任意數(shù)量離散不規(guī)則感興趣區(qū)域的快速熒光壽命顯微成像*

牛敬敬 劉雄波 陳鵬發(fā) 于斌 嚴(yán)偉 屈軍樂(lè) 林丹櫻

(深圳大學(xué)生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)研究中心/物理與光電工程學(xué)院,光電子器件與系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,深圳 518060)

熒光壽命顯微成像(fluorescence lifetime imaging microscopy,FLIM)技術(shù)在細(xì)胞微環(huán)境傳感中具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、可定量的優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究.其中,基于時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)(time-correlated single photon counting,TCSPC)進(jìn)行熒光壽命探測(cè)的方法是目前最常用的技術(shù)之一,但受成像原理和條件限制,該技術(shù)存在數(shù)據(jù)采集時(shí)間較長(zhǎng)、成像速度不夠快的不足.本文開(kāi)發(fā)一種能對(duì)生物樣品中任意數(shù)量離散的、形狀不規(guī)則的感興趣區(qū)域(region of interest,ROI)進(jìn)行快速FLIM 成像的技術(shù).該技術(shù)利用聲光偏轉(zhuǎn)器(acousto-optic deflector,AOD)實(shí)現(xiàn)快速靈活的尋址掃描,并通過(guò)對(duì)ROI 形狀特征的簡(jiǎn)單在線分析,實(shí)現(xiàn)AOD 與TCSPC 同步策略的優(yōu)化及壽命圖像的準(zhǔn)確重構(gòu),對(duì)于生物樣品中常見(jiàn)的存在多個(gè)離散不規(guī)則ROI情形,可大幅節(jié)省數(shù)據(jù)采集時(shí)間,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)這些ROI 的快速FLIM 成像.采用該技術(shù),對(duì)氯化銨刺激下活細(xì)胞中溶酶體探針LysoSensor Green DND-189 的熒光壽命變化進(jìn)行了動(dòng)態(tài)FLIM 成像,以監(jiān)測(cè)溶酶體管腔內(nèi)pH 值的實(shí)時(shí)變化情況.結(jié)果表明,該快速FLIM 技術(shù)可用于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)生物樣品中微環(huán)境的變化,將在活細(xì)胞微環(huán)境傳感中發(fā)揮重要作用.

1 引言

熒光壽命顯微成像(fluorescence lifetime imaging microscopy,FLIM)技術(shù)在測(cè)量細(xì)胞微環(huán)境的離子濃度、黏度、折射率、溫度和pH 值等生化參數(shù)時(shí)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、可定量的優(yōu)點(diǎn)[1?3],因而在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有著較為廣泛的應(yīng)用,成為生物醫(yī)學(xué)研究的重要工具.在各種FLIM 技術(shù)中,采用時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)(time-correlated single photon counting,TCSPC)的方法實(shí)現(xiàn)熒光壽命探測(cè)是目前最常用的做法,其原理是采用高重復(fù)頻率的脈沖激光激發(fā)樣品,同時(shí)由高靈敏度的探測(cè)器如光電倍增管(photomultiplier tube,PMT)探測(cè)單光子熒光信號(hào),通過(guò)獲取每個(gè)激發(fā)周期內(nèi)熒光光子到達(dá)探測(cè)器的時(shí)間并進(jìn)行計(jì)數(shù),得到近似熒光強(qiáng)度衰減曲線的光子數(shù)-時(shí)間分布直方圖,從而擬合或計(jì)算得到熒光壽命值[4?8].一般而言,為了得到準(zhǔn)確的熒光壽命值,該方法要求激發(fā)光不能太強(qiáng)以避免一個(gè)周期產(chǎn)生多個(gè)熒光光子的“光子堆積”效應(yīng),但同時(shí)又要求每個(gè)像素點(diǎn)累積足夠多的光子數(shù)用于壽命擬合[9?11],因此實(shí)際應(yīng)用中通常將TCSPC-FLIM 與激光掃描共聚焦顯微術(shù)[12](laser scanning confocal microscopy,LSCM)或雙光子激發(fā)熒光顯微術(shù)[13](Two-photon excited fluorescence microscopy,TPEFM)結(jié)合,通過(guò)重復(fù)多次的逐點(diǎn)掃描來(lái)累積光子數(shù),實(shí)現(xiàn)FLIM 成像.

