復(fù)方黑骨藤有效組分抗類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用及分子機(jī)制

李佳俊， 張 宏,2， 李克娟， 陳 秀， 李 琪,2*

(1.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610101；2.四川師范大學(xué)植物功能基因組及生物信息學(xué)研究中心，四川 成都 610101)

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為主要特征的自身免疫疾病，其病理學(xué)改變包括滑膜增生、軟骨破壞及血管翳形成等。該病病程較長(zhǎng)，可發(fā)生在各個(gè)年齡段，并以女性多見(jiàn)[1]，其高致殘性嚴(yán)重影響了患者的正常生活。復(fù)方黑骨藤由黑骨藤、秦艽、延胡索3味中藥組成，具有清熱解毒、活血化瘀之功效，是民間用于治療RA的經(jīng)典方劑。目前對(duì)于復(fù)方黑骨藤治療RA的藥理研究大多集中在粗提物層面，難以闡明藥物發(fā)揮治療作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用模式。本課題組在前期實(shí)驗(yàn)已分別篩選出黑骨藤、秦艽、延胡索各單味藥的抗炎有效部位，并測(cè)定了各抗炎有效部位的純度，均在45%以上[2-4]。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合中藥復(fù)方有效成分組學(xué)[5]的研究思路，本實(shí)驗(yàn)將該復(fù)方中各單味藥有效部位以適當(dāng)比例重新混合為復(fù)方黑骨藤有效組分(the effective components ofPeriplocaforrestiiSchltr. Compound，EC-PFSC)，擬通過(guò)小鼠耳腫脹和足腫脹兩種急性炎癥模型進(jìn)行EC-PFSC最優(yōu)抗炎劑量篩選，再選用與人類(lèi)RA病理變化高度相似的膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)動(dòng)物模型[6]，觀察其治療作用并結(jié)合絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白及相關(guān)炎癥介質(zhì)的表達(dá)，進(jìn)一步探討EC-PFSC抗RA的可能分子作用機(jī)制，為該藥物的深入開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材與藥物 黑骨藤于2017年購(gòu)于西昌藥材市場(chǎng)，秦艽(批號(hào)20180527)、延胡索(批號(hào)20180629)購(gòu)于北京同仁堂，經(jīng)四川師范大學(xué)嚴(yán)偉教授鑒定均為正品。雷公藤多苷片(批號(hào)20180501，10 mg/片，遠(yuǎn)大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司)。

1.2 試劑 對(duì)照品新綠原酸、綠原酸、延胡索乙素、異綠原酸C、脫氫紫堇堿、延胡索甲素、原阿片堿均購(gòu)于成都瑞芬思生物科技有限公司，隱綠原酸、原花青素A1、原花青素A2均購(gòu)于深圳市斯坦德合成有限公司，馬錢(qián)苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、龍膽苦苷、杠柳毒苷均購(gòu)于成都普思生物科技有限公司。二甲苯(成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)20150125)；角叉菜膠(批號(hào)22049-5G-F)、弗氏完全佐劑(F5881)均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；PBS緩沖液(批號(hào)ZLI-9062)、生物素化山羊抗兔IgG二抗(貨號(hào)SP-9001)均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司，批號(hào)201903)；一氧化氮(nitric oxide，NO)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20190327)；牛Ⅱ型膠原蛋白(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)S12008)；兔多克隆誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)抗體(武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司，貨號(hào)A0312)；兔多克隆抗體caspase3(批號(hào)GB11009-1)、β-actin(貨號(hào)GB12001)、兔多克隆環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)抗體(貨號(hào)GB11077-2)、HRP標(biāo)記山羊抗兔(貨號(hào)GB23303)、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠(貨號(hào)GB23301)、5×蛋白上樣緩沖液(貨號(hào)G2013)、磷酸化蛋白酶抑制劑(貨號(hào)G2007)、RNA提取液(貨號(hào)G3013)、SYBR? Green Fast qPCR Mix(貨號(hào)G3008)均購(gòu)于武漢賽維爾生物科技有限公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(貨號(hào)#K1622)、蛋白Marker(貨號(hào)26616)均購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase，P-ERK)抗體(貨號(hào)4370)、磷酸化p38(phosphorylated p38，P-p38)抗體(貨號(hào)4511)均購(gòu)于美國(guó)CST公司；D-101大孔樹(shù)脂(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)。甲醇為色譜純；乙醇、磷酸為分析純。

