基于線粒體控制區(qū)的中國近海竹莢魚種群遺傳結(jié)構(gòu)和種群歷史動態(tài)分析

任慧敏, 張衡, 許莎莎, 李圣法, 李建生, 李治洪, 何利軍,,4

1. 華東師范大學(xué)河口海岸學(xué)國家重點實驗室, 上海 200241;

2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所, 上海 200090;

3. 華東師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院, 上海 200241;

4. 華東師范大學(xué)崇明生態(tài)研究院, 上海 200241

竹莢魚(Trachurus japonicus)別稱巴浪、刺鲅、山鮐魚, 隸屬于鱸形目(Perciformes)、鲹科(Carangidae)、竹莢魚屬(Trachurus)。我國渤海、黃海、東海、南海以及日本外海均有較豐富的竹莢魚漁業(yè)資源, 近年來竹莢魚逐漸成為海洋漁業(yè)主捕魚種, 其中以東海產(chǎn)量最高(劉舜斌, 1992)。竹莢魚為暖溫性中上層小型洄游性魚類, 最適生存溫度為16～18℃, 結(jié)群生活、游泳迅速, 具有趨光性和生長快的特征, 主要攝食浮游甲殼動物(如橈足類、蝦類等), 成魚體長約為20～35cm、體重100～300g, 常棲息于海藻茂密的暗礁周圍(曹寧 等, 2006)。

目前, 國內(nèi)外對竹莢魚的研究主要集中在資源量、生長繁殖、生態(tài)習(xí)性等方面(邵幗瑛 等, 2006;張秋華, 2007; Sassa et al, 2014)。不同學(xué)者根據(jù)不同標(biāo)準(zhǔn)對竹莢魚物種、譜系和群體進行了劃分, 劃分依據(jù)主要有: 耳石形態(tài)特征(Katayama et al, 2019)、地理分布(Yamada et al, 2007)、分子遺傳標(biāo)記(Cárdenas et al, 2005; Song et al, 2013)等。Cárdenas等(2005)基于DNA分子標(biāo)記探討了各大洋范圍內(nèi)的竹莢魚屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系, 表明該屬的地理分布格局與歷史上氣候變化和海洋環(huán)境有關(guān), 這一研究對各海域竹莢魚屬的譜系劃分和物種識別具有重要價值。有學(xué)者認(rèn)為中國近海的竹莢魚存在兩個群體, 即朝鮮群體和中國群體(《世界大洋性漁業(yè)概況》編寫組, 2011), 朝鮮群體分布在朝鮮海峽和濟州島的淺水區(qū), 中國群體主要分布在從九州島到臺灣北部之間的東海大陸架上, 其產(chǎn)卵場主要分布在臺灣海峽入口及附近水域, 黑潮和對馬暖流對竹莢魚在東海的分布造成了一定影響(Yamada et al, 2007)。迄今非常有限的竹莢魚種群遺傳學(xué)研究, 存在研究區(qū)域不同, 且使用的分子標(biāo)記各異的問題。比如, 牛素芳等(2011)和張麗艷等(2014)分別采用線粒體DNA控制區(qū)、細胞色素b基因(Cyt b)和擴增片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)為標(biāo)記, 分析了福建近海閩東和閩南兩個群體的遺傳結(jié)構(gòu), 發(fā)現(xiàn)竹莢魚在這兩個群體之間缺乏遺傳分化, 且具有很高基因流;Song等(2013)基于控制區(qū)序列分析了日本四島東西海岸、福建近海和北部灣群體的遺傳結(jié)構(gòu)和種群歷史動態(tài), 發(fā)現(xiàn)該物種由一個經(jīng)歷過最近種群擴張的單一譜系組成, 且采樣點之間無顯著遺傳分化, 但該研究缺乏作為主要分布區(qū)的東海大陸架樣本, 削弱了竹莢魚在中國東海海域樣本的代表性和總體遺傳格局的統(tǒng)計力度。根據(jù)之前在其他物種的研究結(jié)果顯示, 中國海域存在雷州半島(Zhou et al, 2009; He et al, 2010)、中國臺灣海峽(Wang et al, 2015)和黑潮海流(He et al, 2015)等生物地理障礙, 對于海洋生物基因交流存在一定遺傳隔離作用, 這些物理障礙導(dǎo)致的異質(zhì)海洋環(huán)境, 是否也影響了竹莢魚群體在中國近海的譜系分化和基因交流, 也是本文關(guān)注的一個科學(xué)問題。