傳統(tǒng)的掃描成像系統(tǒng)通常采用振鏡對(duì)成像視場(chǎng)進(jìn)行柵掃描,掃描方式不夠靈活,且掃描時(shí)存在機(jī)械慣性,成像速度受到限制.聲光偏轉(zhuǎn)器(acousto-optic deflector,AOD)利用聲光晶體的聲光效應(yīng),可通過(guò)加載不同的聲波頻率改變其出射光的衍射角,從而實(shí)現(xiàn)光束的線性偏轉(zhuǎn),代替振鏡作為掃描器件.相比振鏡掃描,AOD 掃描不存在機(jī)械慣性問(wèn)題,掃描速度快,重復(fù)精度高,并且由于兩個(gè)維度的偏轉(zhuǎn)可獨(dú)立控制,掃描方式很靈活,可實(shí)現(xiàn)跳躍性的快速尋址掃描[14,15].2013 年,深圳大學(xué)屈軍樂(lè)課題組[16]首次將AOD 尋址掃描應(yīng)用于TCSPC-FLIM,實(shí)現(xiàn)了對(duì)任意形狀感興趣區(qū)域(region of interest,ROI)的FLIM 成像.在該工作中,AOD掃描與TCSPC 數(shù)據(jù)采集之間只有一個(gè)同步信號(hào),控制方式簡(jiǎn)單,成像靈活.但這種方法由于需要逐點(diǎn)存儲(chǔ)壽命數(shù)據(jù)再進(jìn)行下一個(gè)像素點(diǎn)的采集,因此即使是對(duì)較小視場(chǎng)進(jìn)行成像通常也需要很長(zhǎng)的采集時(shí)間(如10×10 像素需要3 min),成像速度較慢,并不適用于快速生物醫(yī)學(xué)過(guò)程的研究.2014 年,該課題組改用像素、行、幀三個(gè)信號(hào)對(duì)AOD 掃描和TCSPC 采集進(jìn)行同步控制,從而大幅節(jié)省了采集和存儲(chǔ)時(shí)間,提升了成像速度,實(shí)現(xiàn)了壞死因子(TNF-α)誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡過(guò)程的FLIM 成像,以監(jiān)測(cè)其黏度和pH 值的變化過(guò)程,FLIM 成像速度達(dá)到了10 s/幀[17].然而,實(shí)際應(yīng)用中這種同步控制方式僅適用于單個(gè)矩形區(qū)域的掃描成像,否則后期數(shù)據(jù)重構(gòu)將過(guò)于復(fù)雜耗時(shí),從而使AOD 快速尋址掃描的優(yōu)勢(shì)不能很好發(fā)揮出來(lái),失去了對(duì)任意形狀ROI 尋址掃描的靈活性,對(duì)存在多個(gè)ROI 的情形更加無(wú)能為力.針對(duì)生物醫(yī)學(xué)研究中常見(jiàn)的存在多個(gè)離散不規(guī)則ROI 的情形,本文在上述工作的基礎(chǔ)上,通過(guò)對(duì)ROI 的形狀特征進(jìn)行簡(jiǎn)單的在線分析,對(duì)AOD 掃描與TCSPC采集之間的同步控制方式進(jìn)行優(yōu)化,并發(fā)展相應(yīng)的壽命圖像數(shù)據(jù)處理方法,可方便地實(shí)現(xiàn)對(duì)視場(chǎng)中任意數(shù)量的離散、不規(guī)則ROI 的快速FLIM 成像,為FLIM 技術(shù)在活細(xì)胞微環(huán)境傳感等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了一種新的手段.