1.3 動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(18±2)g，4周齡；SPF級(jí)Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量(120±10)g，5周齡，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(川)2015-030。分籠飼養(yǎng)，室溫(22±2)℃，相對(duì)濕度60%～65%，定時(shí)換氣，自由進(jìn)食飲水。

1.4 儀器 M01000101游標(biāo)卡尺(成都量具刃具股份有限公司)；Model 680酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；RM2016轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司)；TSJ-Ⅱ全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)、PHY-Ⅲ病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司)；BMJ-Ⅲ包埋機(jī)(常州郊區(qū)中威電子儀器廠)；BA400Digital數(shù)碼三目攝像顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)；Stepone plus熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；ACQUITY H-Class超高相液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；YRE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(予華儀器有限責(zé)任公司)；VIRTIS冷凍干燥機(jī)(美國(guó)Virtis公司)。

2 方法

2.1 藥物制備 分別取黑骨藤、秦艽、延胡索藥材適量，各采用50 ℃超聲、80 ℃回流、75 ℃超聲以1∶20、1∶20、1∶25的料液比加入50%乙醇提取，重復(fù)3次，每次1 h，再分別合并各提取液，過(guò)濾，濃縮，后分別上樣于D101大孔吸附樹(shù)脂，黑骨藤收集10個(gè)柱體積20%乙醇洗脫液，秦艽收集15個(gè)柱體積10%乙醇洗脫液，延胡索先收集10個(gè)柱體積30%乙醇洗脫液，再收集10個(gè)柱體積95%乙醇洗脫液，各藥物洗脫液分別減壓濃縮，冷凍干燥，即得黑骨藤有效部位干粉(得率4%)、秦艽有效部位干粉(得率9.94%)、延胡索有效部位干粉(得率2.51%)。參照課題組前期所篩選的最佳抗炎藥液質(zhì)量濃度[黑骨藤有效部位(4.57 mg/mL)、秦艽有效部位(50 mg/mL)、延胡索有效部位(0.96 mg/mL)]，將黑骨藤、秦艽、延胡索各有效部位干粉以4.8∶52.1∶1的質(zhì)量比用蒸餾水配制成EC-PFSC高劑量組藥液(55.53 mg/mL)，即3種有效部位的終質(zhì)量濃度均為其最佳抗炎藥液濃度，再依次用蒸餾水半倍稀釋配制成中劑量(27.80 mg/mL)、低劑量(14.05 mg/mL)組藥液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。將黑骨藤、秦艽、延胡索?.5∶1∶1的比例混勻，打磨成粉，過(guò)篩，50%乙醇80 ℃回流提取3次(料液比1∶40)，每次1 h，合并提取液，減壓濃縮，冷凍干燥，即得傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤提取物干粉。稱(chēng)取適量用蒸餾水配制成給藥所需濃度的傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤藥液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。另取雷公藤多苷片適量，加蒸餾水配制成4.0 mg/mL藥液，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 EC-PFSC劑量篩選

2.2.1 對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的作用 取小鼠84只，雌雄各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，將動(dòng)物隨機(jī)分為空白組、模型組、雷公藤組(40.0 mg/kg)、傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤組(322.0 mg/kg，以傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤提取物干粉重量計(jì))及EC-PFSC高、中、低劑量(555.3、278.0、140.5 mg/kg，以混合有效組分干粉重量計(jì))組，每組12只(雌雄各半)。各給藥組對(duì)應(yīng)給藥，空白組、模型組給予生理鹽水；各組灌胃給藥容量均為10 mL/kg，每天1次，連續(xù)7 d。除空白組外，末次給藥1 h后，每只小鼠右耳前后兩面涂50 μL二甲苯致炎，左耳作對(duì)照。30 min后將小鼠斷頸處死，剪下左右耳，在同一位置用打孔器打下等大的圓形耳片，稱(chēng)定質(zhì)量，計(jì)算耳腫脹度和耳腫脹抑制率。耳腫脹度=右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量，耳腫脹抑制率=[(模型組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/模型組平均腫脹度]×100%。

