江門市新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏篩查方法的切值分析及基因突變發(fā)生情況

楊應(yīng)松 鐘志來 楊 梅 譚杰亮 劉穎妍 曾欽龍 李智明 唐 佳

廣東省江門市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東江門 529000

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥（glucose-6-phos phate dehydrogenase deficiency，G6PDd），又稱為“蠶豆病”，是我國廣東、廣西、海南等沿海省份高發(fā)的病種之一[1]。G6PDd 患兒在服用蠶豆后就會出現(xiàn)核黃疸及急性溶血癥狀，嚴(yán)重威脅患兒性命。G6PDd 目前沒有有效的根治措施，以預(yù)防及對癥治療為主。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）建議，在男性G6PDd 發(fā)病率超過3%～5%的高風(fēng)險地區(qū)應(yīng)常規(guī)開展新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氧酶（glucose-6-phosphate，G6PD）的篩查[2]。通過對患兒進(jìn)行最有效的早篩查、早診斷、早干預(yù)，從而避免溶血、核黃疸等不良后果的發(fā)生[3]。熒光定量法是G6PD 篩查的常用方法，但目前G6PD 的篩查切值目前尚沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。章曉燕等[4]在2015年調(diào)查我國220 家篩查實驗室，結(jié)果顯示G6PD 切值分布在2.00～10.00 U/g Hb，且不同實驗室來源的樣本，其診斷的切值也存在一定的差別。本研究對江門市新生兒遺傳代謝病篩查中心的G6PD 篩查情況、召回情況進(jìn)行回顧性分析，旨在了解江門市新生兒的G6PD 突變基因型，并通過回顧分析制定適合的切值，以期提高陽性預(yù)測值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年1月至2020年5月在江門市新生兒遺傳代謝病篩查中心進(jìn)行G6PD 篩查的113 665 例新生兒血斑者作為研究對象進(jìn)行回顧性分析，其中男59 651 例，女54 014 例，男女比例為1.1∶1。所有參與篩查的新生兒家屬或監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書，并自愿參與本研究。本研究已經(jīng)相關(guān)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①出生滿72 h 者；②充分哺乳8 次以上者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①哺乳不足者；②臨床資料不全，無法召回者。

1.2 方法

1.2.1 G6PD 熒光定量法 在新生兒監(jiān)護(hù)人知情同意下，新生兒在生后48 h 并充分哺乳8 次以上后，由?？谱o(hù)士采集足跟血制成干血斑。血斑通過快遞送至江門市新生兒遺傳代謝病篩查中心檢測。使用廣州豐華生物工程有限公司G6PD 熒光定量分析試劑盒進(jìn)行檢測，實驗過程嚴(yán)格按試劑說明書操作。對G6PD≤3.0 U/g Hb 判定為陽性，并均對該范圍內(nèi)的新生兒進(jìn)行召回，召回成功的疑似G6PDd 新生兒有889 例。同時隨機選取初篩G6PD 陰性的2839 例新生兒進(jìn)行追蹤隨訪，采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析G6PD 熒光定量法篩查的切值。

1.2.2 G6PD 酶活性檢測 將889 例召回的可疑G6PDd新生兒進(jìn)行進(jìn)一步分析。采集召回的可疑G6PDd 患兒靜脈血，采用G6PD 定量測定試劑盒速率法（北京利德曼生物有限公司）及TBA-2000FR 全自動生化分析儀（日本東芝）測定酶活性，以酶活性＜1300 U/L 者診斷為陽性。

1.2.3 G6PD 熱點基因變異檢測 采用多色熔解曲線G6PD 基因突變檢測試劑盒（廈門致善生物科技公司）及SLAN96P 熒光定量PCR 儀（上海宏石醫(yī)療科技有限公司），對國內(nèi)常見的12 種突變位點（c.95A＞G、c.383T＞C、c.392G＞T、c.487G＞A、c.517T＞C、c.592C＞T、c.871G＞A、c.1004C＞A、c.1024C＞T、c.1360C＞T、c.1376G＞T、c.1388G＞A）進(jìn)行定性測定，嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作。

1.3 觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

統(tǒng)計113 665 例新生兒的G6PD 熒光定量法篩查結(jié)果，并進(jìn)一步統(tǒng)計889 例召回的可疑G6PDd 新生兒的熱點基因變異檢測及酶活性確診結(jié)果，分析G6PD 熒光定量法的切值。其中G6PD 熒光定量法篩查陽性和召回的標(biāo)準(zhǔn)均為G6PD≤3.0 U/g Hb。酶活性檢測陽性的標(biāo)準(zhǔn)為＜1300 U/L，正常范圍為≥1300 U/L。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用率表示。G6PD 熒光定量法診斷切值用ROC 進(jìn)行分析確定，根據(jù)ROC 曲線下面積（area under the curve，AUC）的最大確定最終的切值。

