江蘇省首例人感染H9N2禽流感病毒分子溯源研究

鄧 斐，祁 賢，余慧燕，王慎驕，許 可，黃昊頔，鮑倡俊

0 引 言

甲型流感病毒屬于正粘病毒科，能夠感染人、禽和多種哺乳動(dòng)物。血凝素(hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)是甲型流感病毒血清分型的靶標(biāo)蛋白，目前已經(jīng)在雁形目和鸻形目等野生水禽中發(fā)現(xiàn)了16種HA亞型和9種NA亞型，此外，在蝙蝠中發(fā)現(xiàn)了兩種新的H17N10和H18N11亞型[1-4]。1966年首次在北美發(fā)現(xiàn)H9N2亞型禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)，目前已呈全球流行[5-6]。1994年在我國(guó)廣東暴發(fā)疫病的家禽中分離到多株H9N2 AIV[7]，之后數(shù)年間該病毒傳播到全國(guó)大部分地區(qū)，成為中國(guó)家禽中一個(gè)重要的禽流感病毒流行亞型[6-8]。

自1998年以來(lái)，不斷報(bào)道人感染H9N2禽流感病毒的病例。目前，與H5Ny(y=1、6) 和H7Ny(y=2、3、7、9)一起，H9N2禽流感病毒成為危害動(dòng)物和人類健康的重要病原體，對(duì)公共衛(wèi)生的負(fù)面影響不容忽視[9-10]。本研究將對(duì)江蘇省首例人感染H9N2禽流感病例進(jìn)行分子溯源研究。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取2019年3月18日江蘇省疾病預(yù)防控制中心1份禽流感病毒感染患者(男，9歲)的咽拭子標(biāo)本及從患者住處附近的農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采集禽類和外環(huán)境樣本共40份。采集患者咽拭子進(jìn)行核酸檢測(cè)和病毒分離。

1.2主要試劑和儀器流感病毒核酸分型檢測(cè)試劑盒購(gòu)于江蘇碩士生物技術(shù)有限公司；QIAamp Viral RNA kit、QIAGEN購(gòu)于公司；SuperScript? III First-Strand Synthesis System和 High Pure PCR Product Purification Kit購(gòu)于 Invitrogen公司；Nextera XT DNA Sample Preparation Kit購(gòu)于Illumina公司；Illumina MiSeq platform購(gòu)于Illumina公司；熒光定量PCR儀VIIA7型購(gòu)于ABI公司。

1.3流感病毒核酸分型檢測(cè)采用熒光定量PCR法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行流感病毒核酸分型檢測(cè)，包括A型、B型、H1-H16、N1-N9。

1.4病毒分離和鑒定將患者咽拭子、環(huán)境和禽類標(biāo)本接種9-11日齡的無(wú)特定病原體(specific pathogen-free，SPF)雞胚，接種部分是尿囊腔，37 ℃條件下培養(yǎng)72 h。采用血凝試驗(yàn)測(cè)定病毒分離物的血凝特性，用0.9%等滲鹽水配制1%雞紅細(xì)胞，病毒分離物進(jìn)行2倍系列稀釋，在V型血凝板上進(jìn)行混合后，室溫孵育20～30 min后觀察結(jié)果。病毒分離在江蘇省疾病控制中心生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室里完成。

1.5病毒基因組測(cè)序根據(jù)核酸提取試劑盒操作說(shuō)明對(duì)病毒RNA進(jìn)行提取。以病毒RNA為模板擴(kuò)增cDNA，反轉(zhuǎn)錄引物采用通用引物U12(5′-AGCAAAAGCAGG-3′)[12]，反應(yīng)體系采用單鏈合成試劑盒。測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建采用 Illumina公司的試劑盒。把800 μL測(cè)序文庫(kù)混合樣，加到測(cè)序平臺(tái)的樣品孔中，按照說(shuō)明書(shū)完成基因測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)處理分析采用CLC Genomics workbench (CLC Bio)程序軟件。

1.6進(jìn)化分析在GeneBank和GISAID公網(wǎng)上通過(guò)BLASTn程序初步分析分離毒株的亞型和8個(gè)基因片段核苷酸最大相似的參考株。采用MAFFT軟件進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列比對(duì)。進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建采用maximum likelihood 法(MEGA6.1，美國(guó))。

