馬齒莧多糖對(duì)糖尿病心肌病大鼠的影響

白 羽， 王 燕， 張心雨， 王寶媛， 郝家樂， 朱思婷， 倪佳楠， 崔桂花， 趙文秀，董樹國， 陶 然

(吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

馬齒莧PortulacaoleraceaL.廣泛分布于溫帶及熱帶地區(qū)，有治療濕疹、丹毒，蛇咬傷、便血等多種作用[1]。其中含有多種化學(xué)成分，尤其是多糖類發(fā)揮了很多的生物作用，例如提高免疫力、抗氧化、抗炎、降血糖等[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)馬齒莧能夠增加大鼠的胰島素敏感性，減少脂代謝的紊亂[4]，預(yù)防因糖尿病引起的血管炎癥[3]。但馬齒莧多糖對(duì)于糖尿病引起的心肌病的影響目前仍無相關(guān)報(bào)道。糖尿病心肌病是糖尿病的一個(gè)重要并發(fā)癥，隨糖尿病人群的增加，其發(fā)生率也在逐年增加。本文通過研究馬齒莧多糖對(duì)糖尿病心肌病的氧化應(yīng)激的影響，為馬齒莧治療糖尿病心肌病奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 血糖儀(德國羅氏公司)；冷凍高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；220 V電泳供電裝置PowerPac、165-8001型伯樂小型垂直電泳槽、221BR Trans-Bolt SD半干轉(zhuǎn)印槽、ChemiDox XRS 凝膠成像系統(tǒng)和DYY-III型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 試劑 馬齒莧多糖，由本實(shí)驗(yàn)室提取所得。羅格列酮(成都恒瑞制藥有限公司)。鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司)；血糖試紙(美國強(qiáng)生公司)；胰島素、膽固醇、甘油三酯、SOD、GSH-Px和MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所)；HE染液(北京諾博萊德生物科技有限公司)；TUNEL試劑盒(德國羅氏公司)；GAPDH抗體(碧云天生物科技有限公司)；Bax、Bcl-2、p-AKT、p-ErbB2和NRG-1(英國Abcam公司)；二抗、BCA蛋白定量和核蛋白提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司)。

1.3 動(dòng)物 ICR小鼠，SPF級(jí)，雄性58只，體質(zhì)量8～22 g，由長春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(吉)2016-0003。

2 方法

2.1 馬齒莧多糖提取 按照朱丹等[5]報(bào)道的方法對(duì)馬齒莧多糖進(jìn)行提取，采用苯酚-硫酸法對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得為16.8%。

2.2 模型制備 將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，選取8只作為空白對(duì)照組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，其余50只給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，4周后給予1% STZ溶液，以30 mg/kg劑量腹腔注射，空腹血糖≥11.1 mmol/L為造模成功。在造模成功的大鼠中選取40只，隨機(jī)分成5組，空白對(duì)照組腹腔注射同等劑量的檸檬酸鈉緩沖液。

2.3 分組及給藥 將造模大鼠分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、陽性對(duì)照組，低、中、高劑量組每日分別給予100、200、300 mg/kg馬齒莧多糖灌胃，陽性對(duì)照組給予羅格列酮3 mg灌胃，空白對(duì)照組和模型組給予蒸餾水灌胃；空白對(duì)照組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，其余各組給予高脂高糖飼料，均持續(xù)4周。

2.4 空腹血糖、血胰島素、甘油三酯及膽固醇測(cè)定 各組大鼠脊椎脫臼法處死，斷頭采血，肝素抗凝后3 000 r/min離心10 min，分離血清，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。打開胸腔，取出心臟，生理鹽水反復(fù)沖洗，濾紙吸干水分，剝離包膜，橫切為兩半，一半-80 ℃冰箱凍存，另一半甲醛固定，石蠟包埋，進(jìn)行病理學(xué)研究。按照試劑盒說明書，檢測(cè)血清中空腹血糖、血胰島素、甘油三酯及甘露醇的水平。

2.5 心肌組織SOD活性、GSH-Px活性、MDA水平測(cè)定 將“2.4”項(xiàng)下凍存的大鼠心肌組織取出，按試劑盒說明書步驟測(cè)定心肌組織SOD活性、GSH-Px活性、MDA水平。

2.6 HE染色 將甲醛固定、石蠟包埋好的心肌進(jìn)行切片并脫蠟，采用從高到低體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)切片進(jìn)行水化，蒸餾水沖洗，切片放入蘇木精染色液中染色20 min，蒸餾水沖洗，之后放入1%鹽酸乙醇中，約10 s后取出，蒸餾水沖洗。乙醇梯度脫水后放入伊紅染色液中染色2 min，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，用顯微鏡進(jìn)行觀察。

