叢枝菌根真菌對(duì)基質(zhì)栽培葉用萵苣和菠菜氮肥用量的減施效果

周佳琦 張 鈺 張夢(mèng)燚 薄 宇 季 為 孫 錦

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇南京 210095）

我國(guó)氮肥施用量居世界前列（宋亞娜 等，2017），單位面積平均施用化肥量遠(yuǎn)超世界平均水平（靳前龍 等，2018）。過量施用氮肥不僅無法增產(chǎn)，還會(huì)造成土壤酸化、地力下降、地下水污染等環(huán)境危害。此外，過量施用氮肥導(dǎo)致作物內(nèi)累積的硝酸鹽會(huì)在人體中被細(xì)菌還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與血紅蛋白結(jié)合會(huì)引起高鐵血紅蛋白癥（都韶婷等，2007；王流國(guó)和王雪蒙，2016）；在酸性環(huán)境中，亞硝酸鹽會(huì)與次級(jí)胺反應(yīng)生成亞硝胺，誘導(dǎo)消化系統(tǒng)發(fā)生癌變（李智文 等，2005）。

葉菜是一類以新鮮葉片與葉柄為食用部位的蔬菜，富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，是人體內(nèi)無機(jī)鹽和維生素的主要來源（劉俐和方芳，2008）。隨著綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展，葉菜類蔬菜越來越受大眾喜愛。我國(guó)是世界上最大的蔬菜產(chǎn)銷國(guó)，自2012 年以來，蔬菜種植面積及產(chǎn)量逐年增加，葉菜在蔬菜生產(chǎn)中的種植比例也不斷提高（肖體瓊 等，2017），2016 年全國(guó)蔬菜種植面積為2 232.83 萬hm2，其中葉菜類蔬菜種植面積高達(dá)792.41 萬hm2（廖禺 等，2018）。葉菜的生長(zhǎng)點(diǎn)位于葉尖，易于積累營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從土壤中吸收硝酸鹽的能力強(qiáng)（毛青秀 等，2012；汪瑩 等，2016），故植株內(nèi)硝酸鹽含量顯著高于根菜類、茄果類等其他蔬菜（蓋屏卓 等，2020）。同時(shí)，葉菜生長(zhǎng)周期短，種植者為獲取高產(chǎn)常不均衡地施用氮肥，這是造成硝酸鹽累積的主要外部因素（李殿波 等，2014）。葉用萵苣（Lactuca sativaL.var.ramoseHort.）與菠菜（Spinacia oleraceaL.）為日常生活中常見的葉菜，生產(chǎn)中氮肥施用過量導(dǎo)致其葉片中硝酸鹽積累過量，長(zhǎng)時(shí)間食用或危害人體健康，因此如何在不減產(chǎn)并保持品質(zhì)的條件下減少植株內(nèi)硝酸鹽含量是葉菜生產(chǎn)中亟待解決的難題。

叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizae fungi，AMF）廣泛分布于自然界，能與80%以上的植物形成共生組織——叢枝菌根，宿主為AMF 提供碳源以完成各項(xiàng)生命活動(dòng)，AMF 也改善宿主生理狀態(tài)，促進(jìn)植株生長(zhǎng)、改善宿主品質(zhì)（Harley &Smith，2008）。研究表明，AMF 的根外菌絲可延展到根外近10 cm（張宇亭 等，2012），大大增加植株的營(yíng)養(yǎng)吸收面積。一方面，AMF 可與植株共生分泌出多種酶類（Saia et al.，2014）以及有機(jī)酸（Tawaraya et al.，2006），促進(jìn)土壤中P、N 等礦質(zhì)元素的活化；另一方面，接種AMF 菌劑有助于植株間形成菌絲網(wǎng)絡(luò)與菌絲橋（Whitfield，2007），菌絲巨大的表面積能有效提升植株與土壤的相互作用，促進(jìn)根系活動(dòng)（Balogh-Brunstad et al.，2008）。AMF 會(huì)顯著增加植株對(duì)N、P 等元素的吸收（賀超興 等，2006），菌絲橋可以直接轉(zhuǎn)運(yùn)從土壤中吸收的N 與P，促進(jìn)植株對(duì)銨態(tài)氮與硝態(tài)氮的利用（鄒碧瑩和張?jiān)埔恚?008），將直接吸收的氮素轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主根系，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)氮素營(yíng)養(yǎng)再分配（Govindarajulu et al.，2005）。AMF 能顯著提高菜豆（李敏 等，1999）和生姜（王維華 等，2003）的產(chǎn)量與氮含量，在促進(jìn)植物氮吸收、提升氮含量、改善植株產(chǎn)量等方面發(fā)揮重要作用，在降低葉菜氮肥施用方面具有巨大潛力。