2 系統(tǒng)與方法

2.1 快速FLIM 系統(tǒng)的搭建

圖1 為搭建的快速FLIM 系統(tǒng)示意圖.以商用倒置熒光顯微鏡(Ti2-U,Nikon)為框架,采用鈦寶石可調(diào)諧飛秒脈沖激光器(Chameleon Ultra II,Coherent)作為雙光子激發(fā)光源,常用波長(zhǎng)為800 nm,峰值功率為3.8 W,重復(fù)頻率為80 MHz.激光經(jīng)半波片HWP 和偏振分束棱鏡PBS 調(diào)節(jié)功率、擴(kuò)束鏡BE1 擴(kuò)束準(zhǔn)直和光束提升鏡BL 提升后進(jìn)入二維AOD 掃描器2D-AOD.但由于AOD 中的聲光晶體為大色散介質(zhì),需在AOD 前引入一個(gè)色散棱鏡DP 對(duì)其引起的空間和時(shí)間色散進(jìn)行預(yù)校正[18].2D-AOD 由一對(duì)正交放置的AOD (DTSXY-400-640,AA Opto-electronic)組成,激光經(jīng)AOD 產(chǎn)生的衍射光偏轉(zhuǎn)角由加載在聲光晶體上的聲波頻率決定,因此采用衍射光作為掃描光時(shí),通過(guò)加載不同的聲波頻率,就可以實(shí)現(xiàn)X-Y二維平面內(nèi)任意點(diǎn)的跳躍性掃描.聲波頻率信號(hào)由數(shù)據(jù)采集卡(USB-6353,National Instruments)輸出的數(shù)字信號(hào)轉(zhuǎn)換而成.掃描光經(jīng)擴(kuò)束鏡BE2 擴(kuò)束準(zhǔn)直后進(jìn)入顯微鏡,經(jīng)物鏡O (100×/1.45 NA,Nikon)聚焦激發(fā)樣品.產(chǎn)生的熒光經(jīng)二向色鏡DM、濾光片F(xiàn)T 和反射/透射比7:3 的分束鏡BS 同時(shí)被 PMT(PMC-100-0,Becker &Hickl GmbH)和EMCCD(DU897,Andor)收集.EMCCD 采集的熒光信號(hào)用于選取ROI;PMT 采集的熒光信號(hào)經(jīng)放大后傳輸給TCSPC 采集卡(SPC-150,Becker &Hickl GmbH)處理得到壽命數(shù)據(jù),并在計(jì)算機(jī)上由采集和分析軟件(SPCM,Becker &Hickl GmbH)存儲(chǔ)并實(shí)時(shí)顯示為熒光強(qiáng)度圖像,隨后可在該軟件(或其他壽命分析軟件)中分析得到各像素點(diǎn)的熒光壽命并顯示為熒光壽命圖像.

圖1 快速FLIM 系統(tǒng)示意圖Fig.1.Schematic diagram of fast FLIM system.

2.2 同步信號(hào)的產(chǎn)生策略

AOD 掃描與TCSPC 壽命數(shù)據(jù)的采集和存儲(chǔ)之間的同步控制,是上述快速FLIM 系統(tǒng)得以正常工作并獲得正確的熒光壽命圖像的關(guān)鍵.采用同一數(shù)據(jù)采集卡輸出的3 個(gè)脈沖信號(hào)作為像素(pixel)、行(line)、幀(frame)同步信號(hào),分別控制壽命數(shù)據(jù)存儲(chǔ)時(shí)的像素與像素、行與行、幀與幀之間的切換[19],其中像素信號(hào)需要與控制AOD 掃描的數(shù)字信號(hào)保持嚴(yán)格同步,行信號(hào)由掃描區(qū)域中每行的像素個(gè)數(shù)決定,幀信號(hào)則由掃描區(qū)域的總像素?cái)?shù)決定.通常情況下,三路同步信號(hào)均為周期信號(hào),周期長(zhǎng)度可根據(jù)掃描區(qū)域的行列數(shù)提前設(shè)定好.以掃描一個(gè)5×2 像素的矩形ROI 為例,控制AOD 掃描的數(shù)字信號(hào)和三路同步信號(hào)如圖2(a)所示,AOD掃描區(qū)域如圖2(b)所示,而TCSPC 數(shù)據(jù)采集和存儲(chǔ)如圖2(c)所示,其中數(shù)字代表數(shù)據(jù)存儲(chǔ)順序,不同顏色代表不同壽命值.

圖2 AOD 掃描信號(hào)及其與TCSPC 的同步原理示意圖 (a)數(shù)字信號(hào)及三路同步信號(hào);(b) AOD 掃描過(guò)程;(c) AOD-TCSPC同步過(guò)程Fig.2.Schematic diagram of AOD scanning signal and its synchronization principle with TCSPC:(a) Digital signal and three synchronization signals;(b) AOD scanning process;(c) AOD-TCSPC synchronization process.

