王海帆 王予涵 初 明 李 燕 王月丹**
(1 北京大學基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫學系 北京 100191 2 北大附中實驗學校 北京 100032)
2020年10月7日,瑞典卡羅林斯卡大學醫(yī)學院諾貝爾獎評選委員會宣布,2020年諾貝爾化學獎授予CRISPR/Cas9 技術(shù)的發(fā)明者——來自法國的微生物學家埃馬紐埃爾·卡彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier)和來自美國的分子生物學家詹妮弗·杜德納(Jennifer A.Doudna),以表彰她們在基因編輯技術(shù)研究與應用領(lǐng)域中所作出的重要貢獻。
諾貝爾獎是當今世界上授予科學家的最高學術(shù)榮譽獎勵,只有對人類社會和科學發(fā)展具有重大影響力的科研成果及其完成人才能獲得如此殊榮??ㄅ淼俸投诺录{研究的基因編輯技術(shù)是什么?該基因編輯技術(shù)對人類又有哪些影響和貢獻? 在此,一起學習了解一下。
細菌是一種常見的微生物,體積很小,在動物和植物等其他生物體內(nèi)均有大量的寄生性細菌。但是,在細菌體內(nèi)也會有寄生物,這就是被稱為噬菌體的病毒。當人體被細菌感染后,人體的免疫系統(tǒng)就會對體內(nèi)寄生的細菌進行清除,這就是免疫反應的現(xiàn)象。同樣,細菌被噬菌體感染后,也會啟動其擁有的細菌免疫系統(tǒng),清除病毒的感染。
長久以來,人們一直都沒有發(fā)現(xiàn)細菌清除病毒感染的具體機制。直至1987年,日本科學家石野良純(Ishino Y)在對細菌的研究中發(fā)現(xiàn),在大腸桿菌堿性磷酸酶的編碼區(qū)下游,存在著一段包括29 個堿基大小的重復片段和32~33 個堿基組成的非重復序列相互間隔串聯(lián)排列所組成的重復結(jié)構(gòu)區(qū)域[1-2]。由于技術(shù)條件所限,這種結(jié)構(gòu)區(qū)域的功能在當時并未明確,也未引起研究人員的關(guān)注。隨著現(xiàn)代分子生物學和測序技術(shù)的發(fā)展,在對細菌的測序工作中,人們發(fā)現(xiàn)這種串聯(lián)性重復結(jié)構(gòu)區(qū)域在細菌中廣泛存在。為了規(guī)范研究,人們將這種串聯(lián)性重復結(jié)構(gòu)區(qū)域命名為成簇規(guī)律間隔性短回文重復序列(clustered regul-arly interspaced short palindromic repeats),英文縮寫為CRISPR[3]。后來,人們通過對質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細菌的研究,發(fā)現(xiàn)這種串聯(lián)性重復結(jié)構(gòu)區(qū)域的功能為清除進入細菌內(nèi)的噬菌體和質(zhì)粒等攜帶的外源性DNA 分子[4-6],即細菌發(fā)揮適應性免疫應答效應的系統(tǒng)[7]。
細菌的CRISPR 結(jié)構(gòu)一般是由編碼短回文重復區(qū)和間隔區(qū)序列組成的串聯(lián)性重復結(jié)構(gòu),并與其上游編碼CRISPR 相關(guān)蛋白(CRISPR-associated protein,Cas 蛋白)的Cas基因、前導區(qū)共同組成CRISPR/Cas 系統(tǒng)[1](圖1)。在這個系統(tǒng)中,Cas基因具有非常豐富的多態(tài)性,其編碼的Cas 蛋白具有核糖核酸結(jié)合的結(jié)構(gòu)域,同時還具有核酸內(nèi)切酶和解旋酶的活性[8]。前導區(qū)實際上就是CRISPR 序列的啟動子區(qū)域,負責結(jié)合轉(zhuǎn)錄酶,啟動CRISPR 序列的轉(zhuǎn)錄。CRISPR 序列中的重復序列一般由21~48個堿基組成回文序列,可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu);而間隔區(qū)則是細菌捕獲的來自質(zhì)粒或噬菌體的外源性DNA片段,即細菌建立的DNA 序列“黑名單”。
