舒芬太尼對(duì)阿爾茨海默癥大鼠認(rèn)知功能和氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的影響

余泳波，夏曉瓊，徐玉婷，高 翔，張慶梅，李雅文，楊陟灝，宮仁杰，曹坤鵬

0 引 言

阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease, AD)又稱老年癡呆，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，起病原因復(fù)雜，多發(fā)于70歲以上人群，臨床常見的表現(xiàn)癥狀為認(rèn)知功能下降、行為障礙及生活能力下降等，導(dǎo)致老年人生活受到嚴(yán)重影響[1-2]。由于我國人口老齡化不斷加劇，同時(shí)患有老年癡呆的人群逐漸上升，是當(dāng)前我國面臨亟待解決和研究的問題[3]。關(guān)于AD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，其中樞膽堿神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元死亡、β-淀粉樣蛋白異常沉積等引起的膽堿系統(tǒng)損害、炎癥反應(yīng)等是重要原因[4-5]。多數(shù)研究證明，麻醉藥物對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用，如右美托咪定、七氟醚等[6-7]。丁荷蓓等[8]研究結(jié)果顯示，舒芬太尼是常用于臨床的麻醉藥物，有研究結(jié)果顯示，右美托咪定聯(lián)合舒芬太尼能夠保護(hù)循環(huán)手術(shù)大鼠的認(rèn)知功能，降低β-淀粉樣蛋白、磷酸化Tau蛋白、凋亡相關(guān)蛋白(Casepase-3，Bax)的表達(dá)，但是對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)AD的研究相對(duì)較少。本研究通過Aβ1-42誘導(dǎo)建立AD大鼠模型，探討舒芬太尼對(duì)AD模型大鼠認(rèn)知功能、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑Aβ1-42購買于美國sigma公司；舒芬太尼購買于湖北宜昌人福藥業(yè)；SYP抗體、PSD95抗體、GAPDH抗體購買于美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購買于武漢博士德公司；BCA試劑盒、化學(xué)發(fā)光液購買于上海碧云天生物公司；乙酰膽堿酶轉(zhuǎn)移酶(acetylcholinease transferase, ChAT)檢測(cè)試劑盒、乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AChE)檢測(cè)試劑盒購買于北京索萊寶公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測(cè)試劑盒、丙二醛(malonaldehyde,MDA)檢測(cè)試劑盒、過氧化氫酶(catalase,CAT)檢測(cè)試劑盒、TNF-α檢測(cè)試劑盒和IL-1β檢測(cè)試劑盒購買于南京建成生物研究所。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選擇50只SD級(jí)雄性大鼠購于北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK (京)2012-0001。SD雄性大鼠體質(zhì)量為220～260 g，動(dòng)物生長溫度為20～24 ℃，濕度為52%～56%，光照與黑暗交替各12 h，大鼠自由進(jìn)食和飲水。大鼠適應(yīng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3動(dòng)物分組和建立模型將Aβ1-42用無菌生理蒸餾水稀釋至濃度為5 μg/L溶液，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d使其獲得聚集纖絲。參照文獻(xiàn)[9]建立AD模型，將50只SD級(jí)雄性大鼠分為5組：對(duì)照組、阿爾茨海默癥模型(AD)組、舒芬太尼低劑量組(1 μg/kg)、舒芬太尼高劑量組(10 μg/kg)和石杉?jí)A甲組(30 μg/kg)，每組10只。將5組大鼠采用濃度為40 mg/kg的1%戊巴比妥鈉注射麻醉大鼠，并固定在腦立體定向內(nèi)。采用無菌手術(shù)刀將大鼠皮膚開口，前囟區(qū)暴露。AD組、舒芬太尼各組于海馬CA1區(qū)緩慢注射10 μg(1 μL)的Aβ1-42，注射后需留針5 min，對(duì)照組注射等體積的等滲鹽水，退針后將傷口縫合。舒芬太尼和石杉?jí)A甲組灌胃給予對(duì)應(yīng)藥物，對(duì)照組和AD組灌胃等量等滲鹽水，1次/d，連續(xù)21 d。