但顯然這種同步信號(hào)的產(chǎn)生策略只適用于單個(gè)矩形ROI,對(duì)于形狀不規(guī)則的或者多個(gè)離散的ROI 則不適用.為了實(shí)現(xiàn)對(duì)任意數(shù)量離散不規(guī)則ROI 的快速FLIM 成像,需要對(duì)同步信號(hào)的產(chǎn)生策略進(jìn)行優(yōu)化,使其能夠與所選ROI 的形狀特點(diǎn)相對(duì)應(yīng),以得到正確的熒光壽命圖像.以圖3(a)所示的3 個(gè)離散不規(guī)則ROI 為例,為了產(chǎn)生與其盡量匹配的同步信號(hào),同時(shí)便于后期數(shù)據(jù)處理,需要對(duì)ROI 的形狀特征進(jìn)行在線分析.首先,找出包含所有ROI 的外接矩形區(qū)域(即圖中所示的6×6 像素區(qū)域),保存該外接矩形區(qū)域像素點(diǎn)的坐標(biāo)信息,用于后期數(shù)據(jù)處理;然后,計(jì)算每一行需要掃描的像素?cái)?shù)(如第一行為3 個(gè)像素),用于調(diào)整行信號(hào)的輸出,即產(chǎn)生的同步信號(hào)應(yīng)如圖3(b) 和圖3(c)所示,其中行信號(hào)不再是周期信號(hào),相鄰行信號(hào)脈沖的間距由當(dāng)前行需要掃描的像素?cái)?shù)決定.根據(jù)這種策略產(chǎn)生的三路同步信號(hào)與所選ROI 的形狀是相對(duì)應(yīng)的,因此對(duì)于任意數(shù)量任意形狀的ROI 都是適用的,也包括前面提到的單個(gè)矩形ROI.值得指出的是,對(duì)于沒(méi)有像素點(diǎn)需要掃描的“空行”,實(shí)際上并不會(huì)有行信號(hào)產(chǎn)生,同時(shí)由于TCSPC 數(shù)據(jù)存儲(chǔ)是順序無(wú)結(jié)構(gòu)的,因此存儲(chǔ)下來(lái)的熒光壽命數(shù)據(jù)并不完全與ROI 中各像素點(diǎn)的實(shí)際掃描位置相對(duì)應(yīng),如圖3(d)所示,即存儲(chǔ)下來(lái)的壽命數(shù)據(jù)仍存在未關(guān)聯(lián)到準(zhǔn)確空間位置的問(wèn)題,需要進(jìn)一步映射處理以得到準(zhǔn)確的壽命圖像.

圖3 針對(duì)任意數(shù)量離散不規(guī)則ROI 的同步信號(hào)產(chǎn)生新策略示意圖 (a)三個(gè)離散的不同形狀ROI(灰色);(b)每個(gè)掃描點(diǎn)所需的同步信號(hào);(c)按新策略產(chǎn)生的三路同步信號(hào);(d)已分行存儲(chǔ)但仍未準(zhǔn)確映射的熒光壽命數(shù)據(jù)Fig.3.Schematic diagram of a new strategy for generating synchronization signals for any number of discrete irregular ROIs:(a) Three discrete ROIs of different shapes (gray);(b) the synchronization signals required for each scan point;(c) three synchronization signals generated according to the new strategy;(d) fluorescence lifetime image data that has been stored in rows before mapping.

2.3 壽命圖像的重建

結(jié)合前面ROI 形狀分析得到的外接矩形區(qū)域信息,可以方便地對(duì)已分行存儲(chǔ)的壽命數(shù)據(jù)進(jìn)行映射處理,即將每個(gè)像素點(diǎn)得到的壽命數(shù)據(jù)移位到其實(shí)際的掃描位置處,以重構(gòu)出準(zhǔn)確的熒光壽命圖像.具體過(guò)程如圖4 所示.