2 結(jié) 果

2.1 熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果流感病毒A型-M、H9-HA和N2-NA基因核酸陽(yáng)性，而B(niǎo)型-M、H1-HA、H3-HA、H5-HA、H7-HA、N1-NA和N3 ～N9-NA基因核酸檢測(cè)陰性，初步判定標(biāo)本中的病毒為A型H9N2亞型流感病毒，見(jiàn)圖1。從40份外環(huán)境樣本中檢出H9N2核酸陽(yáng)性26份(65%)。

a:A型、B型、H9、H5、H7亞型檢測(cè)；b:H9N2亞型檢測(cè)

2.2病毒分離與鑒定患者標(biāo)本和陽(yáng)性環(huán)境標(biāo)本接種SPF雞胚，分離到1株人源病毒和8株環(huán)境來(lái)源病毒,活禽市場(chǎng)的雞鴨標(biāo)本中無(wú)病毒。9株病毒具有較高的血凝活性(HA價(jià)>1024)，核酸檢測(cè)均為A型H9N2流感病毒陽(yáng)性。

2.3基因組測(cè)序和進(jìn)化樹(shù)分析對(duì)1株人分離株和3份環(huán)境分離株進(jìn)行全基因組測(cè)序，序列上傳GASAID數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得的序列號(hào)分別為：A/Jiangsu/1/2018(JS1) EPI1607417、EPI1607419、EPI1607422- EPI1607427；A/Environment/Taizhou/02/2019( EV/TZ02)EPI1607446- EPI1607453；A/Environment/Taizhou/03/2019(EV/TZ03)EPI1607454 -EPI1607461和A/Environment/Taizhou/10/2019 (EV/TZ10) EPI1607438- EPI1607445。序列比較結(jié)果顯示，4株病毒基因組核苷酸序列相似度為99.8%～100%。4株H9N2流感病毒的6個(gè)基因片段(包括HA、NA、PB2、PB1、NP、NS)與近年來(lái)中國(guó)南方流行的H9N2病毒序列相似度最高(98%～99%)，而PA和M基因片段與H7N9病毒的相應(yīng)基因同源性最高(99%)。以人分離株JS1為例，HA基因與參考株A/chicken/Shanghai/11/2018 (H9N2)核苷酸相似度最高(99%)，NA基因與參考株A/chicken/Shanghai/05/2018 (H9N2) 的序列相似度高達(dá)99%，其他6個(gè)內(nèi)部基因(PB2、PB1、PA、NP、M和NS)與中國(guó)南方H9N2或H7N9病毒相應(yīng)基因片段的核酸相似度高達(dá)98%～99%，見(jiàn)表1。

表1 A/Jiangsu/1/2018(H9N2) 8基因片段與NCBI和GISAID 流感數(shù)據(jù)庫(kù)核苷酸相似度最大的參考株

HA基因進(jìn)化樹(shù)上， 4株病毒位于歐亞系Y280-like進(jìn)化樹(shù)上，屬于Y280-like世系，見(jiàn)圖1。與HA基因相似，NA基因進(jìn)化樹(shù)上,4株病毒的NA基因?qū)儆赮280世系，見(jiàn)圖2。HA和NA進(jìn)化樹(shù)顯示,人分離株和3株環(huán)境分離病毒同處于一個(gè)小的進(jìn)化分支，遺傳關(guān)系較近，表明它們有共同的起源。

圖2 H9N2病毒HA基因進(jìn)化樹(shù)

圖3 H9N2病毒NA基因進(jìn)化樹(shù)

2.4分離株的分子特征4株病毒HA蛋白除了228位氨基酸仍是G，其他4個(gè)位點(diǎn)都發(fā)生了突變，增強(qiáng)了病毒對(duì)人類SAα2-6Gal受體的結(jié)合力，見(jiàn)表2。NA蛋白274 (H→Y)位點(diǎn)未發(fā)生突變,表明病毒保留對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑(如奧司他韋)的敏感性。此外，4株病毒的PB2蛋白E627位氨基酸沒(méi)有突變，表明病毒對(duì)人體的適應(yīng)力和致病力都有一定的局限性。

