～10 μmol·L-1之間為中等強(qiáng)度抑制活性;IC50>10 μmol·L-1,為弱抑制活性[12]。

2.3 抑制反應(yīng)動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)

3種動(dòng)力學(xué)模型包括競(jìng)爭(zhēng)性抑制(方程1)、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制(方程2)和混合型抑制(方程3)。應(yīng)用這3種模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,計(jì)算出各自的赤池信息量準(zhǔn)則(Akaike information criterion,AIC)和施瓦茨信息準(zhǔn)則(Schwarz criterion,SC)值,AIC和SC值越小,模型擬合越合適,同時(shí)獲得相應(yīng)合適的Ki值[12]。V代表反應(yīng)速度;[S]和[I]分別是7-乙氧基試鹵靈和不同補(bǔ)骨脂異戊烯基成分的濃度;Ki代表酶與不同抑制劑之間的親和力;Km為米氏常數(shù),是酶促反應(yīng)達(dá)最大速度(Vmax)一半時(shí)的底物[S]的濃度;αKi是反映不同抑制劑與酶和相應(yīng)底物復(fù)合物親和力的參數(shù);當(dāng)α值遠(yuǎn)大于1時(shí),不同抑制劑的結(jié)合阻礙了酶與底物的結(jié)合,混合抑制模型變?yōu)楦?jìng)爭(zhēng)抑制模型。

(1)

(2)

(3)

2.4 分析條件

色譜條件:BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm),流動(dòng)相為水(A)和乙腈(B)(二者均包含0.1%的甲酸),洗脫程序?yàn)?～0.4 min,10%B;0.4～1.4 min,10%～95%B;1.4～1.6 min,95%B;1.6～1.8 min,95%～10%B;1.8～2.0 min,10%B;流速為0.3 mL·min-1;柱溫35 ℃;進(jìn)樣體積2 μL。質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI);離子源毛細(xì)管電壓3.5 kV;離子源溫度350 ℃;脫溶劑氣流速650 L·h-1;正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM),代謝產(chǎn)物試鹵靈的母離子→子離子對(duì)為214.050→186.020,錐孔電壓為60 V,二級(jí)碎裂能為25 V。

2.5 分子對(duì)接

為進(jìn)一步了解競(jìng)爭(zhēng)性抑制成分(補(bǔ)骨脂二氫黃酮與異補(bǔ)骨脂查爾酮)與CYP1A1的相互作用機(jī)理,我們采用Autodock 4.2軟件進(jìn)行分子對(duì)接。從PDB蛋白晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載CYP1A1蛋白與選擇性抑制劑α-萘黃酮的蛋白-配體結(jié)晶復(fù)合物(PDB:4I8V)[13-14],以此為模板,選擇高精度對(duì)接模式,先將蛋白復(fù)合物中水分子和SO4等其他小分子配體去除,然后進(jìn)行加氫處理,以配體α-萘黃酮所結(jié)合的口袋為參照自動(dòng)生成結(jié)合活性口袋,其他參數(shù)如未加以說(shuō)明,均按默認(rèn)參數(shù)設(shè)置。然后將補(bǔ)骨脂二氫黃酮與異補(bǔ)骨脂查爾酮分別對(duì)接到上述活性口袋,利用可視化軟件將對(duì)接后的配體-蛋白復(fù)合物進(jìn)行作圖,并標(biāo)示在配體5 ?距離范圍內(nèi)的氨基酸殘基。此外,應(yīng)用拉馬克遺傳算法分別計(jì)算補(bǔ)骨脂二氫黃酮、異補(bǔ)骨脂查爾酮與CYP1A1結(jié)構(gòu)對(duì)接的結(jié)合自由能,不同形式的對(duì)接結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)不同的結(jié)合自由能,結(jié)合自由能越低表示該種對(duì)接結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定,即最優(yōu)結(jié)構(gòu)[15];同時(shí),我們還通過(guò)分析氫鍵與疏水作用揭示CYP1A1分別與補(bǔ)骨脂二氫黃酮和異補(bǔ)骨脂查爾酮的相互作用[15]。

2.6 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)骨脂及其異戊烯基成分對(duì)CYP1A1活性的影響

如圖2所示,當(dāng)補(bǔ)骨脂提取物為10 mg·mL-1時(shí),CYP1A1剩余的催化活性為對(duì)照組的62%,而當(dāng)提取物濃度為100 mg·mL-1時(shí),剩余活性?xún)H為對(duì)照組的3%;通過(guò)數(shù)據(jù)擬合(圖3),得到補(bǔ)骨脂提取物對(duì)CYP1A1的抑制IC50值為14.97 mg·mL-1,見(jiàn)表1。