遺傳多態(tài)性或基因多態(tài)性是衡量生物多樣性的重要指標(biāo), 廣義的遺傳多態(tài)性是指地球上所有生物所攜帶的遺傳信息的總和, 狹義遺傳多態(tài)性是指種內(nèi)的遺傳多態(tài)性(馬克平, 1993)。遺傳多態(tài)性是種質(zhì)資源保護的核心, 反映了該物種適應(yīng)環(huán)境變化的能力及其發(fā)展?jié)摿?。群體遺傳多態(tài)性標(biāo)志著群體的可持續(xù)發(fā)展?jié)摿? 群體間遺傳多態(tài)性的差異程度可以反映其遺傳分化狀況。線粒體DNA具有母系遺傳和較高的遺傳變異速率等特點, 使其成為研究物種遺傳多態(tài)性的重要標(biāo)記(Ramírez et al, 2011)。與mtDNA的其他基因相比, 線粒體控制區(qū)是非編碼區(qū),由于選擇壓力較小, 在mtDNA中進化速率最快, 積累的突變最多, 更適合群體遺傳學(xué)研究(Brown,1985), 因此作為重要分子標(biāo)記被廣泛應(yīng)用。近幾十年來, 受環(huán)境污染、海洋漁業(yè)資源過度捕撈等人類活動的影響, 竹莢魚資源量與捕撈產(chǎn)量波動劇烈,漁獲量呈逐年下降趨勢(濱田律子 等, 1989), 且捕獲群體性早熟、個體小型化的趨勢愈演愈烈(Yoda et al, 2014)。

本研究采用線粒體控制區(qū)為遺傳標(biāo)記, 在采集東海大陸架4個站位竹莢魚樣本的基礎(chǔ)上, 通過整合Genbank數(shù)據(jù)庫中福建近海和南海北部灣海域的同源DNA序列, 分析了中國近海竹莢魚的種群遺傳結(jié)構(gòu)和種群歷史動態(tài)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與DNA提取

本研究于2019年9—11月在東海大陸架4個站位(C24、D14、D21、D29)采集竹莢魚樣本共計30尾(表1), 采樣站位的經(jīng)緯度范圍為26°—29°N,123°—127°E。每條魚剪取尾部肌肉組織10g, 浸泡于95%酒精中, 用于后續(xù)DNA提取。采用苯酚/氯仿抽提法(薩姆布魯克, 2009)提取了竹莢魚肌肉組織總量DNA, 并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。將總量DNA樣本濃度稀釋10倍, 置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 竹莢魚取樣信息及線粒體控制區(qū)序列遺傳多態(tài)性參數(shù)Tab. 1 Sampling information and genetic diversity parameters of Trachurus japonicus based on mitochondrial control region

1.2 PCR擴增與測序

用于竹莢魚線粒體控制區(qū)片段(約800bp) PCR擴增的上下游引物序列分別為tRNA-T1: CAGAAA AAGGAGACTCTAACTCCT (5′—3′)、tRNA-T2:TGCTTGCGGGGCTTTCTA (5′—3′)(牛素芳 等,2011), 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為20μL: PCR mixture 10μL (上海李記生物有限公司), 上下游引物(10μM)各1.0μL,DNA模板1μL, ddH2O 8μL。PCR循環(huán)條件為: 94℃預(yù)變性5min, 94℃變性45s, 55℃退火1min, 72℃延伸45s, 設(shè)置35個循環(huán), 最后在72℃下延伸10min。PCR產(chǎn)物于-20℃冰箱保存并通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后, 送上海生工生物工程有限公司進行單向測序, 測序引物為tRNA-T1。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