1.4Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)參照Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)、記憶功能，水迷宮直徑為180 cm，高55 cm圓形水池，且水池壁為黑色，水深30 cm，在距離水池壁35 cm處放置一個(gè)圓臺(tái)(高29 cm，直徑10 cm)。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行5 d，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前1天大鼠自由游泳2 min，然后從第1 天每天開始每天上午、下午各2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)訓(xùn)練4次。訓(xùn)練時(shí)將大鼠面向池壁放入水內(nèi)，記錄大鼠爬上平臺(tái)時(shí)間，即為逃避潛伏期。若大鼠在2 min內(nèi)到達(dá)平臺(tái)，則需將大鼠引至平臺(tái)，時(shí)間為120 s。第5 天進(jìn)行最后一次訓(xùn)練后將平臺(tái)撤出，將大鼠放置同一入水點(diǎn)，面向池壁放入水內(nèi)，檢測(cè)120 s內(nèi)在原平臺(tái)象限停留的時(shí)間、跨平臺(tái)位置的次數(shù)。

1.5Western blot檢測(cè)SYP、PSD95蛋白的表達(dá)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，取出大鼠大腦海馬組織，加入蛋白裂解液將裂解，12 000×g離心15 min，在BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取40 μg樣品通過SDS-PAGE分離，將凝膠上樣蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，脫脂牛奶封閉2 h，然后加入SYP(稀釋1∶1000)、PSD95(稀釋1∶1000)和GAPDH(稀釋1∶1500)抗體，4 ℃過夜孵育，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(稀釋1∶5000)，37 ℃孵育2 h。通過化學(xué)發(fā)光液使其顯色、曝光，在Image J軟件下分析蛋白條帶，以GAPDH作為內(nèi)參，分析蛋白表達(dá)。

1.6ELISA法檢測(cè)膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)、抗氧化及抗炎指標(biāo)取1.5余下的海馬組織，制備海馬組織勻漿液，離心后收集上清，然后按照試劑盒說明書步驟，檢測(cè)ChAT、AChE、SOD、MDA、CAT、TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮試驗(yàn)逃避潛伏期的比較Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：第1-5天，AD組的逃避潛伏期較對(duì)照組、舒芬太尼低劑量組、舒芬太尼高劑量組、石杉?jí)A甲組明顯延長(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠Morris水迷宮試驗(yàn)逃避潛伏期的比較

2.2各組大鼠Morris水迷宮試驗(yàn)空間探索能力的比較Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， AD組的原平臺(tái)象限停留的時(shí)間、跨平臺(tái)次數(shù)較對(duì)照組、舒芬太尼低、高劑量組和石杉?jí)A甲組明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠Morris水迷宮試驗(yàn)空間探索能力的比較

2.3各組突觸相關(guān)蛋白SYP、PSD95的比較AD組的SYP、PSD95蛋白表達(dá)較對(duì)照組、舒芬太尼低、高劑量組和石杉?jí)A甲組明顯降低(P<0.05)。見圖1，表3。

1:對(duì)照組; 2:AD組; 3:舒芬太尼低劑量組; 4:舒芬太尼高劑量組; 5:石杉?jí)A甲組

2.4各組ChAT、AChE活性的比較AD組的ChAT、AChE活性較對(duì)照組、舒芬太尼低、高劑量組和石杉?jí)A甲組明顯降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組突觸相關(guān)蛋白及ChAT、AChE活性的比較

2.5各組SOD活性、MDA含量和CAT活性、TNF-α、IL-1β的比較AD組的SOD活性、CAT活性較對(duì)照組、舒芬太尼低、高劑量組和石杉?jí)A甲組明顯降低(P<0.05)，MDA含量、TNF-α、IL-1β表達(dá)明顯增加(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠SOD活性、MDA含量、CAT活性、TNF-α和IL-1β表達(dá)的比較

