TBC 1結(jié)構(gòu)域家族成員15蛋白、最小表觀擴散系數(shù)對腦膠質(zhì)瘤惡性程度及預(yù)后的預(yù)測價值

郝曉偉，趙亞超，米建強，范波

河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河南 洛陽 471003

腦膠質(zhì)瘤是大腦中最常見的原發(fā)腫瘤，其惡性程度對治療方案和預(yù)后的影響很大。根據(jù)膠質(zhì)瘤分化程度的不同，可進一步分為Ⅰ～Ⅳ級，其中Ⅰ、Ⅱ級為低級別膠質(zhì)瘤，Ⅲ、Ⅳ級為高級別膠質(zhì)瘤。術(shù)前準確判斷惡性程度和病理分級，有助于制訂治療方案和判斷預(yù)后。釓增強MRI檢查是臨床上確定膠質(zhì)瘤性質(zhì)的一種常用

方法

，但不能顯示微觀生理狀態(tài)。磁共振彌散加權(quán)成像（diffu-sion weighted imaging，DWI）可以觀察活體組織中水分子的運動情況，后處理軟件獲得的DWI數(shù)據(jù)的表觀擴散系數(shù)（apparent diffusion coefficient，ADC）可間接揭示生物組織的微觀結(jié)構(gòu)。研究表明，TBC1結(jié)構(gòu)域家族成員15（TBC domain family member 15，TBC1D15）在膠質(zhì)瘤組織中的表達水平明顯高于正常腦組織。同時，其在肝癌細胞、乳腺癌、前列腺癌和甲狀腺癌中也均呈高表達，分析其在膠質(zhì)瘤的生長過程中發(fā)揮的重要作用，為通過調(diào)節(jié)TBC1D15的表達來抑制膠質(zhì)瘤的生長提供了可能。本研究主要探討TBC1D15蛋白、ADC與膠質(zhì)瘤病理分級及患者預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017年1月至2020年1月河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的132例腦膠質(zhì)瘤患者。納入標準：①經(jīng)病理學(xué)檢查確診為腦膠質(zhì)瘤；②均接受MRI檢查，且接受手術(shù)切除治療；③年齡＞18歲。排除標準：①術(shù)前未接受放化療等抗腫瘤治療；②合并免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病等其他嚴重疾??；③合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤。根據(jù)WHO分類標準，132例腦膠質(zhì)瘤患者中，低級別膠質(zhì)瘤56例，高級別膠質(zhì)瘤76例。低級別膠質(zhì)瘤患者中男35例，女 21例；年齡（58.82±9.75）歲；體重指數(shù)為（22.18±2.03）kg/m；合并高血壓11例，合并糖尿病8例。高級別膠質(zhì)瘤患者中男42例，女34例；年齡（55.95±9.10）歲；體重指數(shù)為（22.09±2.11）kg/m；合并高血壓17例，合并糖尿病12例。兩組患者性別、年齡和體重指數(shù)等基線特征比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 免疫組化法檢測TBC 1 D15蛋白的表達情況

取手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤組織，10%甲醛固定24～48 h后石蠟包埋。將石蠟標本切成厚度約為4 mm的連續(xù)組織切片4張，60℃烘烤3 h，常規(guī)脫蠟，加3%過氧化氫10 min，室溫下孵育，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌3次，每次3 min，檸檬酸溶液修復(fù)，PBS洗滌3次，每次3 min。加入一抗孵育過夜，PBS洗滌3次，每次3 min，添加聚合物增強劑，室溫下孵育20 min，PBS洗滌3次，每次3 min，添加酶標記的抗小鼠聚合物（二抗，室溫下孵育30 min），PBS洗滌3次，每次3 min，滴加免疫組化鏈霉親和素-生物素化過氧化酶復(fù)合物染色（streptoavidin-biotin-enzymecomplex，SABC）試劑并置于室溫環(huán)境中30 min，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色用水沖洗，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水封片。

結(jié)果判定：細胞呈黃色或褐色為陽性表達，細胞結(jié)構(gòu)清晰，陽性顆粒定位好，著色與背景反差明顯判定為TBC1D15陽性。使用圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析，每個切片隨機選擇3個高倍視野（×200），測量3個視野的積分光密度（integral optic density，IOD）值，取平均值。