測序獲得了東海大陸架竹莢魚線粒體控制區(qū)片段DNA序列30條, 并通過GenBank公共數(shù)據(jù)庫下載了福建近海和南海北部灣防城港的竹莢魚(T.japonicus)線粒體控制區(qū)同源序列共100條(見表1),以上序列用于后續(xù)單倍型系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系以及種群歷史動態(tài)的整合分析。首先使用Chromas軟件查看相關(guān)樣本的測序峰圖, 對原始序列進行人工校對, 通過Clustal X軟件(Thompson et al, 1997)對上述130條DNA序列進行多重比對。隨后使用MEGA軟件(Kumar et al, 2016)和DNAsp軟件(Librado et al,2009)統(tǒng)計遺傳多態(tài)性參數(shù), 包括單倍型數(shù)(Nh)、單倍型多態(tài)性(Hd)、核苷酸多態(tài)性(π)、變異位點數(shù)(s)等。基于Modeltest軟件(Posada et al, 1998), 選擇DNA序列的最佳堿基替代模型(TIMef), 以系統(tǒng)進化關(guān)系最近的同屬物種Trachurus novaezelandiae為外群(Cárdenas et al, 2005), 利用PhyML軟件(Guindon et al, 2010)構(gòu)建最大似然樹(Maximum Likelihood tree, ML tree), 通過重復(fù)抽樣1000次(Bootstrap方法)推斷系統(tǒng)發(fā)育樹的各分支節(jié)點的可靠性。同時利用Network軟件(Bandelt et al, 1999)構(gòu)建中國近海竹莢魚單倍型進化網(wǎng)絡(luò)圖。

為分析中國近海竹莢魚(T. japonicus)的3個地理群體(東海大陸架、福建近海和南海北部灣)的遺傳結(jié)構(gòu), 利用Arlequin軟件(Schneider et al, 2000)中的分子方差分析(Analysis of molecular variance,AMOVA)估算遺傳變異在群體內(nèi)和群體間的分布并計算遺傳分化指數(shù)值(Fst), 采用隨機重復(fù)抽樣1000次進行顯著性檢驗。同時通過Arlequin軟件中的中性檢驗(Tajima’sD和Fu’sFs)和核苷酸歧點分布(Mismatch distribution)分析推斷竹莢魚南海北部灣群體、東海群體(包括東海大陸架和福建近海群體)和整個群體的種群歷史動態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 中國近海竹莢魚線粒體控制區(qū)序列特征和遺傳多樣性

對本研究和Genbank下載的竹莢魚控制區(qū)序列進行校對分析后, 得到了130條長度為745bp的有效序列, 130條序列中共檢測到80個多態(tài)性位點,包括31個單一突變位點和49個簡約信息位點。該序列的堿基組成(C、T、A、G)分別為20.8%、31.5%、31.1%和16.6%, A+T的平均含量(62.6%)高于 G+C的平均含量(37.4%)。中國近海竹莢魚的130條序列共定義了118個單倍型。具體遺傳多態(tài)性參數(shù)見表1, 各地理群體單倍型多態(tài)性(Hd)范圍為0.996±0.005～1.000±0.009, 核苷酸多態(tài)性(π)范圍為0.01170±0.00066～0.01302±0.00078。

2.2 竹莢魚單倍型網(wǎng)絡(luò)圖與系統(tǒng)進化樹

基于線粒體控制區(qū)序列的竹莢魚單倍型網(wǎng)絡(luò)呈現(xiàn)星形放射狀結(jié)構(gòu)(圖1), 各地理群體的單倍型在網(wǎng)絡(luò)中散亂混雜分布, 未產(chǎn)生深度分歧的譜系分化,單倍型的進化關(guān)系與地理分布沒有明顯聯(lián)系。竹莢魚系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)的拓撲結(jié)構(gòu)較為簡單, 無高支持率的譜系分化, 各分支的節(jié)點支持率均較弱(節(jié)點支持率<50%), 中國海區(qū)竹莢魚整體呈現(xiàn)為一個單一進化的譜系。東海大陸架(C、D) 、福建近海(HAP)和南海北部灣防城港(FCH)的單倍型無規(guī)律地均勻分布于整個進化樹, 未發(fā)現(xiàn)與地理分布相對應(yīng)的分支。

