蘆薈大黃素抑制肝癌細(xì)胞增殖與遷移的機(jī)制

譚章斌， 徐由財(cái)， 丁文俊， 鄧穗暉， 劉 彬， 張競(jìng)之

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 廣州 510260)

肝癌是最普遍和最具侵略性的惡性腫瘤之一，大多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，并發(fā)生局部入侵或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去了根治性手術(shù)的機(jī)會(huì)[1]。靶向藥物是治療中晚期肝癌的主要臨床療法，但目前由于其嚴(yán)重的不良反應(yīng)和耐藥性限制了其應(yīng)用，故急需開發(fā)新型治療藥物。Src激酶是一種位于細(xì)胞內(nèi)的非受體酪氨酸激酶，參與腫瘤生成，與腫瘤細(xì)胞增殖、抗凋亡、入侵和轉(zhuǎn)移等活動(dòng)行為密切相關(guān)[2]。蘆薈大黃素是一種從大黃、蘆薈等植物中提取出的化合物，具有多種藥理活性，包括顯著的抗腫瘤作用[3]。本研將考察蘆薈大黃素對(duì)肝癌細(xì)胞增殖與遷移的影響，以及Src/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)信號(hào)通路在該成分抗肝癌中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑 蘆薈大黃素購自成都曼斯特生物科技有限公司，二甲基亞砜(DMSO, 美國(guó)Cell Signaling Technology公司)溶解，本研究以DMSO為溶劑對(duì)照組。DMEM、PBS、胎牛血清均購自美國(guó)Gibco公司；c-Myc(#9402)、p-Src(#6943)、Src(#2109)、STAT3(#12640)、GAPDH(#5174)一抗均購自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；p-STAT3(ab76315)、Cyclin D1(ab134175)、MMP-2(ab97779)、MMP-9(ab76003)一抗均購自英國(guó)Abcam公司；MTS(G3582)購自美國(guó)Promega公司；EdU染色試劑盒(C10310-3)購自廣州市銳博生物科技有限公司；結(jié)晶紫染色試劑盒(KGA229)購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 細(xì)胞 人SMMC-7721、Hep3B肝癌細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫，用DMEM培養(yǎng)，添加10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液，置于5%CO2、37 ℃加濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞活性評(píng)價(jià) 采用MTS法。收集SMMC-7721和Hep3B肝癌細(xì)胞，以5×103/mL密度接種到96孔板，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后給予不同濃度的蘆薈大黃素，培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基，加入MTS和DMEM混合溶液(MTS∶DMEM=1∶5)100 μL，在37 ℃下孵育1 h。使用酶標(biāo)儀讀取器讀取490 nm吸光度，計(jì)算細(xì)胞活性。

1.4 平板克隆形成 收集培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721和Hep3B肝癌細(xì)胞，調(diào)整為每皿300個(gè),并在60 mm皿中重新接種。細(xì)胞每3 d用10、20、40 μmol/L蘆薈大黃素干預(yù)1次，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d。形成肉眼可見的細(xì)胞集落后棄培養(yǎng)基,4%多聚甲醛固定10 min，結(jié)晶紫染色10 min，洗凈后晾干、拍照。

1.5 EdU染色 收集SMMC-7721和Hep3B肝癌細(xì)胞，在96 孔板(每孔5× 103個(gè))中培養(yǎng)，第2天加入10、20、40 μmol/L蘆薈大黃素繼續(xù)培養(yǎng)24 h。根據(jù)試劑盒說明書棄培養(yǎng)基，加入A液2 h標(biāo)記細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞3次，4%多聚甲醛固定10 min，Apollo染色液和Hochest 33342染色液依次孵育30 min，熒光顯微鏡進(jìn)行觀察拍照，計(jì)算EdU陽性細(xì)胞數(shù)。EdU陽性細(xì)胞數(shù)=[EdU陽性細(xì)胞(紅色)/細(xì)胞總數(shù)(藍(lán)色)]×100%。

1.6 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)使用24孔板及孔徑為8.0 μm的小室進(jìn)行，5×105個(gè)SMMC-7721肝癌細(xì)胞懸浮于無血清DMEM中，播種到上腔室，給予不同濃度蘆薈大黃素，下腔中加入含有10%胎牛血清的DMEM。孵育20 h后，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫對(duì)遷移至下室的肝癌細(xì)胞染色，在正置顯微鏡下觀察，計(jì)算細(xì)胞遷移數(shù)。

1.7 蛋白印跡(Western blot) SMMC-7721肝癌細(xì)胞在100 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)48 h后，10、20、40 μmol/L蘆薈大黃素處理24 h，預(yù)先在RIPA裂解液中添加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，冷PBS洗滌2次，裂解液收集處理后的肝癌細(xì)胞蛋白，定量后將等量蛋白通過SDS-PAGE凝膠分離，轉(zhuǎn)移到聚氯酰胺氟化物(PVDF)膜，用含5% BSA的TBST封閉2 h后，一抗、二抗依次對(duì)膜進(jìn)行孵育，通過增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 分子對(duì)接與分子動(dòng)力學(xué) 采用Autodock Vina(美國(guó)Scripps研究所)軟件[4]分析Src(PDB ID 1YOL)與蘆薈大黃素(CID 10207)之間的結(jié)合相互作用，通過去除水分子和結(jié)合的配體來制備Src的分子對(duì)接模擬蛋白，使用YASARA進(jìn)行配體的能量最小化。本研究中Src的抑制劑結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于Src的蛋白質(zhì)-配體結(jié)合位點(diǎn)，采用YASARA軟件[5]執(zhí)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，模擬退火最小化的起始時(shí)間設(shè)置為298 K，每10步速度將速度降低0.9，持續(xù)5 ps，最小化能量后，使用Berendsen溫控器調(diào)節(jié)系統(tǒng)溫度，以最大程度地降低溫度控制的影響，最后以2 fs速率進(jìn)行100 ns的MD模擬，每10 ps保存坐標(biāo)。

1.9 表面等離子共振 使用PlexArray HT系統(tǒng)(美國(guó)Plexera)進(jìn)行表面等離子共振篩選以確定蘆薈大黃素和Src的結(jié)合，將Src蛋白打印在3D傳感器芯片上，并通過光穿越反應(yīng)將其固定，在25 ℃下，以2 μL/s 體積流量流動(dòng)樣品進(jìn)行300 s締合，在運(yùn)行緩沖液中進(jìn)行300 s解離，以3 μL/s 體積流量運(yùn)行200 s的再生緩沖液，獲得典型的結(jié)合曲線(為了獲得結(jié)合親和力，至少用3個(gè)濃度流動(dòng)相依次洗脫)。在折射率變化已知(1 200 RU)的運(yùn)行緩沖液中，1%甘油校準(zhǔn)每個(gè)斑點(diǎn)，將所有結(jié)合信號(hào)轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)折射單位(RU)，使用SPRi分析軟件(Plexera SPR數(shù)據(jù)分析模型)收集分析測(cè)定數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 蘆薈大黃素對(duì)SMMC-7721和Hep3B肝癌細