圖2 補(bǔ)骨脂提取物及5個(gè)異戊烯基成分 對(duì)CYP1A1的抑制活性

補(bǔ)骨脂二氫黃酮、補(bǔ)骨脂定和異補(bǔ)骨脂查爾酮對(duì)CYP1A1均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性,當(dāng)3者濃度均為1 μmol·L-1時(shí),CYP1A1剩余的催化活性分別為對(duì)照組的21.2%、31.3%和26.1%(圖2),隨后計(jì)算得到IC50值分別為0.28、0.49、0.36 μmol·L-1(圖3)。異補(bǔ)骨脂二氫黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)CYP1A1表現(xiàn)出中等強(qiáng)度的抑制,即當(dāng)2者濃度為1 μmol·L-1時(shí),CYP1A1的剩余活性分別為61.3%和93.1%(圖2),IC50值分別為2.24 μmol·L-1和4.07 μmol·L-1(圖3)。

3.2 補(bǔ)骨脂異戊烯基成分對(duì)CYP1A1抑制機(jī)制

本研究?jī)H對(duì)具有強(qiáng)抑制活性的補(bǔ)骨脂異戊烯基成分(補(bǔ)骨脂二氫黃酮、補(bǔ)骨脂定和異補(bǔ)骨脂查爾酮)對(duì)CYP1A1的機(jī)制進(jìn)行深入探討。根據(jù)最小AIC和SC值即為最佳抑制模型的原則(表1),補(bǔ)骨脂二氫黃酮和異補(bǔ)骨脂查爾酮對(duì)CYP1A1表現(xiàn)出競(jìng)爭(zhēng)性抑制模式,而補(bǔ)骨脂定對(duì)CYP1A1表現(xiàn)出非競(jìng)爭(zhēng)性抑制模式。此外,補(bǔ)骨脂二氫黃酮、補(bǔ)骨脂定和異補(bǔ)骨脂查爾酮對(duì)CYP1A1的Dixon圖(圖4)也為上述判斷提供了強(qiáng)有力的證據(jù)。數(shù)據(jù)擬合得到的Ki值分別為0.12、0.59、0.23 μmol·L-1(表1)。

圖3 補(bǔ)骨脂提取物及5個(gè)異戊烯基成分對(duì)CYP1A1的抑制曲線和IC50值

圖4 補(bǔ)骨脂二氫黃酮、補(bǔ)骨脂定和異補(bǔ)骨脂查爾酮對(duì)CYP1A1介導(dǎo)的7-乙氧基試鹵靈去乙氧基活性的抑制作用

表1 補(bǔ)骨脂異戊烯基成分對(duì)CYP1A1抑制作用的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

3.3 分子對(duì)接

圖5 α-萘黃酮與CYP1A1的氨基酸殘基相結(jié)合的活性位點(diǎn)(A)、氫鍵作用(B)與疏水作用(C)

3.3.1α-萘黃酮與CYP1A1的分子對(duì)接 通過(guò)分析活性位點(diǎn)發(fā)現(xiàn),α-萘黃酮與CYP1A1氨基酸殘基特異性結(jié)合的活性位點(diǎn)為Asp320、Phe224、Ser116、Ile386、Leu496、Thr497、Thr321、Ser122、Phe123、Ala317、Phe319、Gly316、Asp313、Ser120、Ile115、Leu312、Asn222、Asn255、Leu254和Phe258(圖5A);此外,α-萘黃酮與CYP1A1氨基酸殘基Ser116連接形成1個(gè)氫鍵,并與Phe224相連接形成1個(gè)π-π鍵(圖5B);α-萘黃酮與CYP1A1的氨基酸殘基Leu496、Thr321、Asp320、Ala317、Phe319、Phe224、Asp313、Phe258、Gly316、Ile115、Ser116、Asn255和Leu312相連接形成疏水作用(圖5C)。α-萘黃酮與CYP1A1的結(jié)合自由能為-10.861 kcal·mol-1(1 kcal=4.2 kJ)。

3.3.2 補(bǔ)骨脂二氫黃酮、異補(bǔ)骨脂查爾酮與CYP1A1的分子對(duì)接 對(duì)接結(jié)果顯示,補(bǔ)骨脂二氫黃酮與CYP1A1氨基酸殘基特異性結(jié)合的活性位點(diǎn)為Phe123、Ser122、Phe319、Asp320、Thr321、Thr497、Val382、Leu496、Thr385、Ile386、Ala317、Phe224、Gly316、Asp313、Leu254、Leu312、Phe258、Asn255、Ile115、Ser116和Tyr259(圖6A);補(bǔ)骨脂二氫黃酮與CYP1A1氨基酸殘基Ser122相連接形成1個(gè)氫鍵,并與Phe123相連接形成1個(gè)π-π鍵(圖6B);與CYP1A1氨基酸殘基Asn255、Phe258、Ser116、Gly316、Phe224、Ala317、Thr497、Thr321、Val382、Leu496、Ser122、Ile386、Asp313、Phe123、Leu312和Ile115相連接形成疏水作用(圖6C);補(bǔ)骨脂二氫黃酮與CYP1A1的結(jié)合自由能為-10.145 kcal·mol-1。