圖1 CRISPR/Cas 系統(tǒng)基因結(jié)構(gòu)模式圖
此系統(tǒng)是如何幫助細菌消滅入侵的外源性DNA 分子的? 在此,筆者以CRISPR/Cas9 系統(tǒng)為例進行簡要說明。在外源性DNA (例如噬菌體DNA)首次進入細菌時,細菌會將外源性DNA 的一段序列整合到其自身基因組CRISPR 結(jié)構(gòu)中的間隔區(qū)中,此過程稱為適應。當具有同樣DNA 序列的噬菌體再次感染細菌時,CRISPR 基因就會被激活轉(zhuǎn)錄生成一系列CRISPR RNA(crRNA),每一條crRNA 均包含一段由之前感染的外源性DNA序列轉(zhuǎn)錄而來的間隔序列(“黑名單”序列),此過程稱為表達。接著,細菌內(nèi)的一種被稱為反式激活crRNA (tracrRNA)的分子,會分別與crRNA 和Cas9 蛋白結(jié)合,形成具有酶活性的RNA/蛋白酶復合物。通過堿基的互補配對作用,這個復合體可和帶有與crRNA 序列相同的外源性DNA 分子結(jié)合,并通過Cas9 的核酸內(nèi)切酶活性,分別切割與crRNA 互補配對結(jié)合的DNA 鏈及其互補鏈,使DNA 分子發(fā)生雙鏈斷裂,從而降解進入細菌的外源性DNA 分子,干擾噬菌體對細菌的感染,此過程稱為干擾。
通過識別、轉(zhuǎn)錄和干擾3 個步驟,細菌即可通過免疫記憶的方式,特異性地識別噬菌體的DNA序列,并將其降解,從而起到保護細菌正常生存和繁殖的作用。
目前,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas 系統(tǒng)主要分為兩大類,其中2 類CRISPR/Cas 系統(tǒng)都只有一個共同的效應蛋白酶——Cas9。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是發(fā)現(xiàn)最早、結(jié)構(gòu)最簡單、研究最明確及應用最為廣泛的CRISPR/Cas 系統(tǒng)。
基因是編碼一條多肽鏈或功能RNA 所需核苷酸序列的總和,是記錄支持著生命活動基本構(gòu)造和性能信息的載體,決定了一個生命的生存、生長和凋亡等全部的生理過程和表型。
自從發(fā)現(xiàn)核酸和基因以來,人們就一直在嘗試通過基因編輯的方式,對基因進行改造,從而實現(xiàn)根本性改變或調(diào)節(jié)生命活動的目的。在CRISPR/Cas9 系統(tǒng)并應用于編輯基因之前,人們已經(jīng)在大量使用鋅指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFNs)及轉(zhuǎn)錄激活樣效應因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)等技術(shù),通過可與特定DNA 序列結(jié)合的核酸酶靶向特異性的DNA 序列,進行基因的編輯[9]。但是,由于這個過程需要核酸酶蛋白分子與DNA 的特異性結(jié)合,每次編輯時,均需要按照靶點序列的不同,重新設(shè)計和構(gòu)建不同的核酸酶蛋白,工作流程復雜,成本很高,單一實驗室往往很難完成,因此,其應用范圍受到了很大的制約,往往只能用于實驗室的科學研究工作。
