血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子在宮頸癌中的表達(dá)及其與微血管密度的關(guān)系

劉松格，谷見法，潘瓊，易善永

鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，鄭州 467000

宮頸癌是發(fā)病率僅次于乳腺癌的女性惡性腫 瘤，流行病學(xué)報(bào)道近年來宮頸癌逐漸呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性的生命健康。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子生物學(xué)指標(biāo)在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用得到逐步重視。血管生成被認(rèn)為是腫瘤發(fā)展的重要病理改變，這一過程是在多種細(xì)胞因子調(diào)控下完成，目前研究已鑒定了多種與血管生成相關(guān)的因子。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種具有高度特異性及選擇性的有絲分裂原，研究表明該生長(zhǎng)因子在體外可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及凋亡，而在體內(nèi)其可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖從而促進(jìn)血管的形成。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是調(diào)節(jié)神經(jīng)及血管形成的多肽生長(zhǎng)因子，廣泛分布于機(jī)體多種組織，對(duì)多種類型細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及功能調(diào)節(jié)均有影響。本研究旨在探討宮頸癌患者VEGF、bFGF的表達(dá)水平與微血管密度（microvessel density，MVD）的關(guān)系，以期明確宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中組織病理變化及相關(guān)因子表達(dá)的改變，為宮頸癌診斷及病情評(píng)估提供新思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年6月至2018年9月于鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院行外科手術(shù)的宮頸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：初診患者；經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為宮頸鱗狀細(xì)胞癌；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前行其他抗腫瘤治療；合并其他全身性疾?。缓喜⑿哪X血管疾?。缓喜⒕裥约膊?。根據(jù)納入與排除標(biāo)準(zhǔn)，共選取118例宮頸癌患者作為宮頸癌組，年齡33～68歲，平均（51.48±10.27）歲。另選取同期鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院收治的宮頸上皮內(nèi)瘤變、宮頸炎患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：液基薄層細(xì)胞檢測(cè)及臨床檢查提示為宮頸上皮內(nèi)瘤變、宮頸炎；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并全身性疾病、心腦血管疾病、精神性疾病。根據(jù)納入與排除標(biāo)準(zhǔn)，共選取71例宮頸上皮內(nèi)瘤變患者作為瘤變組，年齡29～77歲，平均（50.96±8.88）歲；共選取50例宮頸炎患者作為對(duì)照組，年齡22～70歲，平均（51.26±9.02）歲。收集宮頸癌組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織、宮頸炎組織進(jìn)行研究。

1.2 方法

使用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)VEGF、bFGF的表達(dá)情況，試劑均由Santa Cruz公司提供，其中VEGF抗體稀釋濃度為1∶200，bFGF稀釋濃度為1∶500。所有組織標(biāo)本均采用多聚甲醛固定，石蠟包埋，并采用切片機(jī)切取4 μm切片，切片脫蠟后采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗，以3%過氧化氫室溫孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗后加入5%牛血清孵育10 min；滴加一抗置于4℃環(huán)境下孵育過夜，沖洗后二抗室溫孵育20 min，沖洗后加入鏈親和素-過氧化物酶孵育20 min，沖洗后采用二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木精復(fù)染，經(jīng)脫水、透明、封片等操作完成制片。在光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）下觀察切片，陽性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)呈彌散的棕黃色，對(duì)顯微鏡下視野內(nèi)的陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以陽性細(xì)胞百分率≥10%為陽性，陽性細(xì)胞百分率＜10%為陰性。結(jié)果判定由2名高年資病理學(xué)醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行觀察，意見不一致的病例經(jīng)探討后給出最終結(jié)論。

采用免疫組織化學(xué)染色法以CD34單克隆抗體標(biāo)記測(cè)定MVD，染色方法同上，以與鄰近細(xì)胞、結(jié)締組織界限清晰且呈棕色染色的內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞群作為一個(gè)血管，先在低倍鏡下尋找血管密度較高的5個(gè)區(qū)域，然后在高倍鏡下進(jìn)行MVD計(jì)數(shù)，以5個(gè)區(qū)域的均值作為該樣本的MVD值。細(xì)胞計(jì)數(shù)由兩名高年資病理醫(yī)師在雙盲情況下進(jìn)行，以兩位醫(yī)師計(jì)算的平均值作為最終結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 VEGF、bFGF表達(dá)情況的比較

宮頸癌組、瘤變組及對(duì)照組患者VEGF、bFGF陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）；宮頸癌組、瘤變組患者VEGF、bFGF陽性表達(dá)率均明顯高于對(duì)照組（

P

＜0.01），且宮頸癌組患者VEGF、bFGF陽性表達(dá)率均明顯高于瘤變組（

P

＜0.01）。（表1、圖1）

表1 各組患者中VEGF、bFGF陽性表達(dá)情況的比較[ n（%）]

圖1 宮頸癌組織中VEGF、bFGF的陽性表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)染色法）

2.2 MVD的比較

宮頸癌組、瘤變組及對(duì)照組患者中MVD計(jì)數(shù)依次為（37.41±5.27）、（27.84±4.59）、（15.42±4.25），三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

F

=366.857，

P

＜0.01），宮頸癌組、瘤變組患者中MVD均明顯高于對(duì)照組（

P

＜0.01），且宮頸癌組MVD明顯高于瘤變組（

P

＜0.01）。

2.3 不同臨床特征宮頸癌患者宮頸癌組織中VEGF、bFGF陽性表達(dá)率及MVD的比較

不同國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況宮頸癌患者宮頸癌組織中VEGF、bFGF陽性表達(dá)率的比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=4.395、6.676，