1.3 MRI檢查方法

采用美國GE公司的1.5T磁共振儀，配備8通道相控陣頭顱線圈。常規(guī)MRI檢查，序列包括矢狀T1加權(quán)成像（T1-weighted imaging，T1WI）-快速液體衰減反轉(zhuǎn)恢復(fù)序列（fluid attenuated inversion recovery，F(xiàn)LAIR）、橫截面白色自旋回波（spin echo，SE）T1WI-FLAIR、快速自旋回波（fast spin echo，F(xiàn)SE）T2加權(quán)成像（T2-weighted imaging，T2WI）、液體衰減反轉(zhuǎn)恢復(fù)序列FLAIR、靜脈注射釓噴替酸葡甲胺（Gadolinium diethylenetriamine pentaacetic acid，Gd-DTPA）矢狀和橫向T1WI增強掃描。掃描范圍為顱頂至枕骨孔，層厚6 mm，間隔2 mm。DWI掃描采用單激發(fā)SEEPI序列，在X、Y和Z方向施加色散梯度，b=0，1000 s/mm，重復(fù)時間（repetition time，TR）為4800 ms，回撥時間（echo time，TE）為68.6 ms，視野（field of vision，F(xiàn)OV）為240 mm×240 mm，矩陣128×128，掃描時間為77 s。掃描層定位與橫斷面T1WI、T2WI、FLAIR序列一致。

圖像后處理將原始數(shù)據(jù)上傳至ADW 4.3工作站，利用Functool軟件進行后處理，由兩名經(jīng)驗豐富的神經(jīng)放射科醫(yī)師閱圖，測量ADC值。瀏覽腫瘤病灶各級ADC圖，根據(jù)常規(guī)MRI圖像避開腫瘤的囊性、壞死、出血和鈣化區(qū)域，在腫瘤的每一層放置2～3個30～40 mm的感興趣區(qū)域（region of interest，ROI），選擇最小ADC值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 TBC 1 D15蛋白IOD值、最小ADC值比較

高級別腦膠質(zhì)瘤組織中TBC1D15蛋白IOD值明顯高于低級別腦膠質(zhì)瘤組織，最小ADC值明顯低于低級別腦膠質(zhì)瘤組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＜0.01）。（表1）

表1 高級別和低級別腦膠質(zhì)瘤組織中TBC 1 D15蛋白IOD值、最小ADC值比較（±s）

2.2 不同臨床特征腦膠質(zhì)瘤患者腦膠質(zhì)瘤組織中TBC 1 D15蛋白IOD值、最小ADC值的比較

不同年齡、性別、腫瘤類型及腫瘤直徑腦膠質(zhì)瘤患者腦膠質(zhì)瘤組織中TBC1D15蛋白IOD值、最小ADC值比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征腦膠質(zhì)瘤患者TBC 1 D15蛋白IOD值、最小ADC值（ n=132）

2.3 不同預(yù)后情況腦膠質(zhì)瘤患者腦膠質(zhì)瘤組織中TBC 1 D15蛋白IOD值、最小ADC值比較

截至2021年6月，132例腦膠質(zhì)瘤患者中，死亡52例，生存80例。死亡腦膠質(zhì)瘤患者腦膠質(zhì)瘤組織中TBC1D15蛋白IOD值明顯高于生存患者，最小ADC值明顯低于生存患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＜0.01）。（表3）

表3 不同預(yù)后情況腦膠質(zhì)瘤患者腦膠質(zhì)瘤組織中TBC 1 D15蛋白、最小ADC值比較（±s）

2.4 TBC 1 D15蛋白IOD值、最小ADC值對高級別腦膠質(zhì)瘤的預(yù)測價值

TBC1D15蛋白IOD值、最小ADC值診斷高級別腦膠質(zhì)瘤的AUC分別為0.883和0.848，此時的最佳截斷值分別為0.99和1.11×10mm/s。（表4）

表4 TBC 1 D15蛋白IOD值、最小ADC值對高級別腦膠質(zhì)瘤的預(yù)測價值

2.5 TBC 1 D15蛋白IOD值、最小ADC值對腦膠質(zhì)瘤患者死亡的預(yù)測價值

TBC1D15蛋白IOD值、最小ADC值預(yù)測腦膠質(zhì)瘤患者死亡的AUC分別為0.913和0.888，此時的最佳截斷值分別為1.12和0.95×10mm/s。（表5）

