HGF/c-Met信號(hào)通路在少弱精子癥模型中的作用

邵 帥,江 梅,丁 濤,姜經(jīng)航,洪樂鵬,王 洋

0 引 言

男性少弱精子癥是引起男性不育的主要原因之一。近年來，隨著傳統(tǒng)的生活方式的改變以及諸多因素的影響，我國男性的精液質(zhì)量正以每年1%的速度下降，精子數(shù)量下降幅度甚至高達(dá)40%以上[1]。生殖系統(tǒng)感染、免疫因素、精索靜脈曲張、射線、吸煙、飲酒等都會(huì)引起男性不育，并且諸多因素涉及到共同機(jī)制——氧化應(yīng)激[2-4]，過量的活性氧和抗氧化機(jī)制缺陷可導(dǎo)致氧化應(yīng)激，過量的活性氧可啟動(dòng)精子線粒體內(nèi)的內(nèi)在凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑，破壞了精子完整性，導(dǎo)致生精細(xì)胞損傷，精子形態(tài)改變、功能及代謝異常，從而影響到精子的受精能力，進(jìn)而出現(xiàn)不育癥[5]。

HGF/c-Met在睪丸胚胎發(fā)育時(shí)期開始表達(dá)，與睪丸和精子發(fā)生以及損傷保護(hù)密切相關(guān)，有報(bào)道顯示慢性砷中毒能夠影響HGF/c-Met 的表達(dá)，使透明質(zhì)酸酶活性減弱，精子頂體完整率下降，精子畸形率升高[6]。近年來研究顯示HGF/c-Met信號(hào)通路與氧化應(yīng)激關(guān)系越來越緊密，在成體肝祖細(xì)胞中HGF/c-Met信號(hào)通路通過控制氧化應(yīng)激和凋亡使EMT后的卵形細(xì)胞擴(kuò)張，并通過維持上皮性質(zhì)來平衡EMT[7]；也有研究顯示糖尿病大鼠生精小管上皮和生精細(xì)胞中HGF/c-Met明顯增加，而氧化應(yīng)激是糖尿病造就睪丸損傷的重要致病因素，這說明HGF/c-Met信號(hào)通路在氧化應(yīng)激引起的睪丸損傷中扮演著重要的作用[8]。鑒于少弱精、氧化應(yīng)激、HGF/c-Met信號(hào)通路三者之間的關(guān)系，本文主要研究HGF/c-Met信號(hào)通路在少弱精子癥模型中的作用是否與氧化應(yīng)激有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料HGF購自美國PeproTech公司；環(huán)磷酰胺購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；睪酮(T)、促卵泡激素(FSH)、促黃體激素(LH)檢測(cè)試劑盒購自江蘇卡爾文生物技術(shù)有限公司；丙二醛、還原性谷胱甘肽(GSH)以及超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；c-Met、p-c-Met抗體均購于CST公司；β-acting、HRP-山羊抗兔購于中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性昆明小鼠40只，6～8周齡，購自湖北省疾病預(yù)防控制中心購買，試驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(鄂)2017-0012，動(dòng)物房?jī)?nèi)溫度控制在22～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，光照和黑暗各12h，可自由獲取水和食物。

1.3方法

1.3.1 造模、分組及給藥昆明小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為：對(duì)照組、HGF組、模型組和HGF+模型組，每組20只。其中模型組和HGF+模型組每天腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/kg，連續(xù)7 d制備少弱精子癥模型，但HGF+模型組第8天開始尾靜脈注射HGF 1 mg/kg，隔天1次，連續(xù)7次；對(duì)照組和HGF組每天腹腔注射等量的等滲鹽水，但HGF組從第8天開始尾靜脈注射HGF 1 mg/kg，隔日1次，連續(xù)7次。

1.3.2生殖器官指數(shù)檢測(cè)末次給藥后24 h后，稱量體重、眼球采血后脫頸椎處死小鼠，迅速摘取各組小鼠的睪丸和附睪，稱重并計(jì)算睪丸和附睪指數(shù)。睪丸和附睪指數(shù)=雙側(cè)睪丸或附睪總重量/體重

1.3.3小鼠精子懸液的制備取出小鼠睪丸兩側(cè)附睪，等滲鹽水清洗后顯微鏡下剪碎，剪碎后置入37 ℃恒溫水浴鍋中30 min 后，小心吸取上層液體，500 g/min 離心 5 min，沉淀混勻后在精子質(zhì)量分析儀檢測(cè)精子濃度和活力等指標(biāo)。

1.3.4血清T、FSH、LH檢測(cè)通過內(nèi)眥取血法采集小鼠血液，4 ℃下保存30 min后通過高速低溫離心機(jī)于4 ℃下以離心半徑10 cm 3000 r/min離心15 min，獲取血清，根據(jù)試劑盒檢測(cè)血清T、FSH、LH水平。

1.3.5丙二醛、SOD、GSH、SOD活性檢測(cè)取出小鼠睪丸組織置于EP管中放入-80 ℃冷凍，取出冷凍的睪丸組織加入200 μL蛋白裂解液(2 μLPMSF +200 μL RIPA)，然后置于冰上進(jìn)行組織勻漿。將所得組織勻漿移至無菌離心管內(nèi)，離心機(jī)中按4 ℃，以離心半徑10 cm 12 000 r/min 離心 10 min，然后收集EP管中離心后上清液。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)丙二醛、SOD、GSH活性。