2 結(jié)果

2.1 G6PD 熒光定量法篩查情況

對113 665 例新生兒G6PD 熒光定量法篩查結(jié)果進(jìn)行分析，以≤3.0 U/g Hb 為切值，對所有G6PD 熒光定量法篩查結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，各項指標(biāo)結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，共篩查出可疑陽性男嬰4180 例，女嬰814 例，男女比例為5.14∶1。男女初篩陽性率分別為7.01%、1.51%，總體篩查陽性率達(dá)4.39%。

表1 江門市G6PD 熒光定量法篩查陽性患者的性別分布

男、女嬰的G6PD 熒光定量法篩查分布結(jié)果見圖1、2，結(jié)果顯示，男嬰篩查結(jié)果呈雙峰分布，女嬰篩查結(jié)果大致呈正態(tài)分布，分別在2.9～3.2 U/g Hb 及1.8～2.0 U/g Hb 存在波谷。

圖1 113 665 例新生兒中男、女嬰的G6PD 熒光定量法篩查結(jié)果分布圖

2.2 召回疑似G6PDd 新生兒的熱點基因變異檢測及酶活性確診結(jié)果

召回的889 例疑似G6PDd 新生兒中，有222 例進(jìn)行了熱點基因突變檢測，共檢測出220 例發(fā)生突變。男嬰188 例半合子突變，突變類型以c.1388G>A（占比33.51%）、c.1376G>T（占比30.32%）、c.95A>G（占比14.36%）、c.871G>A（占比9.57%）、c.1024C>T（占比6.91%）的檢測率較高，占男嬰突變位點的94.68%（表2）；女嬰雜合突變20 例，復(fù)合雜合10 例，純合1例，雙重雜合1 例（表3）。

表2 220 例發(fā)生突變新生兒中男嬰的熱點基因變異類型檢測結(jié)果

表3 220 例發(fā)生突變新生兒中女嬰的熱點基因變異類型檢測結(jié)果

召回的889 例疑似G6PDd 新生兒中，有835 例進(jìn)行酶活性確診，男嬰724 例，確診陽性715 例，女嬰111 例，確診陽性86 例。召回的889 例疑似G6PDd 新生兒中，同時進(jìn)行熱點基因突變檢測及酶活性確診的有179 例，其中有7 例酶活性在正常范圍內(nèi)，均為女性，即有7 例女嬰的酶活性結(jié)果與G6PD 熒光定量法篩查方法結(jié)果不一致。后經(jīng)熱點基因突變檢測，均確診為雜合突變。

2.3 G6PD 熒光定量法篩查切值的ROC 曲線分析

針對召回的889 例疑似G6PDd 新生兒以及隨機選取初篩G6PD 陰性的2839 例新生兒進(jìn)行追蹤隨訪，采用ROC 分析G6PD 熒光定量法篩查的切值。隨訪共得到假陽性43 例，假陰性12 例。

按性別的不同對G6PD 熒光定量法進(jìn)行ROC 曲線分析，AUC 最大值作為該篩查方法的最佳切值，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，男、女嬰的AUC 最大值分別是0.992 和0.888，其所對應(yīng)的男嬰和女嬰G6PD 水平的切值分別為2.98、2.97 U/g Hb（表4）。

表4 G6PD 熒光定量法篩查切值的ROC 曲線分析

圖2 男嬰、女嬰G6PD 熒光定量法篩查切值的ROC 曲線分析

3 討論

G6PD 基因突變時，機體紅細(xì)胞膜上的G6PD 酶數(shù)量減少或活性降低，導(dǎo)致還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）生成減少，不能維持紅細(xì)胞的柔韌性，紅細(xì)胞不易通過脾竇或肝竇而被破壞，容易導(dǎo)致新生兒高膽紅素血癥甚至核黃疸[5-6]。有研究報道[7]顯示，16.4%的G6PDd 患兒因高膽紅素血癥需要輸血治療，幾乎是非G6PDd 新生兒的5 倍。G6PDd 目前沒有根治的治療手段，及早確診、健康教育、預(yù)防發(fā)病是目前最重要的預(yù)防措施。G6PD 缺乏癥在我國的發(fā)病率呈南高北低的趨勢，廣東省是G6PDd 的高發(fā)區(qū)，發(fā)病率可達(dá)3.1%～16.1%[8-9]。因此，將G6PDd 列入新生兒疾病篩查，有助于預(yù)防G6PDd 導(dǎo)致的新生兒高膽紅素腦病及嚴(yán)重溶血性貧血，因此早期確診、健康教育，對避免新生兒觸及致病因素等顯得尤為重要。