表5 TBC 1 D15蛋白IOD值、最小ADC值對腦膠質(zhì)瘤患者死亡的預(yù)測價值

3 討論

不同級別腦膠質(zhì)瘤的手術(shù)方式選擇和預(yù)后有明顯差異，低級別膠質(zhì)瘤是良性腫瘤，預(yù)后較好，而高級別膠質(zhì)瘤需要進行手術(shù)切除輔助放化療治療，患者的預(yù)后較差，復(fù)發(fā)率高。術(shù)前準確評估膠質(zhì)瘤的級別有助于治療方案的選擇和預(yù)后評估。由于膠質(zhì)瘤存在典型異質(zhì)性，同一腫瘤樣本可能有不同的分級，活檢部位選擇錯誤可能低估腫瘤級別，影響治療方案的選擇。只有腫瘤分級最高的部分才能反映腫瘤的真實病理分級。高級別膠質(zhì)瘤在MRI檢查方面也有不均質(zhì)性。腫瘤實質(zhì)部分的最小ADC值最能代表每個腫瘤中細胞密度最高或細胞增殖最明顯的部分，從而反映腫瘤的真實分級。

本研究結(jié)果顯示，高級別腦膠質(zhì)瘤組織的最小ADC值明顯低于低級別腦膠質(zhì)瘤組織，與文獻報道相一致，腫瘤最小ADC值可能與腫瘤分級呈負相關(guān)。高級別腦膠質(zhì)瘤腫瘤細胞排列緊密且數(shù)量增多，核異型性大，細胞外空間縮小，擴散明顯受限，ADC值降低，結(jié)果表明，ADC值可以預(yù)測腦膠質(zhì)瘤的分級。本研究結(jié)果顯示，死亡患者腦膠質(zhì)瘤組織中最小ADC值明顯低于生存患者，表明最小ADC值與腫瘤惡性程度有關(guān)。這可能是因為病灶小灶性壞死增多，細胞水分子減少，擴散受限，ADC值偏低。

TBC家族蛋白可參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，該家族的大部分蛋白具有原癌基因的功能，可能通過調(diào)節(jié)Rab蛋白參與細胞惡性轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)移。TBC1D15屬于TBC蛋白家族成員，作為Rab-GAP并負調(diào)控Rab蛋白。TBC1D15還可以作為葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）易位的主要調(diào)節(jié)劑，并進一步影響GLUT4介導(dǎo)的葡萄糖攝取。腫瘤細胞獲得能量的方式發(fā)生變化、能量代謝紊亂均可能與腫瘤細胞線粒體功能有關(guān)。因此，調(diào)節(jié)線粒體動力學(xué)可能會調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長。本研究通過免疫組化法檢測TBC1D15蛋白在腦膠質(zhì)瘤中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高級別腦膠質(zhì)瘤組織中TBC1D15蛋白IOD值明顯高于低級別腦膠質(zhì)瘤組織，死亡腦膠質(zhì)瘤患者腦膠質(zhì)瘤組織中TBC1D15蛋白IOD值明顯高于生存患者，表明TBC1D15蛋白的表達隨著腫瘤分級和惡性程度的增加而增加。在細胞分化差、惡性程度高的腫瘤組織中TBC1D15蛋白表達強度較高，而在細胞分化較好、病理分級較低的腫瘤組織中表達強度較低。表明TBC1D15蛋白、腫瘤的病理分級和預(yù)后有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤組織TBC1D15蛋白IOD值、最小ADC值變化不受患者年齡、性別、腫瘤類型及腫瘤直徑的影響，在預(yù)測腦膠質(zhì)瘤惡性程度和預(yù)后方面具有一定的價值。

因為ROI的選擇位置會影響結(jié)果，有的ROI的選擇測量腫瘤增強部分，有的測量未增強的部分；對壞死組織ROI測量也會導(dǎo)致測量ADC值存在差異，不同級別膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)重疊，本研究選擇腫瘤實質(zhì)部分的最小ADC值作為分析指標，并取多次測量的平均值，以保證結(jié)果的準確性。

目前，有研究探討TBC1D15在抑制腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖和促進膠質(zhì)瘤細胞的凋亡方面的機制研究，而在預(yù)測膠質(zhì)瘤惡性程度及患者預(yù)后方面的價值尚不明確，本研究進一步探討發(fā)現(xiàn)，TBC1D15蛋白表達在預(yù)測腦膠質(zhì)瘤惡性程度和患者預(yù)后方面明顯優(yōu)于最小ADC值，具有較好的研究價值，有助于對腦膠質(zhì)瘤患者的早期診斷、治療，改善患者的預(yù)后。但本研究的不足在于不同級別患者較少，需要通過大樣本研究和臨床試驗進行驗證，后期可以增加基因水平和動物水平相關(guān)實驗進一步探索作用機制。

綜上所述，高級別腦膠質(zhì)瘤組織TBC1D15蛋白表達上調(diào)，但其最小ADC值較低，在預(yù)測腦膠質(zhì)瘤惡性程度及預(yù)后方面有一定價值。