1.3.6Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)睪丸組織按1.2.5中方法提取總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)各組蛋白濃度，并調(diào)平各組蛋白濃度，各組取40 μg蛋白樣品于聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后275 mA 電流2 h 將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，然后用5%脫脂奶粉封閉2 h后，PBST清洗后加入c-Met和p-c-Met抗體(各抗體濃度均為1∶1000)，4 ℃冰箱孵育過夜；第2天恢復(fù)室溫PBST清洗后，加入HRP-山羊抗兔抗體室溫孵育2 h，PBST清洗后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。

1.3.7HE染色取出兩側(cè)睪丸，用4%多聚甲醛固定24 h 后脫水，切片，HE 染色后觀察睪丸組織形態(tài)。

2 結(jié) 果

2.1 HGF對(duì)小鼠睪丸組織中c-Met表達(dá)影響結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，模型組中的p-c-Met蛋白表達(dá)水平均明顯下降(P<0.01)，而HGF組中的p-c-Met蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，HGF+模型組和HGF組中的p-c-Met蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與HGF+模型組相比，HGF組中的p-c-Met蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01)。見圖1。

1：對(duì)照組,2：模型組,3：HGF+模型組,4:HGF組

2.2HGF對(duì)小鼠生殖器指數(shù)的影響結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，模型組中的睪丸指數(shù)和附睪指數(shù)明顯下降(P<0.05)，HGF+模型組中的睪丸指數(shù)降低(P<0.01)。與模型組比較，HGF+模型組中的睪丸指數(shù)明顯升高(P<0.05)，附睪指數(shù)也在升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與HGF+模型組相比，HGF組中的睪丸指數(shù)明顯升高(P<0.05)，附睪指數(shù)升高不明顯(P>0.05)，見表1。

表1 HGF對(duì)小鼠生殖器指數(shù)的影響

2.3HGF對(duì)小鼠的精液質(zhì)量影響與對(duì)照組比較，模型組小鼠的精子濃度、精子活力均明顯降低(P<0.01)，而精子畸形率明顯升高(P<0.01),HGF+模型組中精子濃度、精子活力液均下降(P<0.01)，精子畸形率也升高(P<0.01)，HGF組中精子濃度、精子活力以及精子畸形率變化不明顯(P>0.05)；與模型組比較，HGF+模型組中小鼠精子濃度、活力升高(P<0.01)、精子畸形率下降(P<0.01)，HGF組中小鼠精子濃度、活力也均升高(P<0.01)、精子畸形率下降(P<0.01)；與HGF+模型組相比，HGF組中小鼠精子濃度、活力升高(P<0.05)、精子畸形率降低(P<0.05)。見表2。

表2 HGF對(duì)小鼠的精液質(zhì)量影響

2.4HGF對(duì)小鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)變化的影響HE染色結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，模型組小鼠睪丸組織嚴(yán)重?fù)p傷，結(jié)構(gòu)層次混亂，精子細(xì)胞并且排列紊亂，曲細(xì)精管呈現(xiàn)空泡化，細(xì)胞間距增大，HGF+模型組中小鼠睪丸組織損傷較輕，生精細(xì)胞層數(shù)和數(shù)量較少，HGF組中小鼠睪丸組織沒有變化；與模型組比較，HGF+模型組中小鼠睪丸生精細(xì)胞排列整齊、緊密、規(guī)則，生精細(xì)胞層數(shù)和數(shù)量明顯增多，HGF組中小鼠睪丸組織小鼠生精小管管腔飽滿，生精上皮外的界膜均勻、完整；與HGF+模型組相比，HGF組生精上皮厚度適中，可見密度適當(dāng)?shù)木?，各?jí)細(xì)胞排列精密，層次分明。見圖2。

a：對(duì)照組; b：模型組; c：HGF+模型組; d:HGF組

2.5HGF對(duì)小鼠睪丸組織丙二醛、SOD、GSH活性的影響與對(duì)照組比較，模型組小鼠睪丸組織中丙二醛水平顯著升高(P<0.01),抗氧化指標(biāo)SOD、GSH水平顯著降低(P<0.01),HGF+模型組中丙二醛水平升高(P<0.01),SOD、GSH水平降低不明顯(P>0.05),HGF組中變化不明顯(P>0.05)；與模型組比較，HGF+模型組中小鼠睪丸組織中丙二醛水平顯著降低(P<0.05)，SOD、GSH水平水平顯著升高(P<0.05)；與HGF+模型組相比，HGF組中鼠睪丸組織中丙二醛水平降低(P<0.05)，SOD、GSH水平水平升高不明顯(P>0.05)。見表3。

