基于RTCA技術的復方丹參片體外溶出與一致性評價研究

周悅,馬曉斐,馬麗霞,張佳,莊欣雅,余亦婷,張倩,董潔,陳軍,嚴國俊

(南京中醫(yī)藥大學藥學院,江蘇 南京 210023)

中藥固體制劑的體外溶出評價是制劑處方、工藝條件等一致性評價的可靠方法,也是制劑批內(nèi)、批間質(zhì)量一致性評價的公認方法[1]。與化學藥品質(zhì)量控制不同,對于中醫(yī)藥理論指導下的中藥,特別是復方制劑,藥效是由多種成分共同協(xié)作的結(jié)果,若以其中一種或幾種指標性成分作為檢測對象,都難以反映中藥復方的整體性,也難以完全代表中藥制劑的質(zhì)量與藥效,因此有必要改善和更新固體制劑溶出度的考察標準和方法[2-3]。而生物活性檢測是一步到位直接考察藥物安全性與有效性的質(zhì)量控制方法,以生物效價作為中藥溶出度的檢測方法已經(jīng)成為研究發(fā)展的新趨勢[4-6]。

生物活性測定法從中藥的生物效應出發(fā),能夠反映中藥的臨床活性,可以用于中藥的質(zhì)量控制與評價。本實驗以復方丹參片為模型藥,依據(jù)大鼠心肌細胞(H9C2)對復方丹參片不同時間的溶出液呈現(xiàn)濃度梯度依賴[7],利用RTCA技術實時監(jiān)測不同時間溶出藥液的細胞動態(tài)變化[8],獲得時間劑量依賴性細胞反應曲線(Time-dose-dependent cell response curves,TCRPs),建立一種以細胞指數(shù)(Cell index，CI)為指標的細胞生物效應溶出動力學模型,并與紫外分光光度法檢測的溶出度結(jié)果進行相似性評價。該法從中藥的整體效應出發(fā),彌補了化學成分與臨床療效或毒性關聯(lián)性小的缺陷,對于中藥固體制劑溶出度評價研究提供了新的方法,也為中藥的質(zhì)量一致性評價提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

85-2型恒溫磁力攪拌器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);RC-3溶出度測試儀(天津新天光公司);UV-2401紫外可見分光光度計(日本島津公司);HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司);FA1104N型電子分析天平(上海精密科學儀器有限公司);MZY-U20V超純水機(南京妙之儀電子科技有限公司);RTCA實時無標記細胞分析儀(杭州艾森生物有限公司);Sorvall ST16R臺式高速冷凍離心機;Sorvall ST16R臺式低速離心機(美國Thermo公司);3111型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);渦旋振蕩儀(美國Bio-Rad公司);ECLIPSE Ti-S型倒置顯微鏡(日本Nikon公司);1300 SERIES A2生物安全柜(美國Thermo公司)。

1.2 藥品與試劑

復方丹參片(云南白藥基團股份有限公司,批號:ZMC1712);復方丹參片(廣州白云山和記黃埔中藥有限公司,批號:J19A004);復方丹參片(廣西藥用植物園制藥廠,批號:180501-066);鹽酸(AR,萊陽精細化工廠,批號:20110219);胰蛋白酶溶液(Gibco公司);RTCA板(杭州艾森生物有限公司);DMEM培養(yǎng)基(Corning公司)。

1.3 細胞

大鼠心肌細胞(H9C2細胞)購自中國科學院上海細胞庫。

1.4 復方丹參片溶出度供試樣品的制備

1.4.1 不同溶出時間樣品 取空白人工胃液1 000 mL置于溶出杯中,加熱至37 ℃,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)籃轉(zhuǎn)速為100 r·min-1,將精密稱定質(zhì)量的復方丹參片分別放入轉(zhuǎn)籃內(nèi),以空白人工胃液接觸藥片時為零時刻開始計時,按10、20、30、40、50、60、70、80 min定時取樣,每次取樣10 mL(立即補充同溫同體積的空白人工胃液)用微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液即得。

1.4.2 完全溶出樣品 另取復方丹參片10片,精密稱定,計算出平均片質(zhì)量(W),將稱定的片劑研細,再精密稱取相當于W的量,置1 000 mL燒杯中,置于恒溫磁力攪拌器上,向燒杯內(nèi)加入1 000 mL空白人工胃液,并以藥片粉末接觸人工胃液零時刻開始計時,在(37.0±0.5) ℃水浴中均勻攪拌2 h,取10 mL用微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液即得。

1.5 大鼠心肌H9C2細胞培養(yǎng)

將復蘇的H9C2細胞置于飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中,用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基,在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)細胞至85%融合度時,用0.25%胰蛋白酶消化傳代,倒置顯微鏡中觀察,取對數(shù)生長期的細胞,1 000 r·min-1離心5 min,計數(shù)板下計數(shù),調(diào)整細胞濃度至2×104mL-1用于細胞實驗。

