房水流動(dòng)粒子圖像測(cè)速測(cè)試中跟隨性示蹤粒子選擇的實(shí)驗(yàn)研究

王文佳 龍曉雪 劉志成 張弓 宋紅芳

0 引言

青光眼是一種主要以眼壓升高為危險(xiǎn)因素的眼病，可造成視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞丟失，進(jìn)而導(dǎo)致視野缺損、視力下降[1]，是不可修復(fù)的主要致盲眼病之一[2]。眼壓與房水流動(dòng)通暢與否密切相關(guān)[3]。房水與虹膜的異常作用是引發(fā)瞳孔阻滯力導(dǎo)致房角關(guān)閉和眼壓升高的主要原因[4]。正常情況下，房水是無(wú)色透明液體，由睫狀突以1.5～3.0 μL/min的速率分泌產(chǎn)生。絕大多數(shù)的房水經(jīng)由后房穿過(guò)瞳孔到達(dá)前房，再由前房角進(jìn)入鞏膜靜脈竇，最終匯入眼靜脈[5]。房水流動(dòng)是一種在小空間內(nèi)的低速慢流流動(dòng)，其生成和排出過(guò)程持續(xù)大約100 min[6]。房水流動(dòng)受阻或者房水流動(dòng)狀態(tài)改變，一直被公認(rèn)為是閉角型青光眼發(fā)生的主要力學(xué)因素之一，房水流動(dòng)的評(píng)測(cè)是分析閉角型青光眼病程發(fā)展和致盲機(jī)制的核心問(wèn)題。

粒子圖像測(cè)速(particle image velocimetry，PIV)是一種瞬時(shí)、動(dòng)態(tài)、非接觸的全流場(chǎng)速度直接測(cè)量手段[7]，其原理是利用示蹤粒子的速度間接反映流體的速度。將PIV應(yīng)用到房水流場(chǎng)的測(cè)量具有一定的挑戰(zhàn)性。由于人眼內(nèi)房水流動(dòng)的速率低，房水從生成到流出在眼內(nèi)停留的時(shí)間長(zhǎng)，粒徑不合適的示蹤粒子很容易發(fā)生沉淀，直接影響測(cè)量結(jié)果。因此用PIV測(cè)量眼內(nèi)房水流動(dòng)的宏觀速度場(chǎng)時(shí)，選擇合適的示蹤粒子是保證PIV實(shí)驗(yàn)精度的關(guān)鍵，其中示蹤粒子的跟隨性、沉降性尤為重要[8-9]。

考慮到粒子在均勻流場(chǎng)中的震蕩衰減，選用跟隨性好的粒子的一個(gè)重要原則是粒子密度應(yīng)與流體密度盡量一致[10]。然而，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中粒子本身的空間位置和運(yùn)動(dòng)狀況[11]以及流場(chǎng)的形態(tài)和流速[12]都會(huì)影響示蹤粒子的跟隨性。沙文慧等[13]研究認(rèn)為，受成像測(cè)量方法的限制，示蹤粒子的粒徑應(yīng)盡可能大，但跟隨性要求又希望其尺寸能盡量小，因此要充分考慮流場(chǎng)的特性，選擇最佳粒徑的示蹤粒子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

本課題組前期利用PIV測(cè)量體外兔眼房水流場(chǎng)，得到了1000 μL/min驅(qū)動(dòng)流量下的房水流動(dòng)特性，提出了用PIV對(duì)體內(nèi)兔眼測(cè)量的可能[14]，但研究中的粒徑是否適用于眼內(nèi)的低速流場(chǎng)尚未可知。因此，為了更貼近眼內(nèi)流場(chǎng)真實(shí)情況，為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備，本研究使用體外模型為研究對(duì)象，應(yīng)用流動(dòng)相似性原理進(jìn)行眼球房水慢流PIV測(cè)試，探討不同粒子的跟隨性并選擇最佳跟隨性的示蹤粒子。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 眼前節(jié)房水流動(dòng)仿真裝置

根據(jù)真實(shí)人眼解剖結(jié)構(gòu)[15]，依據(jù)幾何相似性原理，設(shè)計(jì)5倍于真實(shí)人眼解剖結(jié)構(gòu)的體外實(shí)驗(yàn)眼球模型，尺寸如表1所示。

