基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究盆炎靈合劑治療盆腔炎性疾病的作用機(jī)制

龔琳娜， 鄒 威， 董雅倩， 方超英， 劉孟華*

(1.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515；2.湖南省婦幼保健院，長沙市婦產(chǎn)科中藥制劑研發(fā)中心，湖南 長沙 410008)

盆腔炎性疾病是一組由病原菌引起的感染性和炎癥性疾病，主要發(fā)生在女性生殖道上，病情嚴(yán)重時(shí)會(huì)對(duì)患者的健康生活和生命安全造成重大的威脅[1]。西醫(yī)主要采用抗生素進(jìn)行治療，其對(duì)控制病原體效果明顯，但對(duì)慢性炎癥的作用效果不理想。

盆炎靈合劑是一種中藥制劑，由湖南省婦幼保健院研制，其治療慢性盆腔炎的臨床療效已得到證實(shí)。該制劑包括丹酚酸B、芍藥苷、甘草苷、延胡索乙素、綠原酸、紅景天苷、阿魏酸等有效成分[2]。其性狀為黃棕色液體，味苦微甜，具有清熱解毒、活血化瘀、理氣止痛等功效，臨床常用于治療急慢性盆腔炎、附件炎、子宮內(nèi)膜炎、慢性子宮頸炎、輸卵管不通性不孕癥以及月經(jīng)不調(diào)等。其在臨床上對(duì)慢性盆腔炎有良好的治療效果[2]，已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)盆炎靈合劑對(duì)盆腔炎大鼠具有抗炎作用，能顯著抑制盆腔炎大鼠子宮炎癥的發(fā)生發(fā)展[3]。但其治療盆腔炎性疾病的藥理作用機(jī)制尚不明確，因此本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)對(duì)盆炎靈合劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制進(jìn)行分析，希望為其臨床合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物 盆炎靈合劑由湖南省婦幼保健院提供(湘藥制字Z20070201，250 mL/瓶，批號(hào)20180726)。紅景天苷(批號(hào)110818-201206)、去甲異波爾定(批號(hào)111825-201402)、綠原酸(批號(hào)110753-201314)、芍藥苷(批號(hào)110736-201438)、阿魏酸(批號(hào)110773-201614)、甘草苷(批號(hào)111610-201106)、丹酚酸B(批號(hào)111562-201212)、藁本內(nèi)酯(批號(hào)111737-201204)、甘草酸(批號(hào)110731-201116)、齊墩果酸(批號(hào)110709-201206)對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院；酪氨酸(批號(hào)0215868010)對(duì)照品均購自上海寶曼生物科技有限公司；精氨酸(貨號(hào)B21920)、奎寧酸(貨號(hào)B21879)，枸櫞酸(貨號(hào)B21313)、馬錢苷酸(貨號(hào)B20823)、對(duì)羥基苯丙酸(貨號(hào)B20325)對(duì)照品均購自上海源葉生物科技有限公司。甲醇(批號(hào)1727207407)、乙腈(批號(hào)JA077330)為色譜純，購自德國Merck公司；甲酸(批號(hào)F112034)為分析純，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 動(dòng)物 10只SPF級(jí)9周齡SD雌性大鼠，體質(zhì)量220～240 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(湘)2011-0003，質(zhì)量合格證編號(hào)43004700011989，隨機(jī)分為空白組、給藥組，每組5只，禁食12 h，自由飲水，稱定體質(zhì)量，按每天10 mL/kg劑量分別灌胃給予純化水、盆炎靈合劑，連續(xù)5 d，末次給藥45 min后，腹腔注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉，15 min后心臟取血，迅速對(duì)含EDTA抗凝劑的血液離心(3 000 r/min)5 min，取血漿，置于-80 ℃冰箱中冷凍備用。

1.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱取各對(duì)照品適量，甲醇制成一定質(zhì)量濃度的溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

1.4 血漿樣品處理 將血漿置于4 ℃冰箱中解凍，取給藥組5只大鼠血漿各100 μL，混勻，加入3倍體積的甲醇-乙腈(1∶1)混合溶液，加入內(nèi)標(biāo)渦旋3 min后置于4 ℃冰箱中過夜，進(jìn)行蛋白沉淀，13 000 r/min離心10 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，濾液即為含藥血漿供試品溶液。同法制備空白血漿供試品溶液。

1.5 血中移行成分分析 采用由Agilent 1290 LC系統(tǒng)和Agilent 6540 Q-TOF-MS系統(tǒng)組成的LC-Q-TOF-MS系統(tǒng)(美國安捷倫公司)，對(duì)含藥血漿供試品、空白血漿供試品、對(duì)照品溶液進(jìn)行分析。色譜條件為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(3.0 mm×150 mm，3.5 μm)，流動(dòng)相水(含0.1%甲酸)(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，程序見表1；體積流量0.5 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量5 μL。質(zhì)譜條件為毛細(xì)管電壓3 500 V；噴嘴電壓(Expt)500 V；碎裂能量120 V；氣體溫度250 ℃；鞘氣溫度350 ℃；正負(fù)離子掃描，m/z50～1 250；干燥氣、碰撞氣氮?dú)猓慌鲎材芰?0 V。