2 方法與結(jié)果

2.1 基于RTCA復方丹參片生物效應溶出度的測定

2.1.1 復方丹參片生物效應溶出方法學考察

2.1.1.1 精密度試驗 取適量復方丹參片,置于研缽內(nèi)搗碎,精密稱取10、15、20 mg分別加入1 mL人工胃液中充分溶解,配制成10、15、20 mg·mL-1的儲備液。經(jīng)過稀釋后,配成終濃度為0.6、1.0、1.4 mg·mL-1的藥液。將0.6、1.0、1.4 mg·mL-13種樣品分別在RTCA儀器中進樣6次,同時監(jiān)測這3種質(zhì)量濃度的樣品作用于細胞產(chǎn)生的CI值。經(jīng)數(shù)據(jù)分析,計算得出每種樣品的RSD。結(jié)果表明,3種質(zhì)量濃度的樣品在 0～64.24 h內(nèi)細胞指數(shù)的RSD均小于3.0%,說明在0～64.24 h時間段精密度良好。

2.1.1.2 重復性試驗 取復方丹參片適量,置于研缽內(nèi)搗碎,精密稱取15 mg,平行6份,用1 mL人工胃液溶解,分別配制成儲備液15 mg·mL-1,再進行稀釋最終配成濃度為1.0 mg·mL-1的藥液,分別進樣,進行細胞指數(shù)的測定,計算出6份平行樣品在不同時間點的RSD。結(jié)果表明,樣品在0～48.23 h內(nèi)細胞指數(shù)的RSD均小于3.0%,說明在0～48.23 h時間段重復性良好。

經(jīng)過復方丹參片生物溶出方法學的考察,綜合數(shù)據(jù)可知,0～48 h是細胞指數(shù)最佳的選擇范圍。

2.1.2 基于RTCA測定不同時間溶出樣品的TCRPs 在細胞檢測板的每個小孔中先加入50 μL生長介質(zhì),再加入密度為2×104mL-1的特定細胞懸液100 μL。將此細胞檢測板在室溫下放置30 min后,放到培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)。20～24 h后,當細胞數(shù)量穩(wěn)定時,取H9C2細胞的細胞檢測板,除對照組外,換液并向每孔中加入“1.4”項下的不同時間點的溶出藥液樣品和完全溶出樣品50 μL,每個溶出樣品設3個復孔。將加好樣的檢測板放入實時細胞電子分析儀中,繼續(xù)檢測72 h,測得各樣品溶液作用于H9C2細胞后所產(chǎn)生的細胞指數(shù),從而獲得各個樣品的TCRPs曲線(圖1～3)。

圖1 批號ZMC1712復方丹參片溶出樣品的TCRPs曲線

圖2 批號J19A004復方丹參片溶出樣品的TCRPs曲線

圖3 批號180501-066復方丹參片溶出樣品的TCRPs曲線

由不同時間溶出樣品的TCRPs曲線數(shù)據(jù)可知,加入不同時間溶出樣品后細胞會出現(xiàn)不同趨勢的生長狀態(tài)變化,加藥前CI穩(wěn)定上升,加藥后不同樣品的CI出現(xiàn)大幅度的變化,溶出時間短的樣品組CI呈現(xiàn)穩(wěn)定上升趨勢,溶出時間長的樣品組CI持續(xù)下降。不同廠家的TCRPs曲線之間存在較大差異,加藥后呈現(xiàn)穩(wěn)定濃度梯度依賴性,選取各時間段RSD值最小進行分析。批號ZMC1712復方丹參片在加藥后20.39～22.31 h時間段內(nèi)細胞指數(shù)呈現(xiàn)穩(wěn)定的質(zhì)量濃度梯度依賴性,因此選取該段為分析的最佳時間段;批號180501-066復方丹參片在加藥后24.36～26.40 h時間段內(nèi)呈現(xiàn)穩(wěn)定的質(zhì)量濃度梯度依賴性,故選取該段為分析的最佳時間段;而批號J19A004復方丹參片在加藥后,不同溶出時間樣品之間的TCRPs曲線會出現(xiàn)短暫的交錯狀態(tài),在32.14～34.14 h時間段內(nèi)細胞指數(shù)也呈現(xiàn)出穩(wěn)定的質(zhì)量濃度梯度依賴性,因此選取該段為分析的最佳時間段。

圖4 不同廠家復方丹參片的生物效價溶出度曲線

2.1.3 不同時間溶出樣品的生物效價溶出度 選取具有穩(wěn)定質(zhì)量濃度梯度的細胞指數(shù)-溶出時間曲線,進行溶出度(Q)的計算,結(jié)果見表1～3。根據(jù)溶出度結(jié)果繪制不同批號的復方丹參片生物效價溶出曲線,見圖4。

