URI基因沉默對乳腺癌細(xì)胞自噬與凋亡的影響

戴萬輝, 謝勁松

0 引 言

乳腺癌是女性最常見的一種惡性腫瘤，我國每年約有4萬女性死于乳腺癌[1]。近幾年，乳腺癌的發(fā)病率呈直線上升趨勢，甚至在大城市已經(jīng)占據(jù)女性惡性腫瘤發(fā)病率的首位，成為女性健康的頭號殺手[2]。因此，探究乳腺癌的發(fā)病機制和治療手段已經(jīng)成為近幾年的研究熱點。

URI是RNA 聚合酶II(RNA polymerase II)第5亞基RPB5 的調(diào)節(jié)蛋白，通過與RPB5 特異性的結(jié)合來調(diào)節(jié)RNA聚合酶II的活性[3]。有研究表明，URI在多種腫瘤組織中高表達，在基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡、基因組穩(wěn)定以及腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用[4]。有文獻表明，在肝癌和卵巢癌中URI可以促進腫瘤細(xì)胞增殖，抑制腫瘤凋亡，促進肝癌和卵巢癌的發(fā)生發(fā)展，因此在肝癌和卵巢癌中URI被定義為癌基因[5]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個受多種因素作用和調(diào)控的過程，而自噬和凋亡在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[6]。自噬是一個高度保守的自我消化過程[7]。在正常生理情況下，自噬有利于細(xì)胞維持自身穩(wěn)態(tài)，抑制其癌變[8]；而腫瘤一旦形成，自噬降解生成的小分子物質(zhì)可以為癌細(xì)胞提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，促進腫瘤的發(fā)展[9]。凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、消退等也存在密切的關(guān)系，腫瘤的發(fā)生是由于細(xì)胞增殖和凋亡失調(diào)所引起[10]。因此，為了探究URI基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞自噬和凋亡的影響，本研究構(gòu)建了URI干擾RNA，通過下調(diào)乳腺癌細(xì)胞內(nèi)URI基因的表達，探討URI基因沉默對乳腺癌細(xì)胞自噬和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和MDA-MB-231購自中科院上海細(xì)胞庫，細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM(高糖)和L-15購于南京福麥斯生物技術(shù)有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)所用青霉素-鏈霉素、胰蛋白酶購于上海碧云天生物科技有限公司，胎牛血清(FBS)購于美國Biological Industries(BI)公司，siRNA由上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司合成；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒均購自美國Promega公司，PCR引物由金唯智生物科技有限公司合成，SDS凝膠配制試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司，Page Ruler Protein Ladder、RIPA細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑購于Thermo Fisher Scientific公司，PVDF膜購于Millipore；URI、Bcl-2抗體和Bax抗體購于Santa Cruz公司，P62抗體購于abcam公司，LC3A/B、GAPDH抗體和Caspase-3抗體購于Cell Singaling Technology公司，熒光顯微鏡購于德國徠卡有限公司，激光共聚焦顯微鏡購于日本OLYMPUS公司，ABI 7500熒光定量PCR儀購于美國ABI公司，蛋白電泳儀器購于美國伯樂公司。

1.2方法

1.2.1 siURI的設(shè)計及合成按照NCBI基因數(shù)據(jù)庫中URI的cDNA序列(GenBank No.: NM_134447),設(shè)計3對針對URI基因的siRNA，序列分別為：5′-GGUAGAUAAUGACUAUAAUTT-3′(siRNA-1)，5′-AGAGGGUUUCAAAGUUUAATT-3′(siRNA-2),5′-GGAUUUGCUAGCUGAUAAATT-3′(siRNA-3)。同時，合成陰性對照FAM-NC-siRNA。以上寡核苷酸鏈均由上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司合成。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與傳代乳腺癌細(xì)胞株MCF-7使用含10% FBS、1%抗生素(青霉素-鏈霉素)的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。乳腺癌細(xì)胞株MDA-MA-231使用含10% FBS、1%抗生素(青霉素-鏈霉素)的L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)。將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中，細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時進行常規(guī)換液、消化傳代。