2.2.2 對(duì)角叉菜膠致小鼠足腫脹的作用 分組與灌胃劑量參考“2.2.1”項(xiàng)。除空白組外，末次給藥1 h后，每只小鼠右后足中部皮下注射30 μL 1%角叉菜膠致炎。致炎4 h后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠右后足腫脹厚度，計(jì)算足腫脹率和足腫脹抑制率。足腫脹率=[(造模后右后足厚度-造模前右后足厚度)/造模前右后足厚度]×100%，足腫脹抑制率=[(模型組平均足腫脹率-給藥組平均足腫脹率)/模型組平均足腫脹率]×100%。

2.2.3 ELISA法檢測(cè)小鼠致炎足中PGE2和NO水平 “2.2.2”項(xiàng)下操作完成后，迅速剪下小鼠致炎足，剝皮、剪碎后用勻漿機(jī)粉碎，在生理鹽水中浸泡1 h，離心，取上清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定PGE2、NO水平。

2.3 EC-PFSC對(duì)CIA大鼠的作用

2.3.1 造模、分組及給藥 取健康雄性大鼠50只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)選10只作為空白組。其余參照文獻(xiàn)[7]建造CIA模型。造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、雷公藤組(40.0 mg/kg)、傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤組(230.0 mg/kg，以傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤提取物干粉重量計(jì))、EC-PFSC組(194.6 mg/kg，以混合有效組分干粉重量計(jì))，每組10只，其中2個(gè)實(shí)驗(yàn)組劑量分別由小鼠傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤組和EC-PFSC中劑量組按人和動(dòng)物間體表面積換算為大鼠劑量而得。造模21 d后，各給藥組對(duì)應(yīng)給藥，空白組、模型組給予生理鹽水，各組灌胃給藥容量均為10 mL/kg，每天1次，連續(xù)28 d。

2.3.2 一般指標(biāo)檢測(cè) 于造模前一天及造模后第7天開(kāi)始，用游標(biāo)卡尺測(cè)量大鼠右足趾厚度(它與左足趾厚度的差值作為腫脹度，mm)，每隔7 d記錄腫脹情況及體質(zhì)量。

2.3.3 關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index，AI)評(píng)分 造模后第7天開(kāi)始，定期觀察并記錄全身關(guān)節(jié)病變程度，每4 d 1次，按5級(jí)評(píng)分法評(píng)價(jià)[8](0分，無(wú)紅腫；1分，趾關(guān)節(jié)紅腫；2分，趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹；3分，趾關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹)，將4個(gè)關(guān)節(jié)的積分累計(jì)起來(lái)，即為每只大鼠的AI。

2.3.4 免疫組化法檢測(cè)caspase3表達(dá) 于實(shí)驗(yàn)第49天后處死各組大鼠，無(wú)菌條件下取右踝關(guān)節(jié)，剔除多余的肌肉組織，10%甲醛固定，脫水，包埋，切片。按照免疫組化試劑盒操作步驟檢測(cè)caspase3表達(dá)。免疫組化切片底色為白色，陽(yáng)性表達(dá)為淺黃色或棕黃色(表達(dá)于細(xì)胞漿、細(xì)胞膜，或間質(zhì))，陰性表達(dá)為藍(lán)色。圖像采集(BA200Digital 數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng))為100倍下觀察全部組織，400倍下選取1個(gè)視野采集圖像。圖像的平均光密度通過(guò)Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野取其平均值。

2.3.5 Western blot法檢測(cè)iNOS、COX-2、P-ERK、P-p38蛋白表達(dá) 取研碎后的大鼠右踝關(guān)節(jié)適量，加10倍組織體積裂解液勻漿，冰上裂解，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離總蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，封閉1 h后，分別加入相應(yīng)一抗，4 ℃過(guò)夜。TBST洗滌3次，每次10 min，加入二抗(1∶3 000)，室溫孵育30 min，TBST洗滌3次，每次10 min，加入ECL，使膜與顯色液充分接觸反應(yīng)1～2 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值，結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示。