Q=(CIi-CIck)/(CI0-CIck)

CIi指各時間點溶出樣品的CI值,CIck指不加藥物時的CI值,CI0指藥物完全溶出時的CI值。

2.2 利用紫外分光光度法測定復方丹參片溶出度

2.2.1 檢測波長的選擇 復方丹參片在(282±2) nm處有最大吸收[9],采用“1.4.2”項下復方丹參片完全溶出樣品在200～400 nm處檢測,在283 nm處有最大吸收,見圖5,故選定283 nm為檢測波長。

2.2.2 線性關系考察 量取“1.4.2”項下復方丹參片完全溶出樣品適量,用人工胃液稀釋成相對溶出量90%、70%、50%、30%、20%、10%的濃度系列,以人工胃液為空白,測定283 nm波長下的A值。以相對溶出量為橫坐標(X),A值為縱坐標(Y),計算回歸方程,回歸方程為Y=0.024 2X-0.006 8,r=0.999 6。

圖5 復方丹參片完全溶出樣品的UV吸收光譜

表1 批號ZMC1712復方丹參片不同溶出時間點樣品的CI值

表2 批號J19A004復方丹參片不同溶出時間點樣品的CI值

表3 批號180501-066復方丹參片不同溶出時間點樣品的CI值

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 量取適量相對溶出量為50%的溶液,分別在0、2、4、8、10、12、24 h測定A值,考察溶液穩(wěn)定性,結(jié)果RSD為1.81%,表明藥液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 精密度試驗 量取適量復方丹參片完全溶出的藥液,重復測定6次,記錄下A值,求得樣品的RSD為0.84%,表明該儀器精密度良好。

2.2.5 溶出度的測定 每次精密稱取復方丹參片1片的質(zhì)量為Wi,并按照“1.4.1”項下制備10、20、30、40、50、60、70、80 min的復方丹參片溶出樣品微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液用紫外可見分光光度計于283 nm處測定不同時間點溶出樣品的A值(Ai);取復方丹參片10片,精密稱定,計算出平均片質(zhì)量(W),將稱定的片劑研細,再精密稱取相當于W的量,并按照“1.4.2”項下制備完全溶出樣品,微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液用紫外可見分光光度計于283 nm處測定A值(A0);按公式計算溶出度(Q),Q=(WAi/WiA0)×100%，結(jié)果見表4。根據(jù)結(jié)果繪制3個廠家的復方丹參片UV溶出度曲線,見圖6。

表4 不同批號復方丹參片的紫外分光光度法溶出度結(jié)果

圖6 不同廠家復方丹參片的UV溶出度曲線

2.3 考察復方丹參片生物效應溶出曲線與紫外溶出曲線的相關性

2.3.1 差異因子f1與相似因子f2差異因子f1是計算在每一時間點2個曲線差異的百分率(%),是2條曲線相對誤差的衡量參數(shù);相似因子f2為對偏差的平方和的平方根的倒數(shù)進行對數(shù)轉(zhuǎn)換,為2條曲線溶出百分率(%)相似性的衡量參數(shù)。一般情況下,當差異因子f1值≤15且相似因子f2值≥50,則認為2條溶出曲線相似,反之,則認為不相似[10]。公式中Rt和Tt分別代表參比制劑和受試制劑在時間t的釋放度,n為時間點的個數(shù)(公式如下)。

圖7 不同廠家復方丹參片生物效價溶出曲線 與紫外溶出曲線

利用DDSolver軟件[11],以紫外溶出曲線作為參比制劑,生物效價溶出曲線作為受試制劑,將對應數(shù)據(jù)輸入軟件,可快速獲得3批復方丹參片生物效價溶出曲線與紫外溶出曲線的差異因子f1和相似因子f2的結(jié)果,2種方法的溶出曲線見圖7。

經(jīng)分析,批號ZMC1712、批號J19A004和批號180501-066復方丹參片生物效價溶出曲線與紫外溶出曲線的差異因子f1分別為12.08、8.17和7.30,均小于15;相似因子f2分別為55.97、62.49和61.61,均大于50。結(jié)果表明同一廠家的復方丹參片生物效價溶出曲線與紫外溶出曲線基本相似。

2.3.2 溶出動力學模型擬合 目前常用的溶出速率模型有零級模型、一級模型、Weibull模型等,其中零級模型考察是否恒速釋藥,一級模型考察是否非恒速釋藥,Weibull模型幾乎適用于所有溶出曲線。采用DDSolver軟件對2種評價方法下的溶出曲線進行零級模型、一級模型及Weibull模型擬合,擬合結(jié)果見表5。并求出各批次最佳模型的溶出參數(shù),累積釋放率T25,用于考察藥物是否有突釋;T50和Td用于確定藥物的釋藥特性;T80用于考察釋藥是否基本完全,結(jié)果見表6～7。