通過研究,人們發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)導致的發(fā)生雙鏈斷裂的DNA 分子,也可通過易于發(fā)生錯誤的非同源末端連接的方式進行修復,但這種修復往往會導致基因敲除、敲入和染色體轉(zhuǎn)位等編輯效應。
2011年,卡彭蒂耶團隊發(fā)表了第1 篇關(guān)于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)完整結(jié)構(gòu)的論文[10]。他們通過基因分析等實驗研究發(fā)現(xiàn),在細菌清除外源性DNA 過程中,共有4 個組成構(gòu)件參與,分別是一種被稱為Csn1 的蛋白質(zhì)分子(即Cas9)、crRNA、tracrRNA 和一種RNA 酶(RNA 酶Ⅲ)。但在這篇論文中,對于這4 種成分的具體功能,卡彭蒂耶并未給出答案。論文發(fā)表后,引起了美國加州大學伯克利分校杜德納教授的關(guān)注。2012年,杜德納與卡彭蒂耶聯(lián)手在《科學》上發(fā)表論文[11],揭示了Cas9 是具有RNA 引導下DNA 內(nèi)切酶活性的蛋白質(zhì)分子,并在體外非細胞體系中,證實了該分子具有切割任意DNA 分子序列的能力,具有修改基因的活性[12]。這也是杜德納和卡彭蒂耶獲得諾貝爾化學獎的主要成就。
但是,由于在實驗中遇到了一些技術(shù)性的困難,杜德納和卡彭蒂耶團隊并未能在細胞內(nèi)成功地完成基因編輯的工作,這也是最終該成果未能獲得諾貝爾醫(yī)學或生理學獎的重要原因。美國華裔科學家張峰在看到卡彭蒂耶論文之后,也開始積極研究基于CRISPR/Cas9 的基因編輯技術(shù),于2013年最終在活體細胞內(nèi)成功地實現(xiàn)了基因編輯,并且還在不斷發(fā)展和改進著以CRISPR/Cas系統(tǒng)為基礎(chǔ)的基因編輯技術(shù),使人們對細胞的基因編輯技術(shù)不斷簡化和實用。
由于CRISPR/Cas 技術(shù)中使用的Cas 蛋白分子具有切割任意DNA 序列的能力,具有非常好的通用性和廣泛的適用范圍,在使用時不再需要像ZFNs 和TALENs 技術(shù)那樣重新構(gòu)建新的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),而只需要合成一段引導RNA(gRNA)即可實現(xiàn)對任意的基因進行編輯。這極大推動了基因編輯在各個領(lǐng)域中的應用,目前,CRISPR/Cas 基因編輯技術(shù)主要可用于基因功能研究、生物育種和人類疾病的治療中。
在基因功能的研究方面,CRISPR/Cas 技術(shù)可極大縮短基因編輯工具的構(gòu)建時間周期,提高構(gòu)建的效率,已廣泛應用于斑馬魚、小鼠、食蟹猴、果蠅、線蟲、豬、兔等各種動物的基因敲除、敲入和誘導突變等模型的建立,極大推動了人們對各種基因功能的研究和認知,為揭開生命現(xiàn)象的最后密碼提供了一件研究的“神器”。
在生物育種方面,CRISPR/Cas 技術(shù)能針對作物本身的基因進行定點精準突變或精準編輯,從而能極大提高育種的效率,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有非常重要的應用價值。目前,該技術(shù)已在水稻、小麥和大豆等農(nóng)作物中應用,改善這些農(nóng)作物在抗病能力、雜種優(yōu)勢、不育性、株高、支鏈淀粉含量、抗除草劑性能和香味等方面的性能。此外,在番茄、土豆和萵苣等11 個園藝作物品種中也在使用CRISPR/Cas 的基因編輯技術(shù)[13]。有人統(tǒng)計,目前已有包括模式植物、農(nóng)作物、果樹等木本植物和草本植物的多達21 個物種,使用該技術(shù)進行了基因編輯并取得了成功。在動物育種方面,有人采用CRISPR/Cas 技術(shù),對綿羊胚胎的成纖維細胞進行基因編輯也取得了成功。