1.2.3URI siRNA轉(zhuǎn)染濃度的篩選與實驗分組MCF-7細(xì)胞生長至70%左右的融合度時進行轉(zhuǎn)染。分別將不同濃度(10、20、50、100 nmol/L)FAM熒光標(biāo)記的siRNA(0.4、0.8、2、4 μL)和P3000(siRNA∶P3000=1∶2)加入500 μL的DMEM形成試劑A，將Lipo3000(siRNA∶Lipo3000=1∶3)加入500 μL的DMEM形成試劑B，靜置5 min后將試劑A和試劑B混合孵育20 min，分別加入到6孔板的各個對應(yīng)的孔中，轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)30 h后在熒光顯微鏡下觀察各個濃度的綠色熒光信號，選定siRNA的最佳轉(zhuǎn)染濃度。將siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3按上述方法配制成1 mL AB混合液后加入到已經(jīng)接種好MCF-7細(xì)胞的6孔板中，轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)42 h后提取蛋白，通過Western blot法檢測URI的蛋白表達量來確定干擾效果，選取有效的siRNA干擾序列。實驗分組：空白對照組(不添加任何轉(zhuǎn)染試劑)、NC-siRNA組(陰性對照FAM-NC-siRNA)、siRNA-URI組(URI基因沉默)。

1.2.4RNA的提取與RT-PCR檢測自噬和凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄嚴(yán)格按照RNA提取試劑盒操作步驟提取MCF-7細(xì)胞總RNA。用20 μL逆轉(zhuǎn)錄體系合成cDNA，加入模板RNA 2 μg。逆轉(zhuǎn)錄后取1 μL模板進行RT-PCR，PCR體系為20 μL。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系如下：SYBR Green Master Mix 10 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，DEPC水 8 μL，總反應(yīng)體系為20 μL。95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，設(shè)定40個循環(huán)。所有樣本均3個重復(fù)，最后通過2-△△Ct方法對數(shù)據(jù)進行處理分析。應(yīng)用DNAMAN軟件設(shè)計引物，引物序列見表1。

1.2.5Western blot檢測自噬及凋亡相關(guān)蛋白將乳腺癌細(xì)胞加入蛋白裂解液進行裂解，然后用BCA試劑盒測定蛋白濃度，并將蛋白濃度調(diào)整為相同水平。將裂解后離心得到的蛋白上清液加入適量上樣緩沖液，高溫變性后加入到SDS-PAGE中進行電泳，濃縮膠電壓80 V,分離膠電壓100 V。用PVDF膜恒流350 mA轉(zhuǎn)膜1 h，脫脂牛奶封閉2 h后加入LC3A/B、P62、Caspase-3或GAPDH兔抗人單克隆一抗，Bcl-2、Bax或URI鼠抗人單克隆一抗。其中LC3A/B工作濃度為1∶2000，P62為1∶5000，Caspase-3為1∶1000，GAPDH為1∶3000，Bcl-2為1∶2000，Bax為1∶1000，URI為1∶800。然后4 ℃孵育過夜，TBST洗脫3次，每次5 min，然后用羊抗兔和羊抗鼠熒光二抗，工作濃度為1∶10 000，室溫孵育2 h后TBST再次洗脫3次，每次5 min，Odyssey掃描成像儀進行掃描成像。

1.2.6激光共聚焦顯微鏡檢測自噬小體MCF-7細(xì)胞共轉(zhuǎn)染GFP-LC3和siRNA-URI或共轉(zhuǎn)染GFP-LC3和NC-siRNA，36 h后HCQ處理12 h。之后用預(yù)冷的PBS洗3次后再用4%的多聚甲醛進行固定。然后用0.5% Triton X-100通透15 min，山羊血清孵育1 h，DAPI染細(xì)胞核5 min，最后激光共聚焦顯微鏡成像。

1.2.7流式檢測細(xì)胞凋亡用不含EDTA的胰蛋白酶消化，收集總細(xì)胞，PBS洗滌2次后加入結(jié)合緩沖液500μL使細(xì)胞重懸，再加入AnnexinV-FITC 5 μL，PI 5 μL，室溫避光孵育15 min后采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

2 結(jié) 果

2.1 URI siRNA最佳轉(zhuǎn)染濃度的篩選10 nmol/L的siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞在36 h后可見微弱的綠色熒光。隨著轉(zhuǎn)染濃度的增加，熒光亮度逐漸增強，帶有綠色熒光的MCF-7細(xì)胞逐漸增多，其中以50 nmol/L最為顯著。因此，將50 nmol/L作為后續(xù)siRNA的轉(zhuǎn)染濃度。見圖1。