目前生產(chǎn)中常采用商品基質(zhì)栽培葉菜，可快速生產(chǎn)出潔凈、綠色的優(yōu)質(zhì)葉菜產(chǎn)品。為了保證葉菜生長(zhǎng)健壯，商品基質(zhì)中往往含有大量養(yǎng)分，生產(chǎn)中還要根據(jù)植株生長(zhǎng)情況適當(dāng)補(bǔ)充養(yǎng)分，一般追肥時(shí)先將適量氮肥溶解于水中，然后采用水肥一體化施肥機(jī)噴灌或滴灌，但氮肥追施量往往超標(biāo)，不僅造成浪費(fèi)，而且還會(huì)增加葉菜硝酸鹽含量超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)。本試驗(yàn)以葉用萵苣和菠菜為材料，采用穴盤栽培方式，探討AMF 對(duì)葉菜氮肥用量的減施效果，以期為AMF 在葉菜高品質(zhì)栽培中的應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試葉用萵苣（Lactuca sativaL.var.ramoseHort.）品種為綠領(lǐng)四季生菜（南京綠領(lǐng)種業(yè)有限公司生產(chǎn)），菠菜（Spinacia oleraceaL.）品種為圓葉菠菜（山東威爾種子有限公司生產(chǎn)），種子均購(gòu)自市場(chǎng)。供試氮肥為酰胺態(tài)氮肥尿素，純氮含量46.7%。栽培基質(zhì)為商品基質(zhì)產(chǎn)品（江蘇興農(nóng)基質(zhì)科技有限公司生產(chǎn)），pH 7.37，EC 值4.56 mS·cm-1，有效N 含量0.48 mg·g-1、有效P 含量0.26 mg·g-1、有效K含量7.91 mg·g-1。供試AMF菌劑（淮安柴米河農(nóng)業(yè)科技股份有限公司生產(chǎn)）為混合型叢枝真菌，含有Acaulospora morrowiae、Glomus clarum等，孢子密度為45 個(gè)·g-1。栽培容器為15孔塑料穴盤，外圍尺寸540 mm × 280 mm，單穴高度75 mm，上口徑95 mm，下口徑60 mm，單孔容積400 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2019 年2 月至2021 年4 月分別在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牌樓試驗(yàn)基地（東經(jīng)118.86°，北緯32.02°）和人工氣候室開展。

1.2.1 葉用萵苣與菠菜適宜氮肥用量的篩選試驗(yàn) 將葉用萵苣和菠菜種子在溫水中浸泡7～8 h，取出后用濕潤(rùn)紗布包裹，置于22～25 ℃溫度下催芽，待80%以上種子露白后播種至15 孔穴盤，置于塑料大棚內(nèi)育苗。育苗期間晝/夜溫度為25℃/14 ℃，空氣相對(duì)濕度60%～70%，光周期14 h/10 h（晝/夜）。試驗(yàn)設(shè)置8 個(gè)氮肥用量（純氮）處理，每個(gè)處理3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15 株，每種蔬菜播種24 盤。葉用萵苣8 個(gè)氮肥追施量處理如下：4.7（N1）、6.0（N2）、7.3（N3）、8.7（N4）、10.0（N5）、11.3（N6）、12.7（N7）、14.0（N8）kg·hm-2；菠菜8 個(gè)氮肥追施量處理如下：6.0（N1）、8.0（N2）、10.0（N3）、12.0（N4）、14.0（N5）、16.0（N6）、18.0（N7）、20.0（N8）kg·hm-2。待幼苗長(zhǎng)出子葉后，將上述純氮用量的尿素以0.1%～0.3%的比例溶于水，先后隔10 d 分2 次在植株根際隨機(jī)取3 點(diǎn)注入。保持基質(zhì)濕潤(rùn)，定期在植株周圍松土，保持土壤透氣性。播種40 d 后取樣，每個(gè)處理隨機(jī)取樣5株，測(cè)定植株的生長(zhǎng)指標(biāo)、硝酸鹽含量、可溶性糖含量以及VC 含量，采用隸屬函數(shù)法綜合評(píng)估各項(xiàng)指標(biāo)，篩選出葉用萵苣與菠菜長(zhǎng)勢(shì)最優(yōu)時(shí)對(duì)應(yīng)的氮肥追施量。