首先,如圖4(a)—(c)所示,將掃描ROI 的坐標(biāo)信息與其外接矩形區(qū)域的坐標(biāo)信息進(jìn)行比較(取交集),可得到一個(gè)二值化矩陣(圖中數(shù)字表示非零元素,對(duì)應(yīng)ROI 內(nèi)的掃描像素).然后,如圖4(d)—圖4(f)所示,將該二值化矩陣中非零元素的列坐標(biāo)(圖4(d)中數(shù)字所示)與TCSPC 順序存儲(chǔ)時(shí)的列坐標(biāo)(圖4(e)中數(shù)字所示,參考圖3(d))進(jìn)行比較(相減),可計(jì)算得到每個(gè)像素的橫向相對(duì)位移(圖4(f)中數(shù)字所示),稱圖4(f)的矩陣為X方向的移位矩陣.同理,通過(guò)比較行坐標(biāo)(圖4(g)和圖4(h))可得到Y(jié)方向的移位矩陣,如圖4(i)所示.利用這兩個(gè)移位矩陣,就可以對(duì)壽命數(shù)據(jù)矩陣(圖4(j))進(jìn)行移位操作,從而得到準(zhǔn)確的壽命圖像,其中X方向移位操作結(jié)果如圖4(k)所示,繼續(xù)進(jìn)行Y方向的移位操作后,可得到如圖4(l)所示的壽命圖像.

圖4 壽命數(shù)據(jù)處理方法示意圖 (a)掃描ROI;(b)外接矩形;(c)二值化矩陣;(d)二值化矩陣非零元素列坐標(biāo);(e)壽命數(shù)據(jù)順序存儲(chǔ)列坐標(biāo);(f) X 方向移位矩陣;(g)二值化矩陣非零元素行坐標(biāo);(h)壽命數(shù)據(jù)順序存儲(chǔ)行坐標(biāo);(i) Y 方向移位矩陣;(j)未移位的壽命圖像;(k) X 方向移位后的壽命圖像;(l) Y 方向移位后的準(zhǔn)確壽命圖像Fig.4.Schematic diagram of the processing method for the lifetime image data:(a) Scanned ROIs;(b) circumscribed rectangle;(c) binarized matrix;(d) column coordinates of non-zero elements in the binarized matrix;(e) column coordinates of the lifetime data before mapping;(f) shift matrix in X-direction;(g) row coordinates of non-zero elements in the binarized matrix;(h) row coordinates of the lifetime data before mapping;(i) shift matrix in Y-direction;(j) lifetime image before mapping;(k) lifetime image after shift in X-direction;(l) correct lifetime image after shift in Y-direction.

這樣,通過(guò)在線分析所選ROI 的形狀特征并獲取其外接矩形區(qū)域的像素信息,不僅優(yōu)化了同步信號(hào)的產(chǎn)生策略,使得TCSPC 采集和存儲(chǔ)的壽命數(shù)據(jù)分行存儲(chǔ),還可以通過(guò)簡(jiǎn)單的運(yùn)算對(duì)壽命數(shù)據(jù)進(jìn)行映射處理得到準(zhǔn)確的壽命圖像,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)任意數(shù)量任意形狀ROI 的快速FLIM 成像.