2.2URI有效干擾序列的篩選siRNA-3干擾MCF-7細(xì)胞后URI蛋白表達顯著下降，siRNA-2干擾MCF-7細(xì)胞后URI蛋白表達輕微的下降，而NC-siRNA、siRNA-1中URI蛋白的表達則無明顯變化。因此，進一步的試驗將選用siRNA-3序列作為URI基因的干擾序列，即siRNA-URI組。見圖2。

2.3URI基因沉默對自噬相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響siRNA-URI組自噬相關(guān)基因LC3、Beclin1及ATG12的mRNA表達水平明顯低于NC-siRNA組(P<0.05)；siRNA-URI組P62的mRNA表達水平明顯高于NC-siRNA組(P<0.05)，見表2。結(jié)果表明，URI干擾后，MCF-7細(xì)胞的自噬水平減弱。見圖3。

表2 RT-PCR檢測各組自噬相關(guān)基因mRNA相對值比較

2.4URI基因沉默對自噬相關(guān)蛋白表達的影響在MCF-7細(xì)胞中，LC3和P62蛋白的表達水平與基因轉(zhuǎn)錄的趨勢一致，siRNA-URI組LC3-II蛋白表達量較NC-siRNA組顯著降低，P62蛋白表達量顯著升高。在MDA-MB-231細(xì)胞中，siRNA-URI組LC3-II蛋白表達量較NC-siRNA組顯著降低，P62蛋白表達量顯著升高，與MCF-7細(xì)胞中LC3-II和P62蛋白的表達水平的趨勢一致。結(jié)果表明，URI干擾后可以抑制乳腺癌細(xì)胞中的自噬通量。見圖3。

a:MCF-7; b:MDA-MB-231

2.5URI基因沉默對自噬小體的影響siRNA-URI組較NC-siRNA組LC3陽性點狀綠色熒光信號顯著減弱，自噬小體數(shù)量明顯減少，細(xì)胞內(nèi)自噬水平明顯降低。結(jié)果表明，URI干擾后可以降低MCF-7細(xì)胞內(nèi)自噬小體的數(shù)量。見圖4。

圖4 URI干擾后細(xì)胞內(nèi)自噬小體圖

2.6URI基因沉默對凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響siRNA-URI組抗凋亡基因Bcl-2的mRNA表達水平明顯低于NC-siRNA組(P<0.01)；促凋亡基因Bax、Caspase-3的mRNA表達水平明顯高于NC-siRNA組(P<0.01)。結(jié)果表明，URI干擾后可促進MCF-7細(xì)胞內(nèi)促凋亡基因轉(zhuǎn)錄水平的表達，抑制抗凋亡基因轉(zhuǎn)錄水平的表達。見表3。

表3 RT-PCR檢測各組凋亡相關(guān)基因mRNA相對值比較

2.7URI基因沉默對細(xì)胞凋亡的影響在MCF-7細(xì)胞中，未用H2O2誘導(dǎo)凋亡發(fā)生時，siRNA-URI組的細(xì)胞凋亡率(11.67%)與NC-siRNA組(9.02%)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；用250 μmol/L H2O2作用于細(xì)胞24h誘導(dǎo)凋亡發(fā)生時，siRNA-URI組的細(xì)胞凋亡率(48.29%)較NC-siRNA組(18.01%)顯著增高(P<0.05)。在MDA-MB-231細(xì)胞中，未用H2O2誘導(dǎo)凋亡發(fā)生時，siRNA-URI組的細(xì)胞凋亡率(9.61%)與NC-siRNA組(7.05%)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；用H2O2誘導(dǎo)凋亡發(fā)生時，siRNA-URI組的細(xì)胞凋亡率(26.91%)較NC-siRNA組(18.48%)顯著增高(P<0.05)。結(jié)果表明，URI干擾后可促進乳腺癌細(xì)胞的凋亡。見圖5。

