朝藥桑黃的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

王 輝 王樂奇 楊樹東 韓 達(dá) 宋愛群

1.長春市食品藥品檢驗(yàn)中心中藥室，吉林長春 130012；2.東北師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，吉林長春 130024；3.長春市食品藥品檢驗(yàn)中心分析儀器研究室，吉林長春 130012；4.吉林省通化博祥藥業(yè)股份有限公司項(xiàng)目部，吉林集安 134200

[關(guān)鍵字]朝藥桑黃；微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜；重金屬及有害元素；薄層色譜鑒別；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

桑黃始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，《本草經(jīng)集注》《藥性論》《新修本草》和《千金翼方》等古代本草書籍均有收載，歷史上“桑黃”藥名最早出現(xiàn)在《藥性論》[1]。現(xiàn)代《中藥大辭典》[2]、朝鮮族醫(yī)藥文獻(xiàn)《鄉(xiāng)藥集成方》[3]等有收載。桑黃傳統(tǒng)用于止血活血、化飲、止瀉，主治脫肛瀉血、崩中帶下、瘕積聚、利五臟、伏血等癥[2]。桑黃是國際高度關(guān)注的食藥用菌之一，現(xiàn)代研究證明其具有抗氧化活性，能用于治療癌癥，與癌癥化療藥物聯(lián)用具有增效減毒作用，具有提高機(jī)體免疫力、保肝護(hù)肝、抗菌消炎等功效[4-6]。

桑黃的記載已有兩千多年歷史，依據(jù)古籍對(duì)桑黃性狀的描述，經(jīng)過現(xiàn)代分類學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)，外觀相似的真菌多種，確定桑黃非單一來源[7]。收載桑黃的法定標(biāo)準(zhǔn)有《湖北省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[8]、甘肅省中藏藥材標(biāo)準(zhǔn)[9]、《安徽省中藥飲片炮制規(guī)范》[10]等，但桑黃藥材基源各不同。

桑黃為吉林省朝鮮族習(xí)用藥材，是吉林省藥用菌重要栽培品種，長白山地區(qū)“特色藥材”。該藥材法定標(biāo)準(zhǔn)收載于《吉林省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[11]和《吉林省中藥飲片炮制規(guī)范》[12]。本文采用微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）、薄層色譜法和紫外-可見分光光度法，對(duì)不同產(chǎn)地桑黃的安全性與質(zhì)量進(jìn)行考察，旨在為桑黃質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立與評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

TLC Visualizer 2 薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)（瑞士CAMAG 公司）；MARS6 微波消解儀（美國CEM 公司）；NexION 2000 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國Perkin Elmer 公司）；UV2550 紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；TU-1900 紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；XS105 電子天平（美國梅特勒公司）。

1.2 試劑及試藥

硅膠G 薄層板（青島海洋化工廠分廠）；甲苯（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；硝酸（Fisher Chemical）；蒽酮（上海麥克林生化科技有限公司）；硫酸（北京化學(xué)試劑公司）；亞硝酸鈉、乙酸乙酯、硝酸鋁、氫氧化鈉（均為北京化工廠）；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.3 樣本、對(duì)照品及對(duì)照藥材

25 種元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)：19D6230）；汞（Hg，批號(hào)：191046-3）；銦（In，批號(hào)：193014）；鈧（Sc，批號(hào)：193021）；鉍（Bi，批號(hào)：193022-1）；金（Au，批號(hào)：191095-2）。以上元素標(biāo)準(zhǔn)溶液來源為國家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心。D-無水葡萄糖（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110833-201707，含量：99.9%）；蘆?。ㄖ袊称匪幤窓z定研究院，批號(hào)：100080-201811，含量：91.7%）；桑黃對(duì)照藥材[由海南醫(yī)學(xué)院范宇光副教授鑒定，基原為銹革孔菌科瓦寧木層孔菌Sanghuangporus vaninii（Ljub） L.W.Zhou &Y.C.Dai[11]]。

樣本來源見表1。

表1 樣本來源

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）鑒別方法

取樣本粗粉1.5 g，加甲醇60 ml，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml 使溶解，作為供試品溶液。另取桑黃對(duì)照藥材1.5 g，同法制成桑黃對(duì)照藥材溶液。按照薄層色譜法試驗(yàn)[13]59，吸取樣本與桑黃對(duì)照藥材溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（8∶5∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