表5 復方丹參片溶出模型擬合結(jié)果

表6 批號ZMC1712和180501-066復方丹參片

表7 批號J19A004復方丹參片零級模型擬合溶出參數(shù)

從擬合結(jié)果看,批號ZMC1712和180501-066復方丹參片紫外分光光度法與生物效價的溶出曲線均對Weibull模型擬合度更佳;批號J19A004復方丹參片紫外分光光度法與生物效價的溶出曲線的最佳擬合模型為零級速率模型,說明其溶出規(guī)律為恒速釋藥。結(jié)果表明不同廠家之間最佳擬合模型不一致,不同廠家之間存在質(zhì)量差異。最佳模型的溶出參數(shù)結(jié)果可知,各批號的復方丹參片無突釋情況;同一廠家2種評價方法下的T50和Td差異性并不大;T80基本完全溶出時間比較:批號J19A004>批號180501-066>批號ZMC1712,批號J19A004復方丹參片完全溶出最慢,而批號ZMC1712復方丹參片完全溶出最快。

由上述紫外吸收和細胞生物效應為指標的溶出度差異可看出,不同廠家生產(chǎn)的同一規(guī)格的復方丹參片,其體外溶出行為差異較大,可推斷其體內(nèi)釋放行為和藥效差異也不可避免的具有差異,一致性較差。中藥制劑的質(zhì)量一致性影響因素眾多,與中藥原料、飲片炮制、提取純化工藝,成型輔料及工藝等都密切相關,需要全過程標準化控制,保障中藥品質(zhì)完整一致的傳遞,最終才可形成質(zhì)量和療效一致的中藥制劑。

4 討論

溶出度試驗是中藥固體制劑質(zhì)量控制的有效手段,但評價方法常以單一或多個活性成分作為研究對象,未能體現(xiàn)中藥多成分、多環(huán)節(jié)、多靶點的特征,并不能獲得中藥質(zhì)量評價的完整參數(shù),缺乏科學性與整體性。若以單一的化學成分溶出曲線衡量固體制劑的質(zhì)量仍然可能存在不足,甚至會與藥物的真正療效出現(xiàn)偏離。生物效應評價法是繼性狀評價、化學評價之后,推動中藥質(zhì)量標準走進臨床、關聯(lián)療效的有效途徑和手段,特別適用于結(jié)構(gòu)復雜或理化方法不能測定其含量,或者理化測定不能反映其臨床生物活性的藥物,主要表現(xiàn)在具有較強的專屬性、直接關切中藥有效性與安全性、簡單快速,符合中藥物質(zhì)基礎研究現(xiàn)狀,在中藥質(zhì)量控制和評價中具有獨特的優(yōu)勢。該方法可以在不以化學成分為目標的基礎上,從整體出發(fā),對中藥固體制劑進行溶出動力學的評價。

本實驗以復方丹參片作為多成分的化學集合體,將此集合體作用于H9C2細胞群落,藥物作用于細胞會產(chǎn)生可定量的電信號,利用RTCA實時檢測獲得CI,并得到以CI為指標的生物效應溶出曲線。與傳統(tǒng)檢測細胞增長率的方法比較,RTCA具有動態(tài)、實時、高效、免標記等優(yōu)點,能真實反映藥物作用于細胞的動態(tài)過程。

與單個或多個化學成分評價相比,紫外光譜將中藥或中藥復方的各類化學成分相互疊加,是化學成分相互作用的總和,一定程度上可以反映中藥的“整體”信息。結(jié)果顯示,不同廠家復方丹參片溶出樣品之間的TCRPs曲線具有差異性,不同廠家之間的生物效價溶出曲線也有明顯區(qū)別。相似因子法便于計算,但未考慮數(shù)據(jù)的變異性,易受溶出時間點數(shù)目的影響,具有一定的局限性。因此補充了差異因子法和模型依賴法,對2種評價方法進行相似性研究。將生物效應評價法與紫外分光光度法的溶出結(jié)果進行比較,同一廠家的復方丹參片生物效價溶出曲線與紫外溶出曲線均具有相似性,且最佳擬合模型一致;不同廠家之間最佳擬合模型不一,且溶出參數(shù)存在差異,與紫外分光光度法溶出結(jié)果一致,生物效應評價法也可以說明不同生產(chǎn)廠家之間質(zhì)量存在差異性,結(jié)果表明基于RTCA建立的復方丹參片細胞指數(shù)溶出度模型具有可行性。從中藥的生物效應出發(fā),建立符合中醫(yī)整體觀的中藥固體制劑細胞生物效應溶出度評價方法,可以彌補單一化學成分評價的缺陷,保證質(zhì)量與有效性一致,為中藥復方制劑的一致性評價提供新的思路和方法。