a:MCF-7; b:MDA-MB-231

2.8URI基因沉默對細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響在未用H2O2誘導(dǎo)凋亡發(fā)生時，siRNA-URI組Bcl-2蛋白表達量較NC-siRNA組明顯降低，而Bax和 Caspase-3蛋白表達量明顯升高；siRNA-URI組與NC-siRNA組幾乎不表達Cleaved Caspase-3蛋白。用250 μmol/L H2O2作用于細(xì)胞24 h誘導(dǎo)凋亡發(fā)生時，siRNA-URI組Bcl-2蛋白表達量較NC-siRNA組顯著降低，Bax和Caspase-3蛋白表達量顯著升高；2組均表達了Cleaved Caspase-3蛋白，并且siRNA-URI組與NC-siRNA組相比，Cleaved Caspase-3蛋白表達量顯著升高。結(jié)果表明，URI干擾后可以促進促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，即URI干擾后可以促進乳腺癌細(xì)胞的凋亡。見圖6。

圖6 URI干擾后凋亡相關(guān)蛋白表達圖

3 討 論

自噬和凋亡是兩種截然不同的程序性細(xì)胞死亡方式，是維持細(xì)胞自我平衡的重要機制，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要作用[11]。有研究表明，URI可以促進肝癌細(xì)胞增殖和DNA損傷修復(fù)，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起促進作用[12]。本研究通過siRNA將URI基因沉默，對乳腺癌細(xì)胞中的自噬和凋亡進行了研究。

本研究中，先以不同濃度的siRNA轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細(xì)胞，利用免疫熒光檢測了36 h后的熒光強度，從而確定了最佳轉(zhuǎn)染濃度50 nmol/L。然后以50nmol/L為轉(zhuǎn)染濃度將3種siRNA和NC-siRNA分別對MCF-7細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染，利用Western blot檢測了URI蛋白的表達量，從而確定了URI最佳干擾序列siRNA-3。因此，在接下來對乳腺癌細(xì)胞自噬和凋亡的研究中將siRNA-3作為了干擾URI基因的序列。

自噬是進化過程中高度保守又廣泛存在的一種依賴于溶酶體清除并回收折疊錯誤、受損的蛋白質(zhì)或細(xì)胞器的一種機制[13]。在自噬發(fā)生的整個過程中會涉及到多個自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein1 light chain 3，LC3)在細(xì)胞自噬中被認(rèn)為是自噬小體的標(biāo)志分子，存在兩種形式LC3-I和LC3-II[14]。在共價連接酶ATG3的作用下LC3由可溶性的LC3-I轉(zhuǎn)變?yōu)橹苄缘腖C3-II，而LC3-II能夠與形成的自噬小體膜相結(jié)合[15]。因此，LC3-II含量與自噬小體數(shù)量成正比，可通過檢測LC3-II蛋白表達量的變化來判斷自噬是被誘導(dǎo)還是被抑制[16]。自噬相關(guān)基因12(autophagy-related genes 12，ATG12)是自噬通路上的關(guān)鍵因子，可以與ATG5共價連接并與ATG16L1形成前自噬小體結(jié)構(gòu)，當(dāng)自噬增強時其表達會顯著升高[17]。P62是一種泛素結(jié)合蛋白，參與泛素蛋白酶系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system，UPS)和自噬-溶酶體系統(tǒng)兩種蛋白降解過程[18]。當(dāng)自噬發(fā)生時，P62可與定位于自噬小體膜上的LC3-II蛋白結(jié)合形成復(fù)合物后在自噬溶酶體中降解[19]。因此自噬發(fā)生時，P62水平會顯著下降[20]。Beclin1是自噬小體形成過程中的一個必需分子，能夠介導(dǎo)其他自噬相關(guān)蛋白(autophagy-related genes，ATG)定位于吞噬泡(phagophore)，從而調(diào)控自噬小體的形成與成熟[21]。因此在自噬過程中，Beclin1的表達水平往往會上升[22]。在本研究中，siRNA技術(shù)干擾MCF-7細(xì)胞中URI的表達后，RT-PCR檢測到自噬相關(guān)基因LC3、Beclin1和ATG12轉(zhuǎn)錄水平的降低以及P62轉(zhuǎn)錄水平的升高，證明了URI基因沉默能調(diào)控MCF-7細(xì)胞中自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。為了從蛋白水平了解URI基因沉默對乳腺癌細(xì)胞自噬的抑制作用，采用了Western blot方法檢測了MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞中自噬蛋白LC3-II和P62的表達。研究發(fā)現(xiàn)，URI基因沉默后MCF-7細(xì)胞中自噬蛋白LC3-II表達明顯下降，P62表達顯著升高，與基因轉(zhuǎn)錄的趨勢一致。其中，自噬抑制劑HCQ可以阻斷自噬體和溶酶體的融合，使得自噬體的降解被抑制而導(dǎo)致LC3-II的積累，常被用作檢測細(xì)胞自噬通量的藥物。而MDA-MB-231細(xì)胞中自噬蛋白LC3-II表達也呈現(xiàn)顯著下降的趨勢,P62也呈現(xiàn)顯著升高的趨勢，與MCF-7細(xì)胞中LC3-II和P62蛋白表達水平的趨勢一致。因此，證明了URI基因沉默可以抑制乳腺癌細(xì)胞的自噬水平。為了能夠更直觀地了解URI基因沉默對MCF-7細(xì)胞中自噬小體數(shù)量的影響，采用激光共聚焦顯微鏡檢測了URI基因沉默后MCF-7細(xì)胞中GFP-LC3綠色熒光斑點的數(shù)量。GFP-LC3單熒光質(zhì)粒是利用GFP(Green Fluorescent Protein，綠色熒光蛋白)標(biāo)記LC3。無自噬發(fā)生時，GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中，而自噬形成時，GFP-LC3融合蛋白會轉(zhuǎn)位至自噬體膜上，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)多個明亮的綠色熒光斑點，一個斑點即代表于一個自噬小體[23-24]。研究表明，URI基因沉默后MCF-7細(xì)胞中自噬小體數(shù)量明顯減少。上述結(jié)果均證實了URI基因沉默可以抑制乳腺癌細(xì)胞的自噬。