2.1.2 微波消解-ICP-MS 測(cè)定法

2.1.2.1 對(duì)照品的制備

將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用（5%+95%）的硝酸依次按1∶50∶1.667∶3∶2∶5 依次稀釋成相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，將汞單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液用（5%+95%）的硝酸配制成0.1、0.5、1、2、3 μg/L 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用，將In、Bi、Sc 配制成濃度為100 μg/L 的內(nèi)標(biāo)混合溶液。

2.1.2.2 樣本的處理

稱取樣品粗粉0.5 g，置微波消解內(nèi)罐中，加入7 ml硝酸，用微波消解法消解完全，加入200 μl 濃度為1 μg/ml 的Au 單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，將消解罐放入石墨消解儀上100℃加熱30 min，用水定容至50 ml，混勻備用。

除不加Au 單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液外，同法制備試劑空白。

2.1.2.3 加樣回收率

稱取2 號(hào)樣品6 份，每份0.5 g，分別加入26 種元素標(biāo)準(zhǔn)品，然后按樣品操作，測(cè)定加樣回收率。

2.1.2.4 實(shí)驗(yàn)條件

消解儀條件：5 min 由室溫升到100℃保持3 min，7 min 由100℃升到150℃保持10 min，7 min 由150℃升到180℃保持20 min。

ICP-MS 條件：射頻發(fā)生器功率為1600 W，碰撞氣為氦氣，載氣為氬氣，霧化氣流量為1.04 L/min，駐留時(shí)間為50 ms，霧化室溫度為2℃，數(shù)據(jù)采集重復(fù)次數(shù)為3 次。

2.1.3 桑黃多糖含量測(cè)定方法

2.1.3.1 樣本的處理

取樣本粗粉0.9 g，精密稱定，置錐形瓶中，加水100 ml 使樣品充分潤濕，靜置1 h，加熱回流4 h，趁熱濾過，用少量熱水洗滌濾器和濾渣，將濾渣及濾紙置錐形瓶中，加水100 ml，加熱回流3 h，趁熱濾過，用少量熱水洗滌濾器和濾渣，合并濾液，置水浴上蒸干，殘?jiān)盟?0 ml 溶解，邊攪拌邊緩慢滴加無水乙醇90 ml，搖勻，在4℃放置12 h，離心，棄去上清液，沉淀物用熱水溶解并轉(zhuǎn)移至25 ml 量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，取溶液適量，離心，精密量取上清液5 ml 置50 ml 量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。測(cè)定法參照《中華人民共和國藥典》（2020年版·一部）靈芝項(xiàng)下[14]195。

2.1.3.2 方法學(xué)

2.1.3.2.1 線性與范圍 精密稱取于105℃干燥至恒重的無水葡萄糖對(duì)照品12.01 mg，置100 ml 容量瓶中，加水制成每1 ml 含0.1201 mg 的溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線制備參照《中華人民共和國藥典》（2020年版·一部）靈芝項(xiàng)下方法[14]195進(jìn)行配制并測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.3.2.2 精密度試驗(yàn) ①重復(fù)性：取5 號(hào)樣品粗粉0.45 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，共9 份，對(duì)照品按1.5∶1、1∶1、0.5∶1 加入，每個(gè)比例制備3 份，按樣本處理方法提取測(cè)定；②中間精密度：取5 號(hào)樣品粗粉0.9 g，不同操作人員，不同的紫外-可見分光光度計(jì)，不同檢測(cè)日期，按樣本處理方法提取測(cè)定，測(cè)定桑黃多糖含量。

2.1.3.2.3 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取已知含量5 號(hào)樣品粗粉0.45 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，共9 份，對(duì)照品按1.5∶1、1∶1、0.5∶1 加入，每個(gè)比例制備3 份，按樣本處理方法提取測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。

2.1.3.2.4 耐用性試驗(yàn) ①紫外-可見分光光度計(jì)考察：分別采用二個(gè)不同品牌的紫外可見分光光度計(jì)（島津UV2550，帶寬分別為0.5、1、2 nm，普析通用TU-1900，帶寬為2 nm）；②試劑考察：分別采用不同廠家的蒽酮和硫酸，配制硫酸蒽酮溶液，測(cè)定同一樣品中多糖的含量。