表3 HGF對(duì)小鼠睪丸組織丙二醛、SOD、GSH、SOD活性的影響

2.6HGF對(duì)小鼠血清T、FSH、LH活性的影響與對(duì)照組比較，模型組小鼠性激素LH和FSH水平顯著升高(P<0.01)、T 顯著降低(P<0.01)，HGF+模型組中LH和FSH水平升高(P<0.01)、T水平降低(P<0.01)，HGF組中表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，HGF+模型組中中T 表達(dá)水平升高(P<0.05)、LH和FSH 水平降低(P<0.05)，HGF組中T 表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，LH、FSH 水平顯著降低(P<0.01)；與HGF+模型組相比，HGF組中T 表達(dá)水平升高(P<0.05)，LH和FSH 水平降低(P<0.05)。見表4。

表4 HGF對(duì)小鼠血清T、FSH、LH活性的影響

3 討 論

少弱精子癥是男性不育最常見的因素,其致病因素包括。多種因素都會(huì)使精子發(fā)生異常, 導(dǎo)致少弱精子癥，而睪丸組織內(nèi)常伴有高水平的活性氧,高濃度的活性氧能夠誘導(dǎo)氧化應(yīng)激導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物等不斷積累, 損傷抗氧化系統(tǒng), 阻礙精子發(fā)生過程[9]。研究發(fā)現(xiàn)HGF/c-Met信號(hào)通路與男性生殖系統(tǒng)有關(guān)，在精子和睪丸中均有表達(dá)，而且在異硫氰酸α-萘酯的肝內(nèi)膽汁淤積中，HGF/c-Met可以通過抗氧化應(yīng)激發(fā)揮保護(hù)性作用[10]。鑒于三者之間的關(guān)系，本研究通過環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠形成少弱精子癥模型，注射HGF來誘導(dǎo)HGF/c-Met信號(hào)通路激活，觀察其對(duì)精液質(zhì)量、氧化應(yīng)激、性激素等的影響。

男性生殖系統(tǒng)中活性氧與多種抗氧化酶處于動(dòng)態(tài)平衡中,一旦動(dòng)態(tài)平衡失衡，過量的活性氧會(huì)與精子膜表面多不飽和脂肪酸相互反應(yīng)產(chǎn)生丙二醛，同時(shí)體內(nèi)多種抗氧化酶比如SOD、GSH、CAT等含量表達(dá)下降低,導(dǎo)致清除體內(nèi)過量活性氧的能力減弱,體內(nèi)過多的活性氧影響到生殖系統(tǒng)的平衡狀態(tài),使精子發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致精子損傷[11-13]。本研究結(jié)果顯示：環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的少弱精子癥模型中丙二醛含量升高，抗氧化酶SOD、GSH的含量降低，這與少弱精子癥模型的研究結(jié)果一致[14]；也是通過氧化應(yīng)激造就精子損傷，模型組中p-c-Met表達(dá)受抑制，這與XU研究的通過H2O2刺激MSCs 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激中HGF/c-Met信號(hào)通路受抑制的研究也一致[15]；HGF尾靜脈注射會(huì)引起睪丸組織p-c-Met表達(dá)升高，說明激活體內(nèi)HGF/c-Met信號(hào)通路；激活該通過能夠明顯抑制丙二醛表達(dá)，升高SOD、GSH水平，說明HGF/c-Met信號(hào)通路可以通過抗氧化作用和清除自由基來維持正常的抗氧化體系，進(jìn)而保護(hù)活性氧引起的生殖細(xì)胞氧化損傷。睪丸作為產(chǎn)生精子的場(chǎng)所，睪丸組織病理結(jié)構(gòu)可以反映生殖受損的直接證據(jù)，而生殖器指數(shù)可以直接反映藥物對(duì)生殖器官作用的綜合情況，模型組小鼠的睪丸組織結(jié)構(gòu)受損，睪丸和附睪生殖器指數(shù)均極顯著降低，激活HGF/c-Met信號(hào)通路可以對(duì)睪丸和附睪等生殖器發(fā)揮保護(hù)作用；環(huán)磷酰胺引起的生功能障礙可以通過精子相關(guān)指標(biāo)反應(yīng)，包括精子濃度、精子活力、精子畸形率等。環(huán)磷酰胺影響生精細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸的過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜的流動(dòng)性和完整性降低[16]，影響精子形成細(xì)胞的活力和功能，導(dǎo)致精子質(zhì)量下降，而激活HGF/c-Met通路后能夠明顯提高精子濃度、活力，降低畸形率，能夠維持正常的精液質(zhì)量指標(biāo)；精子發(fā)生、成熟及睪丸生精功能受到受下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)和控制, 性腺軸分泌的FSH、LH和T直接調(diào)節(jié)人體性功能與生殖功能, 以維持整個(gè)生育期的動(dòng)態(tài)平衡，HGF處理后能夠明顯升高T表達(dá)，降低FSH和LH的表達(dá)，說明HGF能有效改善環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的血清及睪丸中性激素異常變化，維持血清激素的正常生理功能，但具體的機(jī)制還需要深入研究和探討。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HGF能夠激活體內(nèi)的HGF/c-Met信號(hào)通路，通過該通路能夠發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用來維持正常的生殖器指數(shù)、睪丸組織結(jié)構(gòu)、精液指標(biāo)以及性激素水平，但具體機(jī)制有待深入研究。