1.2.2 葉用萵苣與菠菜適宜AMF 用量的篩選試驗(yàn) AMF 菌劑接菌量設(shè)置5 個(gè)處理，分別為100（A1）、125（A2）、150（A3）、175（A4）、200（A5）g·kg-1，以不加AMF 菌劑（A0）為對(duì)照。將AMF菌劑與高溫滅菌基質(zhì)混勻后裝入15 孔穴盤，80%以上種子露白后淺播，每個(gè)處理3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15 株。塑料大棚內(nèi)育苗，育苗期間光周期為14 h/10 h（晝/夜），晝/夜均溫為26 ℃/15 ℃，空氣相對(duì)濕度為60%～75%，每隔2 d 澆灌1 次清水，保持供水充足。播種40 d 后取樣，每個(gè)處理隨機(jī)取樣5 株，測(cè)定植株的生長(zhǎng)指標(biāo)、硝酸鹽含量、可溶性糖含量和VC 含量，采用隸屬函數(shù)法分析篩選出葉用萵苣和菠菜長(zhǎng)勢(shì)最優(yōu)時(shí)對(duì)應(yīng)的AMF 用量。

1.2.3 AMF 對(duì)葉菜氮肥用量的減施效果試驗(yàn) 在基質(zhì)中加入1.2.2 篩選出的適宜AMF 用量，以

1.2.1 篩選出的2 種蔬菜生長(zhǎng)量最大時(shí)對(duì)應(yīng)的氮肥追施量為對(duì)照（C0），分別減少20%（C1）、40%（C2）、60%（C3）、80%（C4）、100%（C5）的氮肥追施量，即葉用萵苣6 個(gè)氮肥處理分別為：C0（6.0 kg·hm-2氮肥）、C1（4.8 kg·hm-2氮肥+200 g·kg-1AMF）、C2（3.6 kg·hm-2氮肥 +200 g·kg-1AMF）、C3（2.4 kg·hm-2氮肥+200 g·kg-1AMF）、C4（1.2 kg·hm-2氮肥+200 g·kg-1AMF）、C5（200 g·kg-1AMF）；菠菜6 個(gè)氮肥處理分別為：C0（8.0 kg·hm-2氮肥）、C1（6.4 kg·hm-2氮肥+175 g·kg-1AMF）、C2（4.8 kg·hm-2氮肥 +175 g·kg-1AMF）、C3（3.2 kg·hm-2氮肥+175 g·kg-1AMF）、C4（1.6 kg·hm-2氮肥+175 g·kg-1AMF）、C5（175 g·kg-1AMF）。每組處理3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15 株。播種后置于人工氣候室，晝/夜溫度25 ℃/15 ℃，光周期14 h/10 h（晝/夜），白天平均光照強(qiáng)度為400 μmol·m-2·s-1。播種35 d后取樣，每個(gè)處理隨機(jī)取樣5 株，測(cè)定全株鮮質(zhì)量。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及測(cè)定方法

1.3.1 生長(zhǎng)指標(biāo) 植株用清水沖洗根部并用吸水紙吸去多余水分，用電子天平測(cè)定全株鮮質(zhì)量，然后裝入信封置于105 ℃烘箱中殺青30 min，將烘箱溫度調(diào)至75 ℃，烘干至恒重后測(cè)定全株干質(zhì)量。

1.3.2 品質(zhì)指標(biāo) 每個(gè)處理隨機(jī)取樣5 株，每株取1～2 片葉片，混合后測(cè)定?？扇苄蕴呛坎捎幂焱壬ǎ≧yckov，1966）測(cè)定，VC 含量采用紫外快速滴定法（李澤鴻 等，2011）測(cè)定，硝酸鹽含量采用水楊酸法（李合生，2000）測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件（IBM SPSS statistics 25，Chinese version）與Microsoft Excel 2007 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Duncan’s 多重比較法進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05），采用Origin 2020作圖。

1.4.2 綜合評(píng)價(jià) 隸屬函數(shù)法可對(duì)多指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)估，消除單一指標(biāo)評(píng)價(jià)的片面性，使供試材料的各項(xiàng)指標(biāo)具有可比性，客觀合理地反映評(píng)估對(duì)象的綜合價(jià)值。隸屬函數(shù)平均值越大說明綜合價(jià)值越高。

與生長(zhǎng)和品質(zhì)呈正相關(guān)的指標(biāo)（如全株鮮質(zhì)量、全株干質(zhì)量、可溶性糖含量、VC 含量等）采用隸屬函數(shù)公式：

與生長(zhǎng)和品質(zhì)呈負(fù)相關(guān)的硝酸鹽含量采用隸屬函數(shù)公式：

其中，Uij是i處理中j指標(biāo)的隸屬函數(shù)值；Xij為第i個(gè)處理的第j個(gè)指標(biāo)測(cè)定值；Xmin與Xmax分別為品種中此指標(biāo)的最小值與最大值；Ui是第i個(gè)處理各項(xiàng)指標(biāo)的平均隸屬函數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮肥對(duì)葉用萵苣和菠菜生長(zhǎng)與品質(zhì)的影響