P

=0.036、0.009）。不同分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤浸潤(rùn)深度宮頸癌患者宮頸癌組織中MVD的比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=4.685、6.195、8.013、5.237，

P

＜0.01）。（表2）

表2 不同臨床特征宮頸癌患者宮頸癌組織中VEGF、bFGF陽性表達(dá)率及MVD的比較（ n=118）

2.4 宮頸癌組織中VEGF、bFGF陽性表達(dá)與MVD計(jì)數(shù)的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析示，宮頸癌組織中VEGF、bFGF陽性表達(dá)與MVD呈正相關(guān)（

r

=0.529、0.601，

P

＜0.05）。

3 討論

研究認(rèn)為，實(shí)體瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移均與血管的生成相關(guān)，血管生成是腫瘤生長(zhǎng)及浸潤(rùn)的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，也是其生物學(xué)行為中的重要部分，因此對(duì)血管生成的研究可明確良性疾病的惡變趨勢(shì)，也可反映惡性病灶的生物學(xué)行為。

本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組及瘤變組患者VEGF、bFGF陽性表達(dá)率均明顯高于對(duì)照組，且宮頸癌組陽性表達(dá)率最高，提示VEGF、bFGF的高表達(dá)可能與宮頸癌的發(fā)生相關(guān)。采用CD34免疫組織化學(xué)染色方法測(cè)定各組織中的MVD，結(jié)果顯示，宮頸癌組織MVD明顯高于瘤變組及對(duì)照組，提示宮頸癌患者也可伴有MVD的增加。周慶紅等研究比較了宮頸癌組、宮頸瘤變組及宮頸炎組患者VEGF、bFGF表達(dá)水平，結(jié)果也證實(shí)宮頸癌組及宮頸瘤變組患者可伴有VEGF、bFGF陽性表達(dá)率升高，且宮頸癌組患者陽性表達(dá)率均高于宮頸瘤變組。梁志洪等對(duì)宮頸癌及宮頸息肉組織中

bFGF

mRNA表達(dá)情況分析證實(shí)，宮頸癌表達(dá)量明顯高于宮頸息肉組。Sidorkiewicz等研究證實(shí)，宮頸鱗狀細(xì)胞癌及腺癌中VEGF表達(dá)均明顯升高，與本研究結(jié)果相似。

本研究對(duì)不同臨床特征的宮頸癌患者進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，VEGF、bFGF陽性表達(dá)率可能與宮頸癌FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，具體表現(xiàn)為宮頸癌FIGO分期越高其陽性表達(dá)率越高，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者陽性表達(dá)率越高，這一結(jié)果提示VEGF、bFGF的表達(dá)可能在宮頸癌進(jìn)展、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用。另外，在宮頸癌患者宮頸癌組織中，MVD與患者分化程度、FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示MVD與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展也存在密切關(guān)系。VEGF一方面可誘導(dǎo)新生毛細(xì)血管的生成為腫瘤生長(zhǎng)提供營養(yǎng)及代謝，另一方面VEGF也可直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)；另外，新生血管內(nèi)皮常有裂隙，VEGF可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放膠原酶使腫瘤細(xì)胞及腫瘤組織分離、脫落，為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供條件。目前關(guān)于VEGF及bFGF表達(dá)量與宮頸癌臨床特征的關(guān)系研究較多，但報(bào)道的相關(guān)性不盡相同。杜俊俊等的研究證實(shí)，宮頸癌患者VEGF表達(dá)與病理學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與病理組織學(xué)類型、FIGO分期無明顯相關(guān)。陳舒等證實(shí)不同F(xiàn)IGO分期與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的VEGF陽性表達(dá)率差異顯著。國外一項(xiàng)研究證實(shí)，VEGF與宮頸癌組織病理學(xué)分級(jí)無明顯相關(guān)性，各研究存在一定差異的原因可能與研究對(duì)象、指標(biāo)的陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)差異相關(guān)。

如上文所述，宮頸癌患者宮頸癌組織中均可伴有VEGF、bFGF陽性表達(dá)率升高及MVD升高，對(duì)兩者關(guān)系進(jìn)行研究可能可對(duì)MVD的形成機(jī)制有一定參考。本研究結(jié)果顯示，VEGF及bFGF陽性表達(dá)率與宮頸癌患者宮頸癌組織中MVD呈正相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)VEGF、bFGF表達(dá)上調(diào)可能與MVD的升高存在密切關(guān)系，提示VEGF及bFGF陽性表達(dá)率的升高可能促進(jìn)宮頸癌微血管新生能力，從而提高宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的重要因素。目前已有靶向調(diào)控VEGF、bFGF從而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤效應(yīng)的報(bào)道。本研究證實(shí)了VEGF、bFGF與血管新生存在一定關(guān)系，或可為靶向治療提供一定參考。

綜上所述，宮頸癌組織中可伴有VEGF、bFGF陽性表達(dá)率的升高及MVD的升高，其升高與宮頸癌腫瘤侵襲性及病灶轉(zhuǎn)移相關(guān)，這些指標(biāo)可作為宮頸癌診斷、病情評(píng)估的參考指標(biāo)。VEGF、bFGF的表達(dá)與宮頸癌組織MVD密切相關(guān)，VEGF、bFGF表達(dá)水平的增加可能為宮頸癌組織微血管生成的重要機(jī)制之一，基于此，VEGF、bFGF可作為抗腫瘤血管生成、延緩病情進(jìn)展的重要靶點(diǎn)，考慮到腫瘤血管生長(zhǎng)因子的異質(zhì)性，通過檢測(cè)個(gè)體生長(zhǎng)因子的表達(dá)可為干預(yù)方案的制訂提供參考。