江門市篩查中心自2005年起，開始推廣G6PDd篩查，2018年將G6PDd 篩查納入新生兒遺傳代謝病篩查補助項目，對江門市新生兒進(jìn)行普篩。本研究選取2018年1月至2020年5月在江門市新生兒遺傳代謝病篩查中心進(jìn)行篩查的113 665 例新生兒血斑者作為研究對象進(jìn)行回顧性分析，以確診方法評估目前的篩查手段，制定合適的切值，以提高陽性預(yù)測值。江門市的男、女嬰初篩陽性率分別為7.01%、1.51%，總體篩查陽性率達(dá)4.39%，整體處于中等水平，這與相關(guān)報道[10]的結(jié)果大致相符。

目前G6PDd 的診斷性方法主要有G6PD 酶活性檢測和基因突變檢測。在本研究中熱點基因檢測結(jié)果顯示，男嬰188 例半合子突變，突變類型以c.1388G>A、c.1376G>T、c.95A>G、c.871G>A、c.1024C>T、c.392G>T 較為多見，其中以c.1388G>A、c.1376G>T、c.95A>G三者的檢出率較高，而前兩者也是中國人特有的與G6PD 活性相關(guān)的基因突變位點，驗證了既往相關(guān)研究者們[11-12]的研究結(jié)論。酶活性檢測方法簡單、快速且成本低，容易在各醫(yī)療單位開展。本研究中篩查陽性與酶活性檢測，男嬰、女嬰符合率分別為98.76%、77.48%。根據(jù)隨機失活學(xué)說，女性雜合子由于其X 染色體隨機失活，導(dǎo)致部分女性雜合子酶活性可在正常范圍內(nèi)，故呈現(xiàn)出X 連鎖半顯性遺傳[13]。因此單以酶活性作為診斷標(biāo)準(zhǔn)時，男嬰的符合率高，女嬰的符合率偏低[14]。對女性雜合子、臨床高度懷疑而酶活性正常者，基因檢測是確診的重要依據(jù)，本研究中，有7 例女嬰的酶活性結(jié)果與G6PD 熒光定量法篩查方法結(jié)果不一致，后經(jīng)熱點基因突變檢測，均確診為雜合突變，因此對于女性雜合突變者，單以酶活性作為確診依據(jù)，有可能會造成漏診，建議有條件的單位應(yīng)開展G6PD 基因檢測更佳。

各地篩查中心的切值來源主要是試劑盒說明書、篩查共識，但由于各地的發(fā)病率不同，因此篩查中心需不斷積累各自實驗室的數(shù)據(jù)，制定本地區(qū)、本實驗室的切值，以降低假陽性，防止假陰性的發(fā)生[15]。如果單純通過百分位數(shù)法來制定切值，難以確定百分位數(shù)的范圍。ROC 曲線能把篩查方法切值的靈敏度和特異度平衡在一個最佳點，對追蹤隨訪的3728 例新生兒進(jìn)行ROC 曲線分析，男嬰和女嬰AUC 分別為0.992 和0.888，其所對應(yīng)的男嬰和女嬰G6PD 水平的切值分別為2.98、2.97 U/g Hb，因此筆者建議，將G6PD 熒光定量法切值設(shè)為3.0 U/g Hb 是比較符合的。不過在張鈺等[16]的研究中，四川新生兒G6PD 熒光定量法的篩查切值在3.4 U/g Hb，與本研究結(jié)果之間存在一定的差異。分析原因，可能是由于地區(qū)不同，也可能是由于本研究的樣本量數(shù)據(jù)不夠大，因此結(jié)果有所偏差。因此各地篩查中心在今后的工作中需要不斷積累數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的回顧性分析，以便得到更切合各地區(qū)實際的切值，從而盡可能地降低假陽性率。

綜上所述，江門市新生兒G6PD 基因突變的發(fā)生情況處于中等水平，其中以c.1388G>A、c.1376G>T、c.95A>G、c.871G>A、c.1024C>T、c.392G>T、c.1360C>T、c.1004C>A 為主要突變位點。建議以3.0 U/g Hb 作為江門市G6PD 熒光定量法篩查的切值，是較為符合的，有助于減少假陽性率。