2.3.6 RT-qPCR法檢測(cè)caspase3、iNOS、COX-2 mRNA表達(dá) 取研碎后的大鼠右踝關(guān)節(jié)100 mg，Trizol法提取總RNA，并測(cè)定其濃度與純度，取純度好的樣品按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。PCR反應(yīng)體系為25 μL，擴(kuò)增條件為預(yù)變性95 ℃，10 min；循環(huán)(40次)95 ℃，15 s～60 ℃，60 s；熔解曲線60 ℃～95 ℃，每15 s升溫0.3 ℃，結(jié)果以β-actin基因作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物序列見(jiàn)表1。

表1 熒光定量PCR引物序列

2.4 UPLC法測(cè)定EC-PFSC中14種有效化合物

2.4.1 供試品溶液制備 分別稱(chēng)取“2.1”項(xiàng)下黑骨藤、秦艽、延胡索各有效部位和傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤提取物干粉適量，50%甲醇各定容于10 mL量瓶，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得EC-PFSC組分溶液(1.10 mg/mL)和傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤提取物溶液(1.75 mg/mL)。

2.4.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、馬錢(qián)苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、原花青素A1、原花青素A2、原阿片堿、延胡索乙素、異綠原酸C、脫氫紫堇堿、延胡索甲素、杠柳毒苷、龍膽苦苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL分別含0.430、0.346、0.224、0.184、0.285、0.295、0.320、0.143、0.353、0.243、0.223、0.183、0.354、2.462 mg的溶液，搖勻，即得。

2.4.3 色譜條件 ACQUITY UPLC? BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相磷酸(pH=3.0)(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～10 min，95%～75%A；10～25 min，75%～60%A；25～30 min，60%～40%A；30～40 min，40%～0A)；體積流量0.3 mL/min；柱溫45 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)221 nm；進(jìn)樣量1 μL。

3 結(jié)果

3.1 EC-PFSC不同劑量對(duì)小鼠耳腫脹的影響 表2顯示，與模型組比較，雷公藤組、傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤組和EC-PFSC高、中劑量組均可降低小鼠耳腫脹度(P<0.01)，其中EC-PFSC高、中劑量組耳腫脹抑制率分別為30.46%和32.32%，與傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤組(31.90%)接近。

表2 EC-PFSC對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

3.2 EC-PFSC不同劑量對(duì)小鼠足腫脹的影響 表3顯示，與模型組比較，其他各組均可抑制小鼠足腫脹度(P<0.05，P<0.01)，其中EC-PFSC中劑量組抑制作用較好，腫脹抑制率可達(dá)29.42%，高于EC-PFSC高劑量組(19.62%)和傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤組(18.94%)。

表3 EC-PFSC對(duì)角叉菜膠致小鼠足腫脹的影響

3.3 EC-PFSC不同劑量對(duì)小鼠致炎足中PGE2、NO水平的影響 圖1顯示，與空白組比較，模型組和傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤組小鼠腫脹足組織中PGE2、NO水平均增加(P<0.05，P<0.01)，表明炎癥反應(yīng)劇烈；與模型組和傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤組比較，EC-PFSC高、中劑量組小鼠腫脹足組織中PGE2、NO水平均降低(P<0.01)，其中EC-PFSC中劑量組PGE2、NO降低率分別為40%和20%，與雷公藤組PGE2、NO降低率相當(dāng)。以上結(jié)果提示EC-PFSC中劑量組抗炎藥效最優(yōu)，因此選擇278.0 mg/kg作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)劑量。

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤組比較，△△P<0.01。

3.4 EC-PFSC對(duì)CIA大鼠體質(zhì)量、足腫脹度、AI的影響 圖2顯示，二次致炎(第7天)前，各組大鼠體質(zhì)量無(wú)明顯差異(P>0.05)，二次致炎(第7天)后至灌胃給藥(第21天)前，與空白組比較，各造模組大鼠體質(zhì)量下降(P<0.01)，足腫脹度和AI評(píng)分升高(P<0.01)，表明造模成功。灌胃給藥(第21天)后，與模型組比較，傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤組和EC-PFSC組隨著給藥時(shí)間的增加均可在一定程度上緩解大鼠體質(zhì)量的減輕、抑制足腫脹度的增加及降低AI評(píng)分，在第49天時(shí)，與傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤組比較，EC-PFSC組大鼠足腫脹度和AI評(píng)分降低(P<0.05)。以上分析結(jié)果提示EC-PFSC對(duì)CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎有一定抑制效果，而且不良反應(yīng)較小。