表1 體外實(shí)驗(yàn)眼球模型幾何參數(shù)

利用3D打印技術(shù)，制作了一套包括角膜、虹膜、睫狀體和玻璃體主要部分的眼前節(jié)房水流動(dòng)仿真模型，如圖1所示。其中角膜、睫狀體和玻璃體材料選用透明有機(jī)玻璃，虹膜采用中間有孔的硅膠圈，孔代表瞳孔，硅膠圈來(lái)分隔前房和后房。為了保證房水均勻地從前房的四周流入前房角部位，再流出眼球模型，同時(shí)兼顧加工工藝問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)裝置在前房的環(huán)周內(nèi)側(cè)均勻設(shè)計(jì)了24個(gè)孔徑為1 mm的小孔，小孔細(xì)小且均勻密布。經(jīng)過(guò)前期的測(cè)試知道，此設(shè)計(jì)能夠滿足房水流動(dòng)這樣的低速慢流流體在前房四周均勻地?cái)U(kuò)散和流出。在后房角和前房角處對(duì)稱地設(shè)計(jì)兩個(gè)洞，洞與膠管連接實(shí)現(xiàn)模型中模擬房水的注入及排出。模型通過(guò)灌注技術(shù)制成，有很好的透光性。實(shí)驗(yàn)時(shí)角膜上方的方形水槽充滿水以改變折射率，保證拍攝到真實(shí)的流場(chǎng)結(jié)構(gòu)。

圖1 體外實(shí)驗(yàn)眼球模型

依據(jù)雷諾數(shù)相似原理，以角鞏膜緣環(huán)半徑為參考尺寸，將模型放大5倍，流速降低為1/5倍：

(1)

(2)

Q=r2，Q′=v′πr′2

(3)

式中，ρ為模型房水密度；v為模型灌注流速；r為模型半徑；η為黏性系數(shù)；Q為模型房水流量；ρ′為人眼房水密度；v′為人眼房水流速；r′為人眼角鞏膜緣環(huán)半徑；Q′為人眼房水流量。

此時(shí)Q=5Q′，意味著只考慮睫狀突分泌房水的情況下，模型中的入射流量為真實(shí)人眼分泌房水流量的5倍，約為7.5～15 μL/min。由于在流場(chǎng)中示蹤粒子受重力影響會(huì)沉淀在模型底部，流速越慢，沉淀越快，實(shí)驗(yàn)中采用比計(jì)算結(jié)果更低的入射流量5 μL/min，便于篩選不易沉淀的示蹤粒子。

1.2 示蹤粒子選擇

國(guó)內(nèi)比較常見(jiàn)的有白色的A12O3、空心玻璃珠以及聚苯乙烯等,熒光粒子是聚苯乙烯微球表面涂抹熒光素制成。研究表明，粒子密度與流體密度的比值(密度比，ε)越接近1，粒子的跟隨性越好[16]。人眼房水的主要成分為水，模型中以水代替房水混合示蹤粒子，因此要求示蹤粒子與水的ε接近1，而聚苯乙烯ε=1.05，鋁粉ε=2.7，空心玻璃珠ε=0.2[16]，因此選用聚苯乙烯與空心玻璃珠材料的粒子跟隨性更好。同時(shí)粒徑越小跟隨性越好，但基于PIV設(shè)備限制，粒徑過(guò)小有可能無(wú)法清晰捕捉，因此從盡可能小的尺寸出發(fā)，選擇了10 μm空心玻璃珠，1 μm、3 μm、7 μm和20～50 μm熒光粒子作為示蹤粒子。將0.1 g空心玻璃珠粉末加入到100 mL的純水中，配置空心玻璃珠溶液；將0.05 mL熒光粒子加入到200 mL的純水中配置熒光粒子溶液(濃度為0.25%)。通過(guò)不同粒徑的對(duì)比效果選擇最適合系統(tǒng)的示蹤粒子。