圖6 補(bǔ)骨脂二氫黃酮與CYP1A1的氨基酸殘基相結(jié)合的活性位點(diǎn)(A)、氫鍵作用(B)與疏水作用(C)

異補(bǔ)骨脂查爾酮與CYP1A1的氨基酸殘基特異性結(jié)合的活性位點(diǎn)為Phe123、Tyr259、Phe258、Glu256、Ser116、Asn255、Leu254、Ile115、Ser122、Gly316、Asp313、Leu312、Asp320、Ala317、Phe319和Thr321(圖7A);異補(bǔ)骨脂查爾酮與CYP1A1的氨基酸殘基Asn255相連接形成1個(gè)氫鍵,并與Phe123相連接形成1個(gè)π-π鍵(圖7B);而異補(bǔ)骨脂查爾酮與CYP1A1的氨基酸殘基Asn255、Val382、Thr321、Ser122、Phe123、Ile115、Ser116、Phe258、Leu312、Gly316、Phe224、Ala317、Asp313、Ile386和Leu496相連接形成疏水作用(圖7C)。異補(bǔ)骨脂查爾酮與CYP1A1的結(jié)合自由能為-8.286 kcal·mol-1。

3.4 補(bǔ)骨脂異戊烯基成分對(duì)CYP1A1活性的構(gòu)效關(guān)系分析

根據(jù)異戊烯基成分的結(jié)構(gòu)特征,我們發(fā)現(xiàn),二氫黃酮類(lèi)成分C環(huán)1位和2位開(kāi)環(huán)形成查爾酮,會(huì)使CYP1A1的抑制活性稍微減弱;A環(huán)上C-6位或C-8位用異戊烯基基團(tuán)取代,化合物對(duì)CYP1A1的抑制活性差異顯著,以C-6位異戊烯基取代的化合物抑制活性更強(qiáng);A環(huán)C-7位羥基甲基化也會(huì)顯著降低CYP1A1的抑制活性。見(jiàn)圖8。

圖7 異補(bǔ)骨脂查爾酮與CYP1A1的氨基酸殘基相結(jié)合的活性位點(diǎn)(A)、氫鍵作用(B)與疏水作用(C)

圖8 補(bǔ)骨脂異戊烯基成分對(duì)CYP1A1抑制活性的 結(jié)構(gòu)選擇性

4 討論

補(bǔ)骨脂是一種常用中藥,其富含的異戊烯基成分具有多種藥理活性,如抗骨質(zhì)疏松活性、雌激素受體樣作用等[4-7]。目前,多數(shù)研究集中在這些成分的體內(nèi)代謝物分析、藥動(dòng)學(xué)特征及涉及CYP酶和UGT酶的代謝研究,這些研究表明,大量的肝腸首過(guò)效應(yīng)是這些補(bǔ)骨脂異戊烯基成分在體內(nèi)吸收快、暴露量低的重要原因[16-22]。極低的生物利用度(系統(tǒng)暴露量)使得這些成分很難達(dá)到體外的藥效濃度,這也給補(bǔ)骨脂藥效物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)增加了難度。

補(bǔ)骨脂富含的異戊烯基成分不僅可以被CYP酶和UGT酶等催化[20-23],同時(shí)還具有抑制CYP酶和UGT酶的活性[22,24-25]。本研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)骨脂異戊烯基成分對(duì)CYP1A1具有較強(qiáng)的抑制活性(IC50<5 μmol·L-1),這對(duì)于經(jīng)CYP1A1代謝的外源物來(lái)說(shuō),很容易誘發(fā)顯著的藥物-藥物相互作用。例如,利奧西呱及其主要代謝物是CYP1A1的強(qiáng)效抑制劑,與經(jīng)CYP1A1介導(dǎo)催化的藥物，如厄洛替尼或格拉司瓊臨床合用時(shí)需考慮相關(guān)的藥物-藥物相互作用[26]。同樣,在其他藥物與含補(bǔ)骨脂相關(guān)的中成藥聯(lián)合使用時(shí),應(yīng)重點(diǎn)監(jiān)測(cè)可能出現(xiàn)的藥物-藥物相互作用。此外,CYP1A1還參與體內(nèi)雌激素水平的穩(wěn)態(tài)平衡[3],這也可能參與疾病的發(fā)生與發(fā)展。