2.1.1 氮肥追施量對(duì)葉用萵苣和菠菜生長(zhǎng)的影響 如圖1 所示，8 個(gè)不同氮肥用量處理下，隨著氮肥用量的增加，葉用萵苣與菠菜的全株鮮質(zhì)量、全株干質(zhì)量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，其中葉用萵苣在N6（11.3 kg·hm-2）處理下全株鮮質(zhì)量、全株干質(zhì)量均最大，菠菜全株鮮質(zhì)量、全株干質(zhì)量均在N5（14.0 kg·hm-2）處理下最大。

2.1.2 氮肥追施量對(duì)葉用萵苣和菠菜品質(zhì)的影響 如圖2 所示，隨著氮肥用量的增加，葉用萵苣可溶性糖含量持續(xù)降低，而菠菜可溶性糖含量持續(xù)升高；葉用萵苣硝酸鹽含量呈現(xiàn)先減后增的趨勢(shì)，菠菜趨勢(shì)相反，二者分別在N6、N8處理下最低；葉用萵苣與菠菜VC 含量變化趨勢(shì)與硝酸鹽含量的變化趨勢(shì)相似，分別在N1、N2處理下最高。

2.1.3 氮肥追施量對(duì)葉用萵苣和菠菜隸屬函數(shù)值的影響 分別對(duì)葉用萵苣與菠菜全株鮮質(zhì)量、全株干質(zhì)量和品質(zhì)指標(biāo)的隸屬值求平均值，平均值越高則說明綜合價(jià)值越高，平均隸屬函數(shù)值最大的組排序?yàn)?。綜合分析可知（表1、2），在8 個(gè)不同氮肥追施量處理下，葉用萵苣與菠菜隸屬函數(shù)平均值最大的處理均為N2處理。因此，在基質(zhì)栽培條件下，葉用萵苣最佳氮肥追施量為6.0 kg·hm-2，菠菜最佳氮肥追施量為8.0 kg·hm-2。

表1 氮肥追施量對(duì)葉用萵苣隸屬函數(shù)值的影響

表2 氮肥追施量對(duì)菠菜隸屬函數(shù)值的影響

2.2 AMF 用量對(duì)葉用萵苣和菠菜生長(zhǎng)與品質(zhì)的影響

2.2.1 AMF 用量對(duì)葉用萵苣和菠菜生長(zhǎng)的影響 圖3 顯示，隨著AMF 用量的增加，葉用萵苣全株鮮質(zhì)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，而全株干質(zhì)量呈先降低后升高的趨勢(shì)；菠菜全株鮮質(zhì)量與全株干質(zhì)量均呈先升高后略微降低趨勢(shì)。其中，葉用萵苣全株鮮質(zhì)量在A3處理下最高，全株干質(zhì)量在A5處理下最高；菠菜全株鮮質(zhì)量與全株干質(zhì)量分別在A4和A2處理下最高。

2.2.2 AMF 用量對(duì)葉用萵苣和菠菜品質(zhì)的影響 由圖4 可以看出，隨著AMF 用量的增加，葉用萵苣可溶性糖含量呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢(shì)，菠菜則呈現(xiàn)持續(xù)升高趨勢(shì)，二者分別在A4、A3處理下最高；葉用萵苣的硝酸鹽含量先減后增，而菠菜硝酸鹽含量呈現(xiàn)持續(xù)降低趨勢(shì)，二者均在A3處理時(shí)最低；葉用萵苣VC 含量先降低后升高，而菠菜VC 含量呈先升高后降低趨勢(shì)，分別在A5、A4處理下達(dá)到最大值。

2.2.3 AMF 用量對(duì)葉用萵苣和菠菜隸屬函數(shù)值的影響 表3、表4 數(shù)據(jù)表明，當(dāng)AMF 菌劑接菌量為200 g·kg-1（A5 處理）時(shí)，葉用萵苣的隸屬函數(shù)值平均值最大；當(dāng)AMF 菌劑接菌量為175 g·kg-1（A4 處理）時(shí)，菠菜的隸屬函數(shù)值平均值最大。