3 結(jié)果與討論

3.1 任意數(shù)量離散不規(guī)則ROI 成像驗(yàn)證

為了驗(yàn)證上述方法對(duì)任意數(shù)量離散不規(guī)則ROI 的成像能力,以鈴蘭根莖切片(從Leica 公司采購(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)樣片)為例進(jìn)行成像,結(jié)果如圖5 所示.其中圖5(a)為EMCCD 采集的樣品明場(chǎng)圖像,通過(guò)LabVIEW 編寫的控制程序可在其上根據(jù)需要選取ROI(也可以在EMCCD 采集的寬場(chǎng)熒光圖像上選取),選取時(shí)可采用預(yù)設(shè)的形狀,也可以直接用鼠標(biāo)圈選任意不規(guī)則形狀,如圖中綠色圖形所示.完成選區(qū)后,數(shù)據(jù)采集卡產(chǎn)生對(duì)應(yīng)ROI 坐標(biāo)信息的數(shù)字信號(hào),控制AOD 對(duì)激光進(jìn)行偏轉(zhuǎn),實(shí)現(xiàn)對(duì)選定ROI 的掃描和激發(fā);同時(shí),程序自動(dòng)完成如前文所述的ROI 形狀特征在線分析,并控制數(shù)據(jù)采集卡按照新策略產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的三路同步信號(hào),控制TCSPC 開(kāi)始采集和存儲(chǔ)相應(yīng)的壽命數(shù)據(jù).圖5(b)為掃描過(guò)程中EMCCD 拍攝的熒光強(qiáng)度圖像,可以看到只有所選ROI 以內(nèi)的樣品被激發(fā)出熒光,其余部分沒(méi)有信號(hào).圖5(c)為利用TCSPC 采集的數(shù)據(jù)直接分析得到的熒光壽命圖像,可以看出壽命數(shù)據(jù)已分行存儲(chǔ),但由于未將壽命信息關(guān)聯(lián)到準(zhǔn)確的位置,圖像不能反映樣品的真實(shí)結(jié)構(gòu).圖5(d)為移位處理后的熒光壽命圖像,可以看到圖像中四個(gè)ROI 的結(jié)構(gòu)均與圖5(b)所示的熒光強(qiáng)度圖像符合得很好.

圖5 鈴蘭根莖切片樣品多個(gè)離散的不同形狀ROI 的FLIM成像 (a)明場(chǎng)圖像及ROI 的選取;(b) EMCCD 采集的熒光強(qiáng)度圖像;(c) TCSPC 采集得到的壽命圖像;(d)準(zhǔn)確重構(gòu)的熒光壽命圖像Fig.5.FLIM imaging of multiple discrete ROIs of different shapes in convallaria slice sample:(a) Bright field image collected by EMCCD and selection of ROIs;(b) fluorescence intensity image collected by EMCCD;(c) lifetime image collected by TCSPC;(d) corrected fluorescence lifetime image.

3.2 成像速度對(duì)比分析

本文所提的方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)ROI 的快速FLIM成像,本質(zhì)上是因?yàn)椴捎昧藢ぶ窉呙璺绞?對(duì)于多個(gè)離散的、形狀不規(guī)則的ROI 而言,可以大幅減少非感興趣像素點(diǎn)的數(shù)量,從而間接提高成像速度.以鈴蘭根莖切片樣品為例,假設(shè)有生物學(xué)意義的ROI 為圖6(a)所示的環(huán)形區(qū)域,采用本文方法進(jìn)行FLIM 成像得到的結(jié)果如圖6 所示,其中圖6(b)為EMCCD采集的熒光強(qiáng)度圖像,圖6(c)為TCSPC 采集的光子計(jì)數(shù)累積得到的熒光強(qiáng)度圖像,圖6(d)為利用TCSPC 采集的光子計(jì)數(shù)進(jìn)行分析和重構(gòu)后得到的熒光壽命圖像.作為對(duì)比,圖7 所示為掃描包含該環(huán)形ROI 的矩形區(qū)域時(shí)得到的結(jié)果.可見(jiàn),當(dāng)感興趣的結(jié)構(gòu)只是圖中環(huán)形ROI 部分時(shí),采用本文的尋址掃描成像方式可以只采集環(huán)形ROI 中的數(shù)據(jù),而傳統(tǒng)柵掃描方式則至少需要對(duì)包含該ROI 的整個(gè)矩形區(qū)域進(jìn)行掃描,因而將許多原本不需要的像素包括在內(nèi),既增加了數(shù)據(jù)采集時(shí)間,也增加了數(shù)據(jù)處理負(fù)擔(dān).定量地,可統(tǒng)計(jì)得到圖6中環(huán)形ROI 包含的像素?cái)?shù)為6164,而圖7 中矩形ROI 包含的像素?cái)?shù)為15625,在保證單像素采集的最大光子數(shù)基本一致(分別為841 和824)的前提下,圖6 和圖7 的采集時(shí)間分別為3.0 s 和7.8 s,即由于環(huán)形ROI 像素?cái)?shù)僅為矩形的約39%,相應(yīng)的采集時(shí)間縮短為矩形的38%,采集時(shí)間隨著掃描像素?cái)?shù)的減少而成比例地減少.