1.3 PIV測(cè)試系統(tǒng)

PIV測(cè)試系統(tǒng)主要包括：TSI公司同步器、Beamtech公司激光發(fā)生器、TSI公司的CCD(Charge-coupled Device，電荷耦合元件)攝像機(jī)、尼康公司微距鏡頭(Nikon AF Micro Nikkor 105mm / F2.8D)，如圖2所示；用于控制注射示蹤粒子速度的微量注射泵和標(biāo)準(zhǔn)一次性靜脈注射器。實(shí)驗(yàn)軟件包括：Insight4軟件，用于控制激光發(fā)生器與攝像機(jī)的同步及粒子圖像拍攝和處理；Telplot360軟件，用于顯示分析得出的流場(chǎng)結(jié)果。

圖2 PIV測(cè)試系統(tǒng)

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，激光發(fā)生器產(chǎn)生激光，經(jīng)由導(dǎo)光臂導(dǎo)向攝像機(jī)前，形成一個(gè)與攝像頭拍攝方向垂直的激光平面，由主機(jī)內(nèi)軟件經(jīng)同步器控制攝像機(jī)的拍攝，實(shí)現(xiàn)與激光發(fā)射同步進(jìn)行。根據(jù)不同示蹤粒子沉淀情況，相機(jī)每隔一段時(shí)間，進(jìn)行一次圖像采集。

1.4 圖像處理

由于模型及流場(chǎng)分布呈現(xiàn)明顯對(duì)稱性，實(shí)驗(yàn)選取前房流場(chǎng)的1/2進(jìn)行研究。編寫(xiě)Matlab程序?qū)δＰ椭虚g的矩形區(qū)域(區(qū)域大小為1024dpi×320dpi，如圖3A所示)粒子數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，即將圖像的灰度根據(jù)某一閾值(200或300)進(jìn)行二值化處理，統(tǒng)計(jì)選定的矩形區(qū)域內(nèi)光斑數(shù)。為了保證PIV計(jì)算結(jié)果的精確度，在每個(gè)32×32的像素框內(nèi)(圖3B)，都需要有2～9個(gè)示蹤粒子。

A—粒子計(jì)數(shù)范圍；B— 32×32像素框

2 結(jié)果

2.1 空心玻璃珠沉淀結(jié)果

10 μm空心玻璃珠注入模型后的流場(chǎng)分布情況如圖4所示。

圖4 10 μm空心玻璃珠隨時(shí)間的流場(chǎng)分布

2.2 熒光粒子沉淀結(jié)果

20～50 μm和7 μm熒光粒子注入后流場(chǎng)分布如圖5、圖6所示。為使3 μm熒光粒子的計(jì)數(shù)更加準(zhǔn)確，降低了3 μm熒光粒子溶液濃度，由0.25%稀釋為0.1%，流場(chǎng)分布如圖7所示。1 μm熒光粒子注入后彌散并攪勻后成霧狀，即使放大也無(wú)法很好地分辨每一個(gè)粒子，無(wú)法用于計(jì)算流場(chǎng)，如圖8所示。分別統(tǒng)計(jì)20～50 μm、7 μm和3 μm熒光粒子個(gè)數(shù)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取平均值，不同粒子數(shù)量隨時(shí)間的變化如圖9所示。粒子觀察時(shí)間以及最末時(shí)刻與初始時(shí)刻懸浮粒子數(shù)之比見(jiàn)表2。