2.1.4 桑黃總黃酮含量測(cè)定方法

2.1.4.1 樣本的制備

取本品粗粉約0.3 g，精密稱定，加60%乙醇60 ml，加熱回流提取2 h，放冷，濾過，用60%乙醇35 ml，分次洗滌殘?jiān)?，合并濾液，置100 ml 量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.4.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取蘆丁對(duì)照品適量，加60%乙醇適量，制成每l ml 中含蘆丁0.2 mg 的溶液，即得。

2.1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取對(duì)照品溶液l、2、3、4、5、6 ml，分別置25 ml 量瓶中，各加水至6 ml，加5%亞硝酸鈉溶液1 ml，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液l ml，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 ml，再加水至刻度，搖勻，放置15 min。以相應(yīng)的試劑為空白，通過全波長掃描，確定波長為509 nm，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.4.4 精密度試驗(yàn)

①重復(fù)性：取5 號(hào)樣品粗粉0.15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，共9 份，對(duì)照品按1.5∶1、1∶1、0.5∶1 加入，每個(gè)比例制備3 份，按樣本制備方法提取、測(cè)定。②中間精密度：取5 號(hào)樣品粗粉0.3 g，不同操作人員，不同紫外-可見分光光度計(jì)，不同檢測(cè)日期，按樣本制備方法提取，測(cè)定。

2.1.4.5 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取已知含量5 號(hào)樣品粗粉0.15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，共9 份，對(duì)照品按1.5∶1、1∶1、0.5∶1 加入，每個(gè)比例制備3 份，按樣本制備方法提取、測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。

2.1.4.6 耐用性試驗(yàn)

紫外-可見分光光度計(jì)考察：分別采用二個(gè)不同品牌的紫外-可見分光光度計(jì)（島津UV2550，帶寬分別為0.5、1、2 nm，普析通用TU-1900，帶寬為2 nm），測(cè)定樣品中總黃酮的含量。

2.2 結(jié)果

2.2.1 TLC 鑒別結(jié)果

進(jìn)行耐用性和不同產(chǎn)地樣本考察，結(jié)果表明，TLC 鑒別的耐用性良好，專屬性強(qiáng)，10 批不同產(chǎn)地的樣本薄層色譜圖見圖1，結(jié)果顯示，其薄層色譜圖基本一致，此方法的建立能有效保證桑黃的質(zhì)量。

圖1 TLC 色譜圖

2.2.2 ICP-MS 測(cè)定結(jié)果

26 種元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線、r值、線性范圍等參數(shù)見表2。相應(yīng)濃度范圍內(nèi)回歸方程r值均高于0.995，線性關(guān)系良好。平行制備11 個(gè)試劑空白，測(cè)定試劑空白值，檢出限為3 SD。同一樣本重復(fù)測(cè)定7 次，計(jì)算儀器精密度，結(jié)果良好。加樣回收率和r值均符合《中華人民共和國藥典》（2020年版·四部）規(guī)定[13]482。

表2 桑黃的ICP-MS 方法學(xué)參數(shù)

10 批桑黃樣本的各元素含量檢測(cè)結(jié)果見表3。

表3 桑黃的ICP-MS 檢驗(yàn)結(jié)果（mg/kg）

2.2.3 桑黃多糖含量測(cè)定結(jié)果

2.2.3.1 方法學(xué)

2.2.3.1.1 線性與范圍 無水葡萄糖在0.024～0.120 mg范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系?；貧w方程為：y=0.937 95x+0.133 29，r=0.9982。

2.2.3.1.2 精密度試驗(yàn) ①重復(fù)性：結(jié)果平均值為1.43%，RSD=1.6%（n=9），表明該法的重復(fù)性良好。②中間精密度：結(jié)果平均值為1.42%，RSD=2.9%（n=6）。表明該法的中間精密度良好。

2.2.3.1.3 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 平均回收率為94.6%，RSD=1.5%（n=9）。

2.2.3.1.4 耐用性試驗(yàn) ①紫外-可見分光光度計(jì)考察：結(jié)果顯示，不同儀器和帶寬對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，無明顯差異；②不同試劑的考察：6 種組合配制成的硫酸蒽酮溶液的測(cè)定結(jié)果平均值為1.44%，RSD=1.8%（n=6）。

2.2.3.2 樣本含量

10 批桑黃多糖含量測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 多糖含量測(cè)定結(jié)果

2.2.4 桑黃總黃酮測(cè)定結(jié)果

2.2.4.1 方法學(xué)