圖6 鈴蘭根莖切片樣品環(huán)形ROI 的FLIM 成像 (a)環(huán)形ROI 的選取;(b) EMCCD 采集的熒光強(qiáng)度圖像;(c) TCSPC采集的熒光強(qiáng)度圖像;(d)熒光壽命圖像Fig.6.FLIM imaging of a circular ROI in convallaria slice sample:(a) Selection of the circular ROI;(b) fluorescence intensity image collected by EMCCD;(c) fluorescence intensity image collected by TCSPC;(d) fluorescence lifetime image.

圖7 鈴蘭根莖切片樣品矩形ROI 的FLIM 成像 (a)矩形ROI 的選取;(b) EMCCD 采集的熒光強(qiáng)度圖像;(c) TCSPC采集的熒光強(qiáng)度圖像;(d)熒光壽命圖像Fig.7.FLIM imaging of a rectangular ROI in convallaria slice sample:(a) Selection of the rectangular ROI;(b) fluorescence intensity image collected by EMCCD;(c) fluorescence intensity image collected by TCSPC;(d) fluorescence lifetime image.

在生物醫(yī)學(xué)成像實(shí)驗(yàn)中,ROI 呈離散不規(guī)則分布的情況是非常多見(jiàn)的,例如對(duì)于細(xì)胞核或者細(xì)胞中其他細(xì)胞器的研究等.因此,對(duì)于這些情形,采用本文的方法可以大幅縮短數(shù)據(jù)采集時(shí)間,提高FLIM 成像速度.ROI 越小、越分散,采用這種方法的優(yōu)勢(shì)就越明顯.特別地,當(dāng)感興趣區(qū)域是一些離散點(diǎn)時(shí),采用本文的方法不僅方便,而且可以達(dá)到非?？斓某上袼俣?為了驗(yàn)證這一點(diǎn),采用平鋪在蓋玻片上的羅丹明6 G 溶液為樣品,選取視場(chǎng)內(nèi)構(gòu)成“FAST FLIM”圖樣的87 個(gè)離散點(diǎn)進(jìn)行成像,結(jié)果如圖8 所示.由于掃描的像素?cái)?shù)量非常少,熒光壽命圖像采集時(shí)間僅為52.2 ms,成像速度非常快.而傳統(tǒng)成像方式很難做到這一點(diǎn),這是因?yàn)殡m然TCSPC 采集時(shí)也有單點(diǎn)探測(cè)模式,但其探測(cè)的點(diǎn)是不能根據(jù)需求任意指定的,只能是視場(chǎng)中央的一個(gè)點(diǎn),一般用于調(diào)試采集參數(shù).而采用本文的成像方式,即AOD 尋址掃描結(jié)合TCSPC 三路同步信號(hào)產(chǎn)生的新策略和圖像數(shù)據(jù)處理方法,就可以方便地做到任意離散點(diǎn)的快速FLIM 成像.

圖8 羅丹明6G 溶液樣品中離散點(diǎn)的快速FLIM 成像 (a)離散像素點(diǎn)的選取;(b) EMCCD 采集的熒光強(qiáng)度圖像;(c) TCSPC采集的熒光強(qiáng)度圖像;(d)熒光壽命圖像Fig.8.Fast FLIM imaging of discrete pixels in rhodamine 6G solution:(a) Selection of the discrete pixels;(b) fluorescence intensity image collected by EMCCD; (c) fluorescence intensity image collected by TCSPC;(d) fluorescence lifetime image.