表3 AMF 用量對(duì)葉用萵苣隸屬函數(shù)值的影響

2.3 AMF 對(duì)葉用萵苣和菠菜氮肥用量的減施效果

如圖5 所示，隨著AMF 替代氮肥比例的增加，葉用萵苣和菠菜的全株鮮質(zhì)量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)減施40%氮肥時(shí)葉用萵苣全株鮮質(zhì)量最大，且與對(duì)照差異顯著；減施60%氮肥時(shí)菠菜全株鮮質(zhì)量最大，并且顯著高于對(duì)照。說明在基質(zhì)栽培條件下，AMF 可替代葉用萵苣40%的氮肥用量（減施方案為3.6 kg·hm-2氮肥+200 g·kg-1AMF），可替代菠菜60%的氮肥用量（減施方案為3.2 kg·hm-2氮肥+175 g·kg-1AMF）。也就是說，AMF 可減施葉用萵苣40%、菠菜60%的氮肥施用量。

3 討論與結(jié)論

氮素是植物的必需營(yíng)養(yǎng)元素，影響植株體內(nèi)各生理生化反應(yīng)，在干物質(zhì)積累、產(chǎn)量提升等方面發(fā)揮不可替代的作用。在一定范圍內(nèi)，作物產(chǎn)量與品質(zhì)均隨氮用量的增加而提升，適宜的氮肥用量可促進(jìn)植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)，塑造高效的葉片結(jié)構(gòu)（呂麗華等，2008），提升植株光合效能，進(jìn)而促進(jìn)植株的干物質(zhì)積累、營(yíng)養(yǎng)吸收以及產(chǎn)量提升。當(dāng)?shù)适┯眠^量時(shí)，氮素利用率下降（張偉 等，2016），根系吸水能力降低，氣孔關(guān)閉，葉綠素含量減少（李靜等，2016），光合作用減弱，植株生長(zhǎng)受到抑制。同時(shí)，土壤中未被利用的氮素還會(huì)造成土壤酸化與水體富營(yíng)養(yǎng)化。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著氮肥追施量的增加，葉用萵苣與菠菜的全株鮮質(zhì)量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，與前人研究結(jié)論（孔德工 等，1999；孫治強(qiáng) 等，2007；劉舒婭 等，2015）基本一致。目前研究發(fā)現(xiàn)，可以采用科學(xué)的環(huán)境調(diào)控措施和優(yōu)化的施肥模式等農(nóng)藝措施（郭麗娜 等，2005；孫治強(qiáng) 等，2005；黃東風(fēng) 等，2009）、有機(jī)無機(jī)肥配施（廉華 等，2006；盧樹昌 等，2015；王煌平 等，2016）、新型肥料或發(fā)酵物配施（史雅娟 等，2002；張百俊 等，2009）等手段減少氮肥施用量，在不降低產(chǎn)量的情況下提升作物品質(zhì)。

AMF 是一類常見真菌，在控制氮肥用量方面有較大潛力，目前已有研究表明AMF 能顯著增加生菜（馮希環(huán) 等，2016）、黃瓜（任志雨 等，2008）、胡蘿卜（Affokpon et al.，2011）等蔬菜的生物量。本試驗(yàn)采用基質(zhì)栽培，通過添加5 種不同用量的AMF 菌劑發(fā)現(xiàn)，適量的AMF 菌劑對(duì)葉用萵苣與菠菜的生長(zhǎng)與品質(zhì)均有提升作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，AMF 可促進(jìn)宿主營(yíng)養(yǎng)吸收（李敏和劉潤(rùn)進(jìn)，2000）與光合作用（賀忠群 等，2008），改善宿主碳源狀況，增加干物質(zhì)積累。接種AMF 后的洋蔥根系中谷氨酰合成酶（GS）和硝酸還原酶（NR）活性均有提升（Azcón &Tobar，1998），說明AMF可通過調(diào)節(jié)酶活性提高氮同化。AMF 還能夠通過改變植株內(nèi)源激素水平調(diào)節(jié)植株代謝（Susan &Denis，2000），進(jìn)而對(duì)植株生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響?？梢?，AMF 在促進(jìn)氮素吸收與生物量累積方面具有巨大潛力，能為氮肥減施提供新的可能性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，基質(zhì)栽培條件下，在不降低葉用萵苣和菠菜全株鮮質(zhì)量的前提下，基質(zhì)中分別添加200 g·kg-1和175 g·kg-1AMF 可減少葉用萵苣40%和菠菜60%的氮肥用量，即葉用萵苣氮肥減施方案為3.6 kg·hm-2氮肥+200 g·kg-1AMF，菠菜氮肥減施方案為3.2 kg·hm-2氮肥+175 g·kg-1AMF 時(shí)，植株生長(zhǎng)不受影響，證實(shí)了AMF 具有減施葉用萵苣和菠菜氮肥施用量的潛力，為葉用萵苣和菠菜高品質(zhì)栽培提供了新途徑。