圖5 20～50 μm熒光粒子隨時(shí)間的流場(chǎng)分布

圖6 7 μm熒光粒子隨時(shí)間的流場(chǎng)分布

圖7 3 μm熒光粒子隨時(shí)間的流場(chǎng)分布

圖8 1 μm熒光粒子在不同狀態(tài)下的局部放大圖

圖9 不同粒子數(shù)量隨時(shí)間的變化

表2 不同粒子保留占比

比較空心玻璃珠和不同粒徑熒光粒子注射后隨時(shí)間的數(shù)量變化，發(fā)現(xiàn)空心玻璃珠在50 min之前下降較為明顯，之后開(kāi)始穩(wěn)定，但因其由自然光反射，顯影效果不佳，后期圖像處理易產(chǎn)生較大誤差。20～50 μm熒光粒子注入后數(shù)量持續(xù)下降，13 min前下降較為明顯，之后開(kāi)始穩(wěn)定；7 μm熒光粒子數(shù)量在40 min內(nèi)總體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，且在40 min后降到20個(gè)以下，幾乎可看作完全沉淀；1 μm粒徑過(guò)小，雖然跟隨性好，但顯影效果不佳，無(wú)法觀測(cè)計(jì)數(shù)；只有3 μm熒光粒子數(shù)量沒(méi)明顯降低，且能穩(wěn)定分布長(zhǎng)達(dá)5小時(shí)以上。因此，從粒子均勻分布維持時(shí)間長(zhǎng)短、沉淀數(shù)量及顯影效果等幾方面比較，3 μm熒光粒子效果最好。

3 討論

目前關(guān)于房水流場(chǎng)的研究分為模擬計(jì)算和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。模擬計(jì)算方面有平面理論模型[17]和3D房水流動(dòng)模型[18]，獲得了房水流場(chǎng)的速度分布情況。本文作者前期在理想化眼球模型中采用流固耦合數(shù)值計(jì)算方法研究了眼壓、體位等多種因素對(duì)房水流動(dòng)的影響[19]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方面，王萬(wàn)筆等[20]對(duì)兔眼前房?jī)?nèi)注射釓噴酸葡甲胺對(duì)比劑稀釋液，通過(guò)磁共振成像和定量計(jì)算，推算出活體兔眼排水能力，但未測(cè)得房水的流動(dòng)過(guò)程?，F(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)研究中，都是借由其他物質(zhì)對(duì)房水的流動(dòng)做出定性的觀察，無(wú)法獲得確切的房水流場(chǎng)特性。模擬研究普遍缺乏活體的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，證明實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性存在一定的困難。本文采用PIV技術(shù)直接測(cè)試小空間低速流場(chǎng)，在測(cè)量時(shí)不對(duì)流場(chǎng)進(jìn)行干擾，更適合測(cè)試體內(nèi)流場(chǎng)。由于真實(shí)眼球內(nèi)房水流動(dòng)的驅(qū)動(dòng)因素很多，例如前后房溫差、前后房壓差等[21]，活體測(cè)量才能獲得最為準(zhǔn)確的前房流場(chǎng)[22]。此次的實(shí)驗(yàn)與探究，為低速小空間流場(chǎng)的PIV測(cè)量選取了合適的示蹤粒子，為后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)打下了基礎(chǔ)。

空心玻璃珠由自然光反射，自然光在模型上的反射也會(huì)被CCD相機(jī)拍攝到，對(duì)顯影效果和實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定的影響。熒光粒子的特性則是吸收激光發(fā)射的綠光反射紅光，相機(jī)通過(guò)濾波片捕捉波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紅光，減少了實(shí)驗(yàn)誤差，因此使用了多種粒徑的熒光粒子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。同時(shí)CCD相機(jī)以及微距鏡頭是PIV系統(tǒng)中較為重要的模塊，兩者的性能也是保障PIV實(shí)驗(yàn)效果的重要條件。盡管粒子跟隨性也可以通過(guò)理論計(jì)算來(lái)進(jìn)行評(píng)測(cè)[23-24]，然而在PIV流場(chǎng)測(cè)試中還需要考慮攝像機(jī)的拍攝效果。因此，需要根據(jù)目前的PIV設(shè)備狀況，在可拍攝的條件下找到最為適合的示蹤粒子[25-26]。

4 結(jié)論

本文考慮示蹤粒子的沉淀問(wèn)題討論小空間低流速場(chǎng)中示蹤粒子的跟隨性；針對(duì)實(shí)驗(yàn)眼球模型，分析了不同材料、不同粒徑示蹤粒子的跟隨性隨時(shí)間的變化以及顯影效果，最終確定了適合模型和流動(dòng)特性的最佳示蹤粒子，為后續(xù)眼內(nèi)房水流場(chǎng)分布的獲得奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明熒光粒子的粒徑越大，沉淀速度越快，沉淀量也越大；3 μm熒光粒子沉淀最不明顯，顯影效果最為清晰，最能保證PIV測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性，是跟隨性和顯影效果最佳的示蹤粒子。