表1 梯度洗脫程序

1.6 蛋白靶點(diǎn)篩選 將盆炎靈合劑入血化合物的三維立體結(jié)構(gòu)導(dǎo)入PharmMapper服務(wù)器，采用默認(rèn)參數(shù)對(duì)上述藥物分子的體內(nèi)靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，將反向分子對(duì)接獲得的蛋白信息與DrugBank、TTD、HIT數(shù)據(jù)庫中盆腔炎性疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比和篩選，并利用UniProt數(shù)據(jù)庫將最終得到的靶點(diǎn)名轉(zhuǎn)換為其編碼的基因名。

1.7 入血平移成分?jǐn)?shù)據(jù)庫構(gòu)建 將盆炎靈合劑的入血成分和相關(guān)蛋白通過SYBYL-X7.3軟件進(jìn)行分子對(duì)接，以對(duì)接分值≥6.0作為活性化合物的篩選條件，篩選出具有較高活性的化合物。

1.8 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將活性化合物及相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件，構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.9 蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將相關(guān)靶基因上傳至STRING11.0在線軟件，獲取蛋白相互作用信息，并將打分值>0.7的蛋白相互作用值視為高置信度數(shù)據(jù)，將蛋白相互作用數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并在Excel中對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的蛋白繪制條形圖。

1.10 基因本體(GO)功能富集分析 采用David v6.8數(shù)據(jù)庫，對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進(jìn)行GO生物學(xué)過程富集分析。

1.11 京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 采用David v6.8數(shù)據(jù)庫，對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進(jìn)行KEGG通路富集分析。采用Cytoscape3.7.1軟件，對(duì)KEGG通路富集分析中的信號(hào)通路構(gòu)建靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物篩選 通過SYBYL-X7.3軟件將29種入血成分分別與121個(gè)蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，共篩選出分子對(duì)接分值≥6.0的27個(gè)化合物及110個(gè)相關(guān)蛋白，活性化合物提取離子流圖見圖1，基本信息見表2。

表2 活性化合物基本信息

圖1 活性化合物在正離子(A)、負(fù)離子(B)模式下的提取離子流圖

2.2 盆炎靈合劑化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò) 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)包含137個(gè)節(jié)點(diǎn)(27個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)、110個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn))和812條相互作用連線，見圖2。由此可知，有66.67%的化合物作用靶點(diǎn)≥10個(gè)，≥50個(gè)的有7個(gè)，從化合物角度來看，Degree排名前5位的是SAB、SAA、GI、AR、RH；從靶點(diǎn)角度來看，Degree排名前4位的是白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶(IRAK1)、Toll樣受體8(TLR-8)、Tristetraprolin(TTP)、Rho激酶2(ROCK2)；化合物平均靶點(diǎn)數(shù)目為30.22個(gè)，每個(gè)靶點(diǎn)平均與7.33個(gè)化合物發(fā)生作用。

續(xù)表2

注：藍(lán)色表示化合物，紅色表示靶點(diǎn)。

2.3 盆炎靈合劑靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3)包含75個(gè)節(jié)點(diǎn)，411條邊，其中節(jié)點(diǎn)表示蛋白，每條邊則表示蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系；Degree≥20的節(jié)點(diǎn)包括Toll樣受體4(TLR4)、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT1)、趨化因子CXCL8(CXCL8)、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)、白細(xì)胞介素-4(IL4)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB 1(NFκB1)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)、髓樣分化因子88(MYD88)，其中TLR4、STAT3和IL-6度值最大，分別能與34、33、30個(gè)蛋白發(fā)生相互作用。前30個(gè)關(guān)鍵蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)的Degree所繪制出的條形圖見圖4。

注：洋紅色表示Degree≥30的蛋白，黃色表示20≤Degree<30的蛋白，綠寶石色表示10≤Degree<20的蛋白，深藍(lán)色表示Degree<10的蛋白。

注：數(shù)字表示節(jié)點(diǎn)的Degree。

2.4 GO功能富集分析 根據(jù)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05，確定了123個(gè)GO條目(表3根據(jù)FDR列出前20個(gè))，主要涉及對(duì)細(xì)胞壞死以及凋亡的調(diào)控、多細(xì)胞生物過程的調(diào)控、級(jí)聯(lián)反應(yīng)、有機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、分子功能的調(diào)控、系統(tǒng)過程的調(diào)控等方面，見表3。