為了評(píng)估可能存在的藥物-藥物相互作用,通常采用抑制劑在人血漿中的Cmax去獲得[I]/Ki值,[I]/Ki<0.1則認(rèn)為出現(xiàn)藥物-藥物相互作用的可能性非常低,而[I]/Ki>1則表示非常有可能出現(xiàn)藥物-藥物相互作用,[I]/Ki在0.1～1之間,則認(rèn)為有中等可能出現(xiàn)藥物-藥物相互作用[22]。然而到目前為止,關(guān)于補(bǔ)骨脂二氫黃酮、補(bǔ)骨脂定和異補(bǔ)骨脂查爾酮在人體內(nèi)的血藥濃度Cmax尚未見(jiàn)報(bào)道,因此限制了這種預(yù)測(cè)。然而在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，大鼠灌胃給予補(bǔ)骨脂或者含補(bǔ)骨脂的中藥方劑后,3個(gè)成分的血藥濃度Cmax分別為0.003～0.037、0.003～0.078、0.005～1.08 μmol·L-1[16-19]。結(jié)合表1,當(dāng)單體給藥或大劑量提取物給藥時(shí),血藥濃度增高，[I]/Ki>0.1,提示上述3種成分對(duì)CYP1A1全身代謝的抑制或清除作用影響較大,臨床上潛在的藥物-藥物相互作用風(fēng)險(xiǎn)不容忽視。

補(bǔ)骨脂素同分異構(gòu)體及異補(bǔ)骨脂素的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物Bakuchicin對(duì)CYP1A表現(xiàn)出非常強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制(IC50和Ki值均小于0.50 μmol·L-1)[9]。本研究所選的5個(gè)化合物,僅有補(bǔ)骨脂定屬于香豆素類(lèi)化合物,但和Bakuchicin在整體結(jié)構(gòu)上存在較大的差異(圖1)。盡管如此,2者均對(duì)CYP1A表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性。我們還發(fā)現(xiàn),補(bǔ)骨脂定對(duì)CYP1A1表現(xiàn)出非競(jìng)爭(zhēng)性抑制動(dòng)力學(xué),IC50值為0.49 μmol·L-1,Ki值為0.59 μmol·L-1(表1),這與文獻(xiàn)報(bào)道的有所差別[9],可能是由于這2個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)選擇了不同的特異底物造成的。酶底物選擇不同,得到的抑制類(lèi)型結(jié)果可能會(huì)有差異,這種現(xiàn)象在先前的研究也有報(bào)道,可能說(shuō)明CYP1A1與底物存在2個(gè)或以上的結(jié)合位點(diǎn)[27]。

近年來(lái),補(bǔ)骨脂及含補(bǔ)骨脂的中藥方劑,因其能顯著升高膽紅素和引發(fā)急性肝損傷等,受到越來(lái)越多的關(guān)注[28-29]?？紤]到膽紅素在體內(nèi)經(jīng)UGT1A1代謝清除,而補(bǔ)骨脂富含的香豆素、異戊烯基成分等對(duì)UGT1A1具有顯著的抑制作用[22,24-25,27],因此,有學(xué)者認(rèn)為補(bǔ)骨脂可能是由于對(duì)UGT1A1的顯著抑制導(dǎo)致膽紅素上升,誘發(fā)急性肝損傷[27]。本研究從補(bǔ)骨脂異戊烯基成分抑制CYP1A1活性入手,考慮到CYP1A1在雌激素代謝中的關(guān)鍵作用,以及雌激素在肝臟內(nèi)蓄積常引起膽汁淤積(雌激素類(lèi)似物常用作膽汁淤積模型的化學(xué)誘導(dǎo)劑)[30],因此,補(bǔ)骨脂異戊烯基成分通過(guò)CYP1A1調(diào)節(jié)雌激素水平是一把雙刃劍,維持雌激素穩(wěn)態(tài)平衡對(duì)機(jī)體非常重要。

綜上所述,補(bǔ)骨脂富含的異戊烯基成分對(duì)CYP1A1表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，其中補(bǔ)骨脂二氫黃酮、補(bǔ)骨脂定和異補(bǔ)骨脂查爾酮作用最強(qiáng)(IC50<0.5 μmol·L-1且Ki<0.6 μmol·L-1);分子對(duì)接結(jié)果也證明補(bǔ)骨脂二氫黃酮和異補(bǔ)骨脂查爾酮與CYP1A1具有較強(qiáng)的親和力，結(jié)合自由能分別為-10.145 kcal·mol-1和-8.286 kcal·mol-1,與α-萘黃酮(結(jié)合自由能為-10.861 kcal·mol-1)的抑制活性相當(dāng);最后,根據(jù)補(bǔ)骨脂異戊烯基成分的結(jié)構(gòu)位點(diǎn),我們總結(jié)了不同位點(diǎn)與CYP1A1的親和力特征。上述結(jié)果為補(bǔ)骨脂的臨床合理使用與預(yù)防潛在的藥物-藥物相互作用風(fēng)險(xiǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。