表2 4株H9N2病毒關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析

3 討 論

自1990年代，H9N2已逐漸成為歐亞和北非地區(qū)許多國(guó)家家禽中流行的一種主要禽流感病毒亞型[6]。H9N2病毒可以感染多種家禽，發(fā)病率高但致死率較低，主要引起雞的產(chǎn)蛋下降，嚴(yán)重制約養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。此外，H9N2病毒為其他危害動(dòng)物健康和公共衛(wèi)生的禽流感病毒(包括H5N1、H5N6、H7N9等)提供內(nèi)部基因，為不同亞型流感病毒的重配進(jìn)化提供了豐富的基因池[15-17]。自1998年以來(lái)，已經(jīng)報(bào)道了多起人感染H9N2禽流感病例[18-19]。血清學(xué)研究表明一般人群的抗體陽(yáng)性率約1.3%，在職業(yè)人群中高達(dá)5%抗體陽(yáng)性率[20-22]。本研究從患者附近農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)環(huán)境中檢測(cè)和分離8株病毒，經(jīng)基因序列分子進(jìn)化分析，與患者體內(nèi)病毒核苷酸高度同源，結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查，初步判斷這起事件是由禽流感病毒跨物種感染人所致，這也是江蘇省首例人感染H9N2禽流感病例。

在禽流感跳躍種屬差異感染人的過(guò)程中，HA蛋白的分子進(jìn)化最受關(guān)注[22-23]。本研究中，感染人的H9N2人分離株和3株環(huán)境分離株的HA蛋白的裂解位點(diǎn)沒(méi)有插入多個(gè)堿性氨基酸，表明病毒沒(méi)有突變?yōu)楦咧虏⌒郧萘鞲胁《?。HA針對(duì)兩種不同唾液酸受體結(jié)合能力的改變是流感病毒跨種傳播的關(guān)鍵，本研究中，4株H9N2分離病毒的HA蛋白受體結(jié)合部位有4個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)(包括I155T, H183N,A190T/V和Q226L)發(fā)生突變，表明這些病毒對(duì)人類SAα2-6Gal受體的親和力增加，跨種傳播感染人的能力在增強(qiáng)，病毒未來(lái)的進(jìn)化值得關(guān)注。

與人感染H5N1(病死率52.8%)、H5N6(65%)和H7N9(病死率39.2%)相比[9-10,25]，人感染H9N2病毒雖然癥狀較輕，病死率較低，但對(duì)人類健康和公共衛(wèi)生造成重大威脅不容忽視。H9N2病毒在禽類中普通存在，地理分布范圍廣，雖然有禽用疫苗在應(yīng)用，但病毒進(jìn)化活躍，根除難度大[26-27]。在歐亞家禽中的3個(gè)H9亞型HA進(jìn)化世系中，Y280-like是占優(yōu)勢(shì)的世系。研究表明，1994-2013年間，在中國(guó)家禽中發(fā)現(xiàn)了117種基因型，基因型多樣性源于H9N2病毒內(nèi)部基因重配異常活躍[27-28]。從2013年開(kāi)始，G57基因型逐漸成為優(yōu)勢(shì)流行基因型。同時(shí)，G57基因型H9N2病毒為其他亞型流感病毒提供內(nèi)部基因，包括H7N9、H5N6和H10N8等[29]。值得關(guān)注的是，H9N2病毒內(nèi)部基因與其它流感病毒重配能力強(qiáng)，為人類未來(lái)流感大流行毒株的產(chǎn)生提供了可能的基因來(lái)源,特別是有與人類流感病毒H3N2和H1N1有發(fā)生重配的可能[30]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)人感染H9N2禽流感病例，進(jìn)一步顯示該病毒的重大公共衛(wèi)生意義[31-32]，需要繼續(xù)加強(qiáng)對(duì)禽流感病毒(包括H5、H9、H7和其它亞型)在人群、豬群、家禽、野禽和環(huán)境中生態(tài)監(jiān)測(cè)，在流行病學(xué)和分子生物學(xué)水平密切關(guān)注病毒的演化，特別是跨種傳播能力的改變。