2.7 TUNEL染色 將石蠟包埋好的心臟組織進(jìn)行切片，放入二甲苯溶液中脫蠟，采用從高到低濃度的乙醇對(duì)切片進(jìn)行水化，蒸餾水沖洗后磷酸緩沖液沖洗3次，加TUNEL試劑，37 ℃避光孵育1 h，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.8 Western blots檢測(cè)蛋白表達(dá) 取凍存的心臟組織于冰上剪碎，放入試管中，加入裂解液冰浴20 min，13 000 r/min離心10 min，取上清，注入分離膠，凝聚后上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，置于電轉(zhuǎn)槽中，270 mA恒流電轉(zhuǎn)90 min至PVDF膜，一抗孵育，置于4 ℃冰箱過夜，常溫二抗孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，化學(xué)發(fā)光法顯色，進(jìn)行灰度分析。

3 結(jié)果

3.1 空腹血糖 圖1顯示，給予高脂高糖飲食飼養(yǎng)的各組大鼠空腹血糖比空白對(duì)照組增高(P<0.05)，說明糖尿病模型建立成功；與模型組比較，馬齒莧多糖低、中、高劑量組和陽性對(duì)照組血糖降低(P<0.05)；與低劑量組比較，馬齒莧多糖高劑量組、陽性對(duì)照組空腹血糖降低(P<0.05)，而馬齒莧多糖中劑量、高劑量、陽性對(duì)照組無差異。

注：與空白對(duì)照組比較，●P<0.05；與模型組比較，★P<0.05；與低劑量組比較，▲P<0.05。

3.2 血胰島素 圖2顯示，與空白對(duì)照組比較，其他各組大鼠血清胰島素水平增高(P<0.05)，而馬齒莧多糖中、高劑量組，陽性對(duì)照組胰島素水平與模型組比較均降低(P<0.05)；馬齒莧多糖高劑量、陽性對(duì)照組與低劑量組比較，胰島素水平均降低(P<0.05)。

注：與空白對(duì)照組比較，●P<0.05；與模型組比較，★P<0.05；與低劑量組比較，▲P<0.05。

3.3 總膽固醇 圖3顯示，模型組、低劑量組大鼠總膽固醇與空白對(duì)照組比較均增加(P<0.05)；與模型組比較，中、高劑量組，陽性對(duì)照組總膽固醇水平減少(P<0.05)，而陽性對(duì)照組與馬齒莧多糖各劑量組無顯著差異(P>0.05)；與低劑量組比較，高劑量組總膽固醇水平降低(P<0.05)。

注：與空白對(duì)照組比較，●P<0.05；與模型組比較，★P<0.05；與低劑量組比較，▲P<0.05。

3.4 甘油三酯 圖4顯示，模型組大鼠甘油三酯水平與空白對(duì)照組比較升高(P<0.05)；與模型組比較，中、高劑量組大鼠甘油三酯水平減少(P<0.05)，而高劑量組與低劑量組比較降低(P<0.05)。

注：與空白對(duì)照組比較，●P<0.05；與模型組比較，★P<0.05；與低劑量組比較，▲P<0.05。

3.5 SOD活性 圖5顯示，模型組大鼠SOD活性與空白對(duì)照組比較減少(P<0.05)，而中、高劑量組增加(P<0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組大鼠SOD活性均增加(P<0.05)；高劑量組大鼠SOD活性與低劑量比較增加(P<0.05)；陽性對(duì)照組大鼠SOD活性與僅與模型組比較增加(P<0.05)。

注：與空白對(duì)照組比較，●P<0.05；與模型組比較，★P<0.05；與低劑量組比較，▲P<0.05。

3.6 GSH-Px活性 圖6顯示，模型組、低劑量組大鼠與空白對(duì)照組比較GSH-Px活性減少(P<0.05)；低、中、高劑量組大鼠GSH-Px活性與模型組比較增加(P<0.05)，但中、高劑量與空白對(duì)照組比較無顯著差異(P>0.05)；高劑量組大鼠GSH-Px活性與低劑量組比較增加(P<0.05)；陽性對(duì)照組大鼠GSH-Px活性與模型組、低劑量比較增加(P<0.05)。

注：與空白對(duì)照組比較，●P<0.05；與模型組比較，★P<0.05；與低劑量組比較，▲P<0.05。

3.7 MDA水平 圖7顯示，與空白對(duì)照組比較其余各組大鼠MDA水平均增加(P<0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組和陽性對(duì)照組大鼠MDA水平減少(P<0.05)，其中高劑量組低于低劑量組(P<0.05)。

注：與空白對(duì)照組比較，●P<0.05；與模型組比較，★P<0.05；與低劑量組比較，▲P<0.05。

3.8 HE染色 圖8顯示，空白對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核清晰可見；模型組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核深染，細(xì)胞膨脹變大，細(xì)胞間質(zhì)明顯纖維化，伴有炎癥細(xì)胞的浸潤；馬齒莧多糖由低劑量向高劑量過渡時(shí)，可見大鼠細(xì)胞的排列逐漸整齊，形態(tài)也逐漸向空白對(duì)照對(duì)照組靠近，肥大、膨脹的細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，核染色清晰，浸潤的炎性細(xì)胞減少；陽性對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞也有一定程度排列紊亂、細(xì)胞核深染、細(xì)胞膨大，但較模型組略好。

圖8 各組大鼠心肌組織的HE染色(×100)