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤組比較，△P<0.05。

3.5 EC-PFSC對(duì)CIA大鼠踝關(guān)節(jié)中caspase3蛋白和mRNA表達(dá)的影響 圖3顯示，與空白組比較，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)中caspase3蛋白和mRNA表達(dá)均降低(P<0.01)；與模型組比較，EC-PFSC組大鼠踝關(guān)節(jié)中caspase3蛋白和mRNA表達(dá)升高(P<0.01)，其平均光密度值可達(dá)0.307，與空白組相當(dāng)，且與傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤組比較，EC-PFSC組大鼠踝關(guān)節(jié)中caspase3蛋白和mRNA表達(dá)均升高(P<0.01)，提示EC-PFSC可升高CIA大鼠踝關(guān)節(jié)中caspase3蛋白和mRNA的表達(dá)。圖4顯示，各組CIA大鼠免疫組化切片可見(jiàn)caspase3陽(yáng)性表達(dá)為黃色，陰性表達(dá)為藍(lán)色；空白組caspase3表達(dá)最高，其次是EC-PFSC組，而模型組表達(dá)明顯降低。變化規(guī)律與圖3A基本一致。

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤組比較，△△P<0.01。

圖4 各組大鼠踝關(guān)節(jié)caspase3免疫組化染色(×400)

3.6 EC-PFSC對(duì)CIA大鼠踝關(guān)節(jié)中P-ERK、P-p38蛋白表達(dá)的影響 圖5顯示，與空白組比較，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)中P-ERK、P-p38蛋白表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，EC-PFSC組、傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤組和雷公藤組大鼠踝關(guān)節(jié)中P-ERK、P-p38蛋白表達(dá)均降低(P<0.05，P<0.01)，其中EC-PFSC組大鼠踝關(guān)節(jié)中P-ERK、P-p38降低率分別達(dá)89%和47%，提示EC-PFSC可使CIA大鼠踝關(guān)節(jié)中過(guò)表達(dá)的P-ERK、P-p38蛋白水平得到有效恢復(fù)。

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.7 EC-PFSC對(duì)CIA大鼠踝關(guān)節(jié)中iNOS、COX-2蛋白和mRNA表達(dá)的影響 圖6顯示，與空白組比較，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)中iNOS、COX-2蛋白和mRNA表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，EC-PFSC組、傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤組和雷公藤組大鼠踝關(guān)節(jié)中iNOS、COX-2蛋白和mRNA表達(dá)均降低(P<0.05，P<0.01)，且與傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤組比較，EC-PFSC組大鼠踝關(guān)節(jié)中iNOS、COX-2蛋白表達(dá)均降低(P<0.05，P<0.01)，提示EC-PFSC可有效抑制CIA大鼠踝關(guān)節(jié)中iNOS、COX-2蛋白和mRNA的表達(dá)。

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

3.8 UPLC檢測(cè)分析結(jié)果 圖7顯示，在221 nm波長(zhǎng)處，色譜峰雜質(zhì)干擾較少，體現(xiàn)的信息最完整，分離效果最好。根據(jù)14種有效化合物最大吸收光譜，在不同波長(zhǎng)條件下測(cè)定其峰面積，外標(biāo)法計(jì)算含量。表4顯示，與傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤提取物比較，EC-PFSC組分中有效化合物總含量明顯升高，達(dá)49.03%，提示EC-PFSC組分達(dá)到了富集效果，其中環(huán)烯醚帖類(lèi)化合物含量占比達(dá)40.73%。

1.新綠原酸 2.綠原酸 3.隱綠原酸 4.馬錢(qián)苷酸 5.6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷 6.原花青素A1 7.龍膽苦苷 8.原花青素A2 9.原阿片堿 10.延胡索乙素 11.異綠原酸C 12.脫氫紫堇堿 13.延胡索甲素 14．杠柳毒苷