圖1 基于線粒體控制區(qū)的竹莢魚單倍型網(wǎng)絡(luò)圖不同顏色代表不同地理分布的單倍型。各單倍型地理信息為: C/D來自東海大陸架, HAP來自福建沿海, FCH來自南海北部灣防城港近岸Fig. 1 Haplotype network of Trachurus japonicus based on mitochondrial control region. Geographic distribution information of each haplotype was distinguished using different colors: red ones from the Beibu Gulf in the South China Sea,blue ones from the East China Sea shelf, and yellow ones from coastal Fujian Province in the East China Sea

圖2 基于線粒體控制區(qū)的竹莢魚最大似然樹各單倍型地理信息為: C/D來自東海大陸架, HAP來自福建沿海, FCH來自南海北部灣防城港近岸Fig. 2 Maximum likelihood tree of Trachurus japonicus based on mitochondrial control region. Geographic information of each haplotype is indicated: C/D from the East China Sea shelf, HAP from coastal Fujian Provincce in the East China Sea, and FCH from coastal Fangchenggang City in the Beibu Gulf of the South China Sea

2.3 中國近海竹莢魚的種群遺傳結(jié)構(gòu)

基于線粒體控制區(qū)序列對竹莢魚3個地理群體進行分子方差分析(AMOVA), 結(jié)果顯示: 99.39%的遺傳變異來源于群體內(nèi), 群體間遺傳變異僅占0.61% (表2), 表明群體內(nèi)遺傳變異遠遠高于群體間的變異。總體遺傳分化指數(shù)(Fst)為0.00606 (p＞0.05)。

表2 中國近海竹莢魚群體的分子方差分析Tab. 2 AMOVA of Trachurus japonicus in the China seas based on mitochondrial control region

2.4 中國近海竹莢魚的種群歷史動態(tài)

竹莢魚東海群體、南海北部灣群體的單倍型歧點分布分析曲線都呈現(xiàn)單峰分布(圖3), 且與擴張模型期望的單峰分布曲線無顯著差異。中性檢驗(包括Tajima’sD和Fu’sFs統(tǒng)計值)均為負值(表3), 雖然Tajima’sD檢驗的統(tǒng)計值不顯著(p＞0.05), 但Fu’sFs值統(tǒng)計極顯著(p＜0.01)。

圖3 竹莢魚不同地理群體的單倍型歧點分布分析圖a. 東海; b. 南海-北部灣; c. 整體。SSD表示離差平方和, p表示SSD統(tǒng)計的顯著性值Fig. 3 Mismatch distribution analysis of Trachurus japonicus

表3 中國近海竹莢魚群體的中性檢驗Tab. 3 Neutrality tests of Trachurus japonicus populations in the China seas

3 討論和結(jié)論

3.1 中國近海竹莢魚種群歷史動態(tài)

本研究基于歧點分布分析、中性檢驗(Tajima’sD和Fu’sFs)等統(tǒng)計方法, 發(fā)現(xiàn)了中國近海竹莢魚群體經(jīng)歷過最近種群擴張的遺傳信號: 1) 竹莢魚東海群體、南海北部灣群體的核苷酸歧點分布分析都呈單峰分布的特征(Rogers et al, 1992); 2) Tajima’sD和 Fu’sFs檢驗均為負值, 且Fu’sFs檢驗極顯著, 但Tajima’sD檢驗不顯著, 這一現(xiàn)象也出現(xiàn)在Song等(2013)對竹莢魚日本四島群體和中國近海群體的研究中, 這可能與該檢驗針對種群增長中產(chǎn)生的稀有等位基因和新突變等多態(tài)性信號的靈敏度和統(tǒng)計力均不及Fu’sFs統(tǒng)計有關(guān)(Fu, 1997)。結(jié)合上述研究結(jié)果推斷竹莢魚在中國東海和南海海域可能均經(jīng)歷過最近的種群擴張(Tajima, 1989; Fu, 1997)。