3.9 TUNEL染色 圖9顯示，與空白對(duì)照組比較，其余各組大鼠TUNEL染色陽性的細(xì)胞數(shù)目增加(P<0.05)，隨著馬齒莧多糖濃度的增加，TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)目逐漸減少(P<0.05)；陽性對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況與高劑量組比較增加(P<0.05)，而與低、中劑量組比較無顯著差異(P>0.05)。

注：與空白對(duì)照組比較，●P<0.05；與模型組比較，★P<0.05；與低劑量組比較，▲P<0.05；與中劑量組比較，■P<0.05；與高劑量組比較，▼P<0.05。

3.10 Western blot檢測(cè) 圖10顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組、低劑量組、中劑量組、陽性對(duì)照組大鼠Bax表達(dá)增加(P<0.05)，而高劑量組與空白對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)；中、高劑量組大鼠Bax表達(dá)與模型組、低劑量組比較減少(P<0.05)；低、中、高劑量組與陽性對(duì)照組比較減少(P<0.05)；模型組、低劑量組、中劑量組、陽性對(duì)照組大鼠Bcl-2、NRG-1的表達(dá)減少(P<0.05)；而高劑量組與空白對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)，高劑量組大鼠Bcl-2與模型組、低、中劑量組比較增加(P<0.05)，高劑量組與陽性對(duì)照組比較增加(P<0.05)。與模型組比較，低、中、高劑量組、陽性對(duì)照組大鼠NRG-1增加(P<0.05)；中、高劑量組比低劑量組增加(P<0.05)；陽性對(duì)照組大鼠NRG-1與其他各組(除低劑量組外)比較具有顯著差異(P<0.05)，與空白對(duì)照組比較，其余各組大鼠p-AKT、p-ErbB2增加(P<0.05)；陽性對(duì)照組大鼠p-AKT、p-ErbB2表達(dá)與中、高劑量組比較減少(P<0.05)；中、高劑量組大鼠p-AKT、p-ErbB2表達(dá)較低劑量組、模型組增加(P<0.05)。

注：與空白對(duì)照組比較，●P<0.05；與模型組比較，★P<0.05；與低劑量組比較，▲P<0.05；與中劑量組比較，■P<0.05；與高劑量組比較，▼P<0.05。

4 討論

糖尿病是一種多因素綜合作用的代謝性疾病，而且能夠引發(fā)心、腎、腦、肝、神經(jīng)等多臟器的急、慢性并發(fā)癥。預(yù)計(jì)2030年我國的糖尿病患者將達(dá)到1.3億[6]，面對(duì)逐年增加的糖尿病患者，社區(qū)糖尿病健康管理的任務(wù)不容樂觀[7]。目前已知的降糖藥物在控制血糖方面收效顯著，但是對(duì)于防止糖尿病并發(fā)癥方面仍不盡如人意。馬齒莧多糖的降糖[8-10]、降脂作用[11-13]在之前的研究中已經(jīng)得到了很好的證實(shí)。本文首先復(fù)制了糖尿病大鼠模型，并觀察了不同劑量馬齒莧多糖對(duì)模型大鼠血清中空腹血糖、胰島素水平、膽固醇及甘油三酯水平的影響，并與羅格列酮的陽性對(duì)照組進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同劑量的馬齒莧多糖灌胃后大鼠血清中各項(xiàng)指標(biāo)存在的差異，高劑量組較低劑量組具有明顯的降糖及降脂的作用。之前的研究證實(shí)糖尿病的心肌病變與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等有著密不可分的聯(lián)系[14]。模型組的大鼠心肌組織中SOD活性、GSH-Px活性較空白組減少，而MDA較空白組增加，證實(shí)了糖尿病大鼠心肌病變的過程中存在著氧化應(yīng)激的參與。給予不同劑量的馬齒莧多糖灌胃后心肌組織中的SOD、GSH-Px活性增加，而MDA水平減少，且高劑量組比低劑量組作用更加明顯。通過HE和TUNEL染色了解馬齒莧多糖對(duì)糖尿病大鼠心肌組織的干預(yù)作用。可見無論細(xì)胞形態(tài)及凋亡情況，都通過馬齒莧多糖的作用而得到改善。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2家族中促凋亡的Bax表達(dá)隨馬齒莧多糖劑量的增加而逐漸減少。Bcl-2蛋白表達(dá)與其相反，說明馬齒莧多糖能夠抑制心肌細(xì)胞的凋亡。心肌組織中NRG-1與ErbB受體結(jié)合后使C-末端的酪氨酸磷酸化，進(jìn)而激活PI3K，可減少線粒體中ROS的生成，最后抑制線粒體凋亡通路的激活[15]。通過Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨馬齒莧多糖劑量增加可以升高p-AKT、p-ErbB2、NRG-1，有利于減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。綜上所述馬齒莧多糖不僅能夠調(diào)節(jié)糖尿病大鼠血糖及血脂，同時(shí)能夠通過作用于NRG-1/ErbB受體減少ROS，進(jìn)而抑制線粒體凋亡通路抑制心肌細(xì)胞凋亡。為馬齒莧多糖保護(hù)心肌細(xì)胞的作用奠定了理論基礎(chǔ)。