凋亡是指生物體內(nèi)細(xì)胞在特定的內(nèi)源和外源信號誘導(dǎo)下，其死亡途徑被激活，并在相關(guān)基因的調(diào)控下發(fā)生的程序性死亡過程[25]。Bcl-2和Bax是原癌基因Bcl-2家族中的重要成員，兩者作用完全相反[26]。其中，Bcl-2對多種因素引起的細(xì)胞凋亡有明顯抑制作用，而Bax則具有促進細(xì)胞凋亡的作用[27]。Bcl-2和Bax形成異源二聚體調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性，兩者之間的比例決定了細(xì)胞的生存或死亡[28]。Caspase-3在凋亡級聯(lián)反應(yīng)的下游發(fā)揮作用，可以通過降解細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)底物誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[29]。本研究用RT-PCR檢測了URI基因沉默后凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax和Caspase-3的轉(zhuǎn)錄水平，隨后用AnnexinV-FITC/PI雙染色法檢測了MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞在URI基因沉默后的細(xì)胞凋亡水平。本研究發(fā)現(xiàn)，URI基因沉默后MCF-7細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因Bax和Caspase-3轉(zhuǎn)錄水平的升高以及Bcl-2轉(zhuǎn)錄水平的降低，同時流式結(jié)果證明了URI基因沉默后促進乳腺癌細(xì)胞的凋亡。最后，通過Western blot檢測了凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的蛋白表達水平。研究發(fā)現(xiàn)，無論乳腺癌細(xì)胞是否發(fā)生凋亡，URI基因沉默后均可以抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，促進促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表達。其中，Caspase-3是凋亡的標(biāo)志蛋白，一般認(rèn)為只有分子量為35KD的Caspase-3被激活成17或19KD的Cleaved Caspase-3時才能更為準(zhǔn)確的體現(xiàn)凋亡的發(fā)生。而siRNA-URI組與NC-siRNA組相比，Cleaved Caspase-3蛋白表達量顯著升高。上述結(jié)果均證實了URI基因沉默可以促進乳腺癌細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，本研究闡明了URI基因在乳腺癌細(xì)胞中發(fā)揮的作用，證明了URI基因沉默可以抑制乳腺癌細(xì)胞的自噬，促進細(xì)胞凋亡，即URI在乳腺癌中同樣發(fā)揮癌基因的作用促進腫瘤的發(fā)展。