包括渤海、黃海、東海和南海在內(nèi)的西北太平洋邊緣海, 擁有豐富的海洋漁業(yè)資源。受第四紀(jì)冰期和間冰期周期性氣候波動的影響, 這些邊緣海的海陸輪廓和地貌曾反復(fù)多次發(fā)生巨變(Wang,1999)。在冰盛期這些邊緣海的海平面下降達–120m至–150m (Kitamura et al, 2001; Lambeck et al, 2002),黃渤海因大陸架暴露而消失, 東?？s小為一個狹長的沖繩海槽, 其冰期面積僅占當(dāng)前面積的50%,而南海則變成了半封閉的海盆, 僅通過巴士海峽與太平洋相連, 西北太平洋邊緣海的生境曾因此發(fā)生巨大變化(Tamaki et al, 1991)。推測竹莢魚發(fā)生種群擴張的可能原因是: 冰消期海平面上升引發(fā)海侵, 邊緣海面積被擴大, 由于棲息地生境的改善,海水魚類開始通過區(qū)域擴散逐漸恢復(fù)種群規(guī)模(Mcmanus, 1985)。

3.2 中國近海竹莢魚的遺傳結(jié)構(gòu)

遺傳分化指數(shù)(Fst)是衡量群體間的遺傳分化程度的重要指標(biāo)。Wright (1978)建議在實際研究中, 如Fst為0～0.05, 則表明群體間遺傳分化很小, 可以忽略; 如Fst為0.05～0.15, 暗示群體間存在中等程度的遺傳分化; 如Fst為0.15～0.25, 說明群體間遺傳分化水平較高; 如Fst＞0.25時, 則說明群體間存在明顯的遺傳分化。中國近海竹莢魚群體的總體遺傳分化指數(shù)(Fst)僅為0.00606 (p>0.05), 屬于可忽略的低水平遺傳分化。分子方差分析(AMOVA)的結(jié)果進一步表明, 竹莢魚在南海北部灣、福建近海和東海大陸架的地理群體間的遺傳分化不明顯, 遺傳變異主要發(fā)生在群體內(nèi)部(99.39%)。竹莢魚的系統(tǒng)進化樹和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖也顯示東海和南海北部灣的竹莢魚單倍型不規(guī)則地均勻分布于整個系統(tǒng)樹和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖中, 沒有明顯的譜系地理結(jié)構(gòu)。因而現(xiàn)有數(shù)據(jù)結(jié)果表明, 中國近海各海區(qū)的竹莢魚群體間無顯著遺傳分化, 具有遺傳同質(zhì)性。

竹莢魚的系統(tǒng)發(fā)生生物地理格局屬于Avise提出的5種格局中的一種, 即單倍型系統(tǒng)發(fā)育連續(xù)的類群, 空間分布也連續(xù)(Avise et al, 1987), 此格局的特征為各地理群體間存在廣泛的基因交流, 單倍型在物種的整個分布范圍內(nèi)廣泛而均勻的分布。竹莢魚各地理群體間遺傳分化不顯著的原因可能在于其具有較強的擴散能力。竹莢魚為遷移能力較強的洄游性海洋魚類, 我國近海竹莢魚群體每年春季常伴隨黑潮和臺灣暖流從越冬海區(qū)向北方海域游動, 在4—7月自外海向沿岸海域進行生殖索餌洄游, 秋季水溫下降時, 由索餌場向南游至臺灣海峽等海區(qū)越冬(唐濤 等, 2005), 同時受西北太平洋復(fù)雜的洋流體系如黑潮暖流和近岸沿岸流的影響, 其跨海域的游動十分頻繁。而且海水魚類的卵和浮游幼體可隨洋流攜帶傳播(Leis et al, 1996), 因而浮游幼蟲期較長的海水魚類具有較強的遷徙和擴散能力, 相對擴散能力弱的物種, 其地理分布會更廣, 海區(qū)間的基因流更高(Levinton et al, 1976; Berger, 1983)。中國海域復(fù)雜的洋流體系極大地增加了竹莢魚在海區(qū)之間空間擴散的能力, 從而促進了其大規(guī)?？鐓^(qū)域的基因交流(Selkoe et al, 2016)。此外，不同物種對同一物理障礙的擴散能力也不同, 雷州半島、臺灣海峽等現(xiàn)代和冰期物理障礙尚未影響到竹莢魚在各海區(qū)之間的遷移。上述結(jié)果表明, 東海和南海北部灣竹莢魚群體存在隨機交流現(xiàn)象, 可能是該物種遺傳同質(zhì)性形成的原因。