表4 樣品中14種有效化合物總含量

4 討論

二甲苯致小鼠耳腫脹和角叉菜膠致小鼠足腫脹是兩種經(jīng)典急性炎癥動(dòng)物模型，常用以評(píng)價(jià)中藥抗炎活性，故本研究首先選用這兩種模型篩選EC-PFSC抗炎最佳劑量，該兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EC-PFSC中劑量組減輕小鼠耳腫脹和足腫脹程度較明顯。PGE2可促進(jìn)組織的紅、腫、熱、痛，具有血管擴(kuò)張劑和增加血管通透性的作用[9]，是急性炎癥早期的典型病理改變[10]，NO過(guò)表達(dá)會(huì)引起組織和細(xì)胞損傷，加重炎癥反應(yīng)[11]。因此，選擇PGE2、NO作為抗炎藥效篩選的評(píng)價(jià)指標(biāo)，具有一定的代表意義。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EC-PFSC能抑制炎癥介質(zhì)NO和PGE2的釋放，且EC-PFSC中劑量組協(xié)同增效作用最佳，這與前面小鼠耳腫脹和足腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選定EC-PFSC中劑量(278.0 mg/kg)進(jìn)行抗RA機(jī)制研究。

caspase3通常以非活性酶原形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，在轉(zhuǎn)錄、翻譯等水平調(diào)控細(xì)胞凋亡，然而炎癥的發(fā)生與凋亡息息相關(guān)。當(dāng)巨噬細(xì)胞吞噬、消化凋亡過(guò)程中形成的凋亡小體后，凋亡小體內(nèi)容物則不會(huì)外溢，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)[12]。免疫組化和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EC-PFSC組caspase3蛋白和mRNA表達(dá)升高，且藥效優(yōu)于傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤組，說(shuō)明EC-PFSC可上調(diào)caspase3表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而起到炎癥保護(hù)作用。

MAPKs信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵途徑之一，活化后可介導(dǎo)胞外信號(hào)刺激傳入胞內(nèi)，參與調(diào)節(jié)炎癥、凋亡、增殖和分化等多種重要生理過(guò)程[13]。ERK、p38和JNK是參與炎癥反應(yīng)的主要MAPKs家族成員[14]，其中ERK和p38在真核細(xì)胞中主要以磷酸化形式存在，近年來(lái)作為RA潛在的重要信號(hào)分子受到關(guān)注。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EC-PFSC組P-ERK和P-p38蛋白表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明EC-PFSC可抑制ERK和p38的過(guò)度磷酸化，從而抑制MAPKs信號(hào)通路的激活，達(dá)到減緩炎癥發(fā)展的效果。

有毒介質(zhì)NO的水平與炎癥疾病的發(fā)生密切相關(guān)，其表達(dá)受iNOS的調(diào)控，因此iNOS是炎癥過(guò)程中的關(guān)鍵酶[15]，炎癥反應(yīng)檢測(cè)的一個(gè)重要指標(biāo)[16]。COX-2一般在正常組織中活性較低，受到外界刺激時(shí)可快速應(yīng)答一些促炎因子(如PGE2)，因此被認(rèn)為是炎癥發(fā)生過(guò)程中的重要角色[17]。Western blot和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EC-PFSC組可抑制iNOS、COX-2蛋白和mRNA的過(guò)表達(dá)，且EC-PFSC組對(duì)iNOS、COX-2蛋白表達(dá)的抑制作用優(yōu)于傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤組，說(shuō)明EC-PFSC可通過(guò)下調(diào)炎癥介質(zhì)iNOS、COX-2的表達(dá)，以抑制炎性因子的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗炎作用。

相關(guān)藥理研究表明，綠原酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、環(huán)烯醚帖類(lèi)、生物堿類(lèi)等有效成分對(duì)抗RA有促進(jìn)作用[18-21]，且UPLC檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)EC-PFSC組分中14種有效化合物總含量高于傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤提取物，進(jìn)一步驗(yàn)證了富集之后的EC-PFSC對(duì)比傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤有更為顯著的抗炎藥效。

綜上，復(fù)方黑骨藤有效組分(EC-PFSC)對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有一定的治療作用，其作用機(jī)制可能與抑制MAPKs信號(hào)通路中ERK和p38的過(guò)度磷酸化，進(jìn)而抑制下游分子iNOS、COX-2的高表達(dá)，降低炎癥因子的過(guò)量分泌，同時(shí)激活凋亡因子caspase3的表達(dá)，平衡細(xì)胞增殖與凋亡有關(guān)。