3.3 活細(xì)胞成像應(yīng)用

利用本文的快速FLIM 成像方法,對(duì)氯化銨刺激下活細(xì)胞中溶酶體探針的熒光壽命變化進(jìn)行動(dòng)態(tài)成像,以監(jiān)測(cè)溶酶體管腔內(nèi)pH 值的變化情況.實(shí)驗(yàn)采用對(duì)pH 敏感的探針LysoSensor Green DND-189 標(biāo)記人肉骨瘤細(xì)胞(U2OS,37 ℃、5% CO2孵育)中的溶酶體(標(biāo)記濃度1 μM (1 M=1 mol/L),孵育時(shí)間30 min).首先如圖9(a)—(b)所示,選取一個(gè)感興趣細(xì)胞并拍攝其明場(chǎng)圖像和寬場(chǎng)熒光強(qiáng)度圖像,發(fā)現(xiàn)溶酶體的熒光信號(hào)比較集中,進(jìn)而選擇“1”和“2”兩個(gè)ROI進(jìn)行快速FLIM 成像,單幅采集時(shí)間為200 ms.成像過(guò)程中加入10 μL 濃度為1 μM 的氯化銨溶液對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行刺激,并記錄加入氯化銨溶液后5 min 內(nèi)ROI 中的熒光壽命圖像,結(jié)果如圖9(c)和圖9(d)所示,其中圖9(c)表示加入氯化銨溶液刺激后兩個(gè)ROI 中溶酶體探針平均熒光壽命的變化,圖9(d)為部分時(shí)間點(diǎn)的熒光壽命圖像,時(shí)間點(diǎn)“0”對(duì)應(yīng)尚未加入氯化銨溶液時(shí)的結(jié)果.可以看到,在氯化銨的刺激下,兩個(gè)ROI 中溶酶體探針的熒光壽命都是先急劇變短,然后再緩慢變長(zhǎng).根據(jù)文獻(xiàn)[20]報(bào)道的探針LysoSensor-DND189 的熒光壽命與pH 值的關(guān)系(即pH 值越高,探針的熒光壽命越短;反之亦然),該過(guò)程中溶酶體探針的熒光壽命變化代表的是其管腔內(nèi)pH 值的變化情況,即在弱酸性溶液氯化銨的刺激下,活細(xì)胞中溶酶體管腔內(nèi)的pH 先急劇增大,然后再緩慢回落.該動(dòng)態(tài)結(jié)果很好地記錄了對(duì)于外界的突然刺激溶酶體管腔內(nèi)pH 值的實(shí)時(shí)變化過(guò)程.而這種實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)果,利用傳統(tǒng)的TCSPC-FLIM 是無(wú)法獲得的.

圖 9 活細(xì)胞 中LysoSensor-DND189 標(biāo)記溶 酶體的快速FLIM 成像 (a)明場(chǎng)圖像;(b) EMCCD 采集的熒光強(qiáng)度圖像及ROI 的選取;(c) ROI 平均熒光壽命隨氯化銨刺激時(shí)間的變化;(d)部分時(shí)間點(diǎn)的熒光壽命圖像Fig.9.Fast FLIM imaging of LysoSensor-DND189 labeled lysosomes in living cells:(a) Bright field image;(b) fluorescence intensity image collected by EMCCD and selection of ROIs;(c) the change of the average fluorescence lifetime in the ROIs with the stimulation time of ammonium chloride;(d) the fluorescence lifetime image of selected time points.

4 總結(jié)與展望

針對(duì)傳統(tǒng)TCSPC-FLIM 受成像原理和條件限制,存在數(shù)據(jù)采集時(shí)間長(zhǎng)、成像速度不夠快的問(wèn)題,本文開(kāi)發(fā)了一種利用AOD 進(jìn)行尋址掃描,并通過(guò)對(duì)ROI 形狀特征的在線分析和AOD-TCSPC同步策略的優(yōu)化重構(gòu)出準(zhǔn)確壽命圖像的方法,從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)任意數(shù)量的離散不規(guī)則ROI 的快速FLIM成像.本文詳細(xì)闡述了該快速FLIM 成像方法的原理和實(shí)現(xiàn)過(guò)程,并對(duì)該成像方法進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和性能分析.結(jié)果表明,利用該方法對(duì)任意數(shù)量的離散不規(guī)則ROI 進(jìn)行FLIM 成像均能夠得到正確反映樣品真實(shí)結(jié)構(gòu)的熒光強(qiáng)度圖像和壽命圖像,并且由于避免了對(duì)非感興趣像素點(diǎn)的掃描,可大幅節(jié)省采集時(shí)間,實(shí)現(xiàn)快速FLIM 成像.采用該技術(shù),對(duì)氯化銨刺激下活細(xì)胞中溶酶體探針LysoSensor-DND189 的熒光壽命變化進(jìn)行了動(dòng)態(tài)FLIM 成像,實(shí)現(xiàn)了溶酶體管腔內(nèi)pH 值變化情況的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè).該方法將為動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)生物樣品中某些感興趣對(duì)象(如細(xì)胞器等)的快速微環(huán)境變化提供很好的工具.