表3 盆炎靈合劑PPI網(wǎng)絡(luò)中的GO條目(FDR<0.05)

2.5 KEGG通路富集分析 共得到41條信號(hào)通路，以FDR<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選出12條，包括Toll樣受體信號(hào)通路(Toll-like receptor signaling pathway)、NOD樣受體信號(hào)通路(NOD-like receptor signaling pathway)、Fc epsilon RI信號(hào)通路和JAK-STAT信號(hào)通路(JAK-STAT signaling pathway)等，見表4、圖5。

注：深青色表示蛋白靶點(diǎn)，紅色表示信號(hào)通路ID。

表4 盆炎靈合劑PPI網(wǎng)絡(luò)中的通路(FDR<0.05)

3 討論

盆炎靈合劑作為治療婦科炎癥的中藥制劑，在治療濕熱蘊(yùn)結(jié)、濕熱下注型盆腔炎性疾病方面具有顯著療效[3]。本研究以盆炎靈合劑的27個(gè)活性化合物為基礎(chǔ)，構(gòu)建了化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，其中關(guān)鍵靶點(diǎn)包括IRAK1、TLR-8、TTP等。IRAK1通過參與Toll樣受體和白細(xì)胞介素-1信號(hào)通路，調(diào)節(jié)先天免疫和炎癥[4]。有研究表明，靶向IRAK1可抑制NF-κB通路[5]，而盆炎靈合劑中的成分PE對(duì)IRAK1-NF-κB通路具有抑制作用[6]，可見調(diào)控IRAK1的表達(dá)可以抑制炎癥損傷[7]。TLR8主要對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)化和凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)，同時(shí)還與炎癥和腫瘤等疾病存在緊密聯(lián)系[8-9]。激活TLR8后可介導(dǎo)炎癥免疫，進(jìn)而清除體內(nèi)腫瘤細(xì)胞和受病毒感染的細(xì)胞[10]。TTP在分化、代謝、增殖、炎癥、腫瘤發(fā)生和免疫等多種生理病理過程中發(fā)揮著重要作用[11-14]。TTP介導(dǎo)的NLRP3炎性激活的減少還可以減少慢性炎癥疾病的發(fā)展，例如動(dòng)脈粥樣硬化、結(jié)腸炎和關(guān)節(jié)炎[15]。在PPI網(wǎng)絡(luò)中，TLR4、STAT3和IL-6的Degree遠(yuǎn)高于其它蛋白，其中TLR4在炎癥反應(yīng)及癌癥發(fā)展中扮演著重要的角色[16-19]，被認(rèn)為是連接炎癥與腫瘤微環(huán)境的重要樞紐[20]。通過抑制TLR4/NF-κB和TLR4/MAPK信號(hào)通路可以抑制炎癥反應(yīng)[21]。STAT3在細(xì)胞生長、分化、免疫功能、造血功能和腫瘤相關(guān)炎癥中發(fā)揮重要作用[22-23]。STAT3的持續(xù)激活可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖侵襲、血管增生、免疫抑制、誘導(dǎo)和維持癌前炎性微環(huán)境等病理過程的發(fā)生發(fā)展[24]。因此推測，盆炎靈合劑可能是通過對(duì)這些關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控，從而達(dá)到治療目的。

GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，盆炎靈合劑在治療疾病時(shí)主要涉及有機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、受體活性、細(xì)胞組分等方面，而在KEGG通路富集分析中，基因主要富集到了Toll-like receptor signaling pathway、NOD-like receptor signaling pathway、Fc epsilon RI signaling pathway和Chemokine signaling pathway上。有研究發(fā)現(xiàn)SAB具有良好的抗炎活性，其免疫調(diào)節(jié)作用與抑制TLR4信號(hào)通路有關(guān)[25]。SA能夠顯著地抑制TXNIP的表達(dá)，進(jìn)而降低NLRP3炎癥小體的表達(dá)水平，從而通過NOD樣受體信號(hào)通路中的TXNIP-NLRP3炎癥小體途徑減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞外基質(zhì)的積累[26]。AR的抗炎作用與參與肥大細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)的信號(hào)分子的活化水平降低有關(guān)，例如趨化因子信號(hào)通路中的Akt等[27]。由此推測，盆炎靈合劑可能通過作用于與炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)直接相關(guān)的通路，從而對(duì)炎癥起到治療作用。此外，在與細(xì)胞生長及內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)的通路上也富集到了大量基因，說明盆炎靈合劑的治療作用也與這些通路密切相關(guān)。

綜上所述，本研究對(duì)盆炎靈合劑中入血成分與網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中篩選出的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接分析及網(wǎng)絡(luò)分析，為盆炎靈合劑治療盆腔炎性疾病的作用機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)，下一步將開展細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。