2.2.4.1.1 線性及范圍 總黃酮以蘆丁計(jì)在0.2～1.2 mg范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系?；貧w方程為：y=0.473 61x-0.0112，r=0.9996。

2.2.4.1.2 精密度試驗(yàn) 重復(fù)性測(cè)定結(jié)果平均值為8.77%，RSD=1.4%（n=9），試驗(yàn)表明該法的重復(fù)性良好；中間精密度含量測(cè)定結(jié)果平均值為8.76%，RSD=2.7%（n=6），結(jié)果表明該法的中間精密度良好。

2.2.4.1.3 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 總黃酮平均回收率為96.3%，RSD=1.4%（n=9）。

2.2.4.1.4 耐用性試驗(yàn) 分別采用兩個(gè)不同品牌的紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定，測(cè)定結(jié)果平均值為8.74%，RSD=1.8%（n=4），顯示不同儀器和帶寬對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，無明顯差異。

2.2.4.2 樣本含量10 批桑黃總黃酮的含量測(cè)定結(jié)果見表5。

表5 總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

對(duì)薄層色譜鑒別中提取溶劑（甲醇、乙酸乙酯、石油醚）及提取方法（回流提取與超聲處理）進(jìn)行了考察。結(jié)果表明提取溶劑為甲醇時(shí)，提取成分較多，同時(shí)回流提取與超聲處理無明顯差別，由于超聲方法處理簡(jiǎn)單，重復(fù)性與穩(wěn)定性良好，易于檢驗(yàn)，故采用甲醇超聲作為桑黃薄層鑒別處理方法。

通過微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定10 批不同產(chǎn)地桑黃中26 種元素的含量。結(jié)果分析：①鉛、鎘、砷、汞、銅為《中華人民共和國藥典》（2020年版·四部）規(guī)定的5 種重金屬及有害元素，參照人參項(xiàng)下相關(guān)規(guī)定[14]8，桑黃樣本均未超標(biāo)。②高含量的5 種有益元素，分別為鉀（2772.0～6514.7 mg/kg）、鎂（1299.9～1938.2 mg/kg）、鈣（523.62～1753.90 mg/kg）、鈉（19.886～359.370 mg/kg）和鐵（38.469～534.440 mg/kg）。鉀元素能維持水分平衡、調(diào)節(jié)血流量、影響神經(jīng)傳導(dǎo)和對(duì)肌肉正常收縮協(xié)助等生理作用，對(duì)治療跌打損傷和活血理氣有輔助療效[15]。其中鉀元素含量最高，與桑黃的活血、化飲、治瘕積聚、利五臟療效相符。鐵元素參與細(xì)胞色素的合成、氧的運(yùn)輸和貯存及提高機(jī)體免疫，可能與桑黃提高機(jī)體免疫力相關(guān)。據(jù)報(bào)道大運(yùn)動(dòng)量的極限或亞極限的力竭訓(xùn)練后，人體鉀、鎂、鈣、鈉等元素的流失，會(huì)引起運(yùn)動(dòng)型心源疲勞[16]。桑黃中鉀、鈣、鈉、鎂元素含量高，對(duì)其開發(fā)改善心臟功能的產(chǎn)品，有重要意義。③銻為高致癌元素[17]、鉈元素和鋇元素有人體中毒劑量[18-19]，銻元素未檢出，鉈元素、鋇元素含量低，均未超標(biāo)。鋅和硒元素含量較低，剩余11種元素，按每日使用最大劑量30 g[2]計(jì)算，攝入量低，同時(shí)無桑黃人體中毒報(bào)道。26 種元素的檢測(cè)，目前為止未發(fā)現(xiàn)安全風(fēng)險(xiǎn)，為桑黃安全性提供依據(jù)。

研究證明,桑黃多糖具有抗腫瘤、改善機(jī)體有氧運(yùn)動(dòng)、抗氧化和保護(hù)造血機(jī)能損傷等作用[20-23]，桑黃的總黃酮具有抗癌和抗氧化活性[24-25]，因此建立桑黃多糖與總黃酮檢驗(yàn)方法。

本研究同時(shí)對(duì)10 批不同產(chǎn)地桑黃進(jìn)行考察，結(jié)果重復(fù)性與穩(wěn)定性良好，易于檢驗(yàn)，能夠?yàn)樯｜S質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究與開發(fā)提供依據(jù)。