3 討 論

阿爾茨海默癥主要表現(xiàn)為認(rèn)知障礙和記憶功能減退，具有較高發(fā)病率、致死率[9-10]，病因復(fù)雜多樣，主要病理表現(xiàn)為β淀粉樣蛋白異常引起的老年斑沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)、神經(jīng)元丟失等，進(jìn)而導(dǎo)致膽堿神經(jīng)受到損害[11-12]。β淀粉樣蛋白異常聚集是阿爾茨海默癥發(fā)病的主要機(jī)制之一，常見有Aβ1-40、Aβ1-42和Aβ25-35，其中Aβ1-42毒性較大，用于構(gòu)建AD模型持續(xù)時(shí)間優(yōu)于Aβ1-40、Aβ25-35[13-14],因此，本研究選擇Aβ1-42誘導(dǎo)大鼠建立AD模型。學(xué)習(xí)記憶能力與膽堿神經(jīng)系統(tǒng)間聯(lián)系密切，乙酰膽堿(Ach)含量與ChAT、AChE活性有關(guān)，Ach能夠被ChAT催化，AchE則能分解Ach，ChAT、AChE共同維持Ach動(dòng)態(tài)平衡，Aβ誘導(dǎo)AD模型中，導(dǎo)致ACh合成不足影響膽堿能神經(jīng)功能[15-16]。突出丟失是影響認(rèn)知功能的因素之一，SYP和PSD95可以作為評(píng)估突觸重建的標(biāo)志，SYP主要分布在神經(jīng)元突觸前膜，是一種與突觸功能和結(jié)構(gòu)有關(guān)的膜蛋白[17]。PSD95廣泛存在與中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸后致密區(qū)，是一種神經(jīng)細(xì)胞骨架蛋白，維持突觸正常結(jié)構(gòu)及參與其形成[18]，Aβ1-42誘導(dǎo)AD小鼠模型中，小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，神經(jīng)突觸降低，導(dǎo)致SYP、PSD95蛋白表達(dá)下調(diào)[19]。因此，本研究Aβ1-42誘導(dǎo)建立AD模型，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察大鼠學(xué)習(xí)、空間記憶能力，結(jié)果顯示，AD組逃避潛伏期明顯高于對(duì)照組，在原平臺(tái)象限停留時(shí)間、跨平臺(tái)次數(shù)高于明顯低于對(duì)照組，ChAT、AChE活性明顯低于對(duì)照組，SYP、PSD95蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組，說明Aβ1-42誘導(dǎo)AD模型大鼠的認(rèn)知功能受到損害，這與之前的研究報(bào)道一致。舒芬太尼是一種在臨床廣泛使用的麻醉藥，具有作用時(shí)間長、鎮(zhèn)痛效果強(qiáng)等特點(diǎn)[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，舒芬太尼極容易通過血腦屏障，并在腦內(nèi)達(dá)到有效濃度，通過抑制TLR4/核因子κB通路保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)，抑制神經(jīng)元的凋亡和炎癥反應(yīng)，有效減輕腦組織損傷，具有明顯的腦保護(hù)效果[21]。本研究結(jié)果顯示，與AD組相比，舒芬太尼低、高劑量組可以明顯抑制逃避潛伏期，增加原平臺(tái)象限停留時(shí)間、跨平臺(tái)次數(shù)，促進(jìn)ChAT、AChE活性，上調(diào)SYP、PSD95蛋白表達(dá)，說明舒芬太尼能對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)AD模型大鼠的認(rèn)知功能具有保護(hù)作用，調(diào)節(jié)膽堿系統(tǒng)和突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)。

許多來自AD患者的尸檢顯示，AD大腦可見大量的氧自由基及炎癥因子過度表達(dá)，體外研究也表達(dá)了類似的結(jié)果，Aβ培養(yǎng)的成熟海馬腦片可呈時(shí)間依賴性的腦神經(jīng)細(xì)胞損傷，并伴隨活性氧自由基及炎癥因子表達(dá)上調(diào)，提示氧化損傷和炎癥反應(yīng)參與阿爾茨海默癥的發(fā)生和發(fā)展[22]，在阿爾茨海默病大鼠模型內(nèi)，引起抗氧化酶活性功能紊亂、自由基增加，進(jìn)而引發(fā)氧化損傷[23]?？寡趸窼OD、CAT及反應(yīng)產(chǎn)物MDA可以作為評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激反應(yīng)的指標(biāo)；TNF-α、IL-1β是促炎性因子，異常增加能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)元γ-分泌酶促進(jìn)生成Aβ[24-25]，在AD大鼠模型中Aβ沉積能加速炎癥因子IL-1β、IL-6的分泌，產(chǎn)生細(xì)胞毒性效應(yīng)，加重大腦內(nèi)海馬組織炎性損傷，進(jìn)而影響認(rèn)知功能[26]。本研究結(jié)果顯示，Aβ1-42誘導(dǎo)AD大鼠模型中SOD、CAT活性低于對(duì)照組，MDA含量、TNF-α、IL-1β表達(dá)高于對(duì)照組；與AD組相比，舒芬太尼低、高劑量組可以促進(jìn)SOD、CAT活性，抑制MDA含量、TNF-α、IL-1β表達(dá)，且呈劑量依賴性趨勢(shì)，提示舒芬太尼能夠減緩Aβ1-42誘導(dǎo)AD模型大鼠氧化損傷和炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究證實(shí)了舒芬太尼對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)AD模型認(rèn)知功能具有保護(hù)作用，調(diào)節(jié)膽堿系統(tǒng)、突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)，并抑制氧化損傷和炎癥反應(yīng)，關(guān)于舒芬太尼對(duì)阿爾茨海默病具體研究機(jī)制需要進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)探究。