在人類疾病治療方面,CRISPR/Cas 技術(shù)獲得了巨大的成功。首先,通過對人類胚胎中突變的HBB基因進行編輯修飾,在治療β-地中海貧血癥的患者中取得了巨大的成果,使這種遺傳性血紅蛋白缺陷病的治愈成為現(xiàn)實。此外,CRISPR/Cas 技術(shù)在治療鐮刀形紅細胞貧血、血友病及亨廷頓舞蹈病等遺傳性疾病方面,也都取得了很大的進展,成為基因治療的重要技術(shù)工具[14]。利用該技術(shù),人們還可對干細胞和CAR-T 細胞等免疫細胞進行基因編輯,敲除與治療不良反應相關(guān)的基因,從而提升干細胞和免疫細胞的治療效果,減少副作用,在惡性腫瘤等疾病的治療中,取得了成功,并且在不斷地推廣。
在很短的時間內(nèi),CRISPR/Cas 技術(shù)就在基因編輯領(lǐng)域中取得了飛速的發(fā)展,但在造福于人類的同時,該技術(shù)也存在一些問題,并且給人類社會帶來了挑戰(zhàn)。
首先,由于CRISPR 靶向目的基因的引導片段很短,只有幾十個堿基,而人類的基因非常龐大有數(shù)10 億個堿基對,所以,很容易發(fā)生引導片段識別非目的基因序列而出現(xiàn)的脫靶現(xiàn)象,造成非目的基因的受損,產(chǎn)生基因編輯相關(guān)的損傷。因此,如何提升CRISPR/Cas 系統(tǒng)識別和編輯基因的精準度,是改善該技術(shù)應用的重要技術(shù)性問題[15]。
另一方面,為了能讓CRISPR/Cas 系統(tǒng)的成分發(fā)揮基因編輯功能,必須使用一定的遞送方法讓其能進入細胞。目前,主要的遞送方法包括物理遞送(例如,顯微注射、電轉(zhuǎn)導技術(shù)等)、化學遞送(例如,使用脂質(zhì)體、納米顆粒投遞系統(tǒng)等)和生物遞送3 種方式。其中,生物遞送是臨床基因治療中最常用的遞送方法,占臨床基因治療的70%以上。主要用于生物遞送的載體是慢病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒(AAV)。其中,AAV 免疫原性和生物學毒性都較低,是最為常用的基因治療病毒載體,但在基因治療中,AAV 載體相關(guān)的死亡事件屢有發(fā)生,成為制約基因治療和基因編輯技術(shù)臨床應用的“瓶頸”。因此,發(fā)展和改良CRISPR/Cas 的遞送系統(tǒng),提升其安全性和有效性,也是基因編輯和治療技術(shù)亟待解決的關(guān)鍵性技術(shù)問題。
由于基因是人類的生命密碼,對于人類基因的編輯,不僅面臨技術(shù)發(fā)展和改善的問題,也給人類社會生活帶來了巨大的挑戰(zhàn)。倫理學問題是CRISPR/Cas 基因編輯技術(shù)應用時難以回避的問題,哪些人類基因能被編輯?基因編輯后對人類健康和行為有哪些影響?哪些人的基因可被編輯?經(jīng)基因編輯的人類胎兒是否允許出生? 在這些問題得到科學和恰當?shù)慕獯鹬埃瑢τ谌祟惖幕蚓庉媶栴}應慎之又慎。
無論如何,CRISPR/Cas 技術(shù)給人們又一次帶來能改變自己命運的神奇工具,希望人們能用好這把“魔力之剪”,讓生活變得更加健康、更加美好、更加幸福。
因為是獎勵化學研究方面的成就,有關(guān)CRISPR/Cas 技術(shù)的諾獎并未授予在細菌中發(fā)現(xiàn)CRISPR 系統(tǒng)的日本科學家石野良純和首次利用CRISPR/Cas9 技術(shù)進行活體細胞基因編輯的美國華裔科學家張峰。但是,正如石野良純在祝賀2 位科學家獲獎時所說的,“但我并不后悔,古細菌的其他研究同樣讓我感到快樂,并一直支持著我走到今天”。是的,科學的意義在于發(fā)現(xiàn),科學家的研究就是他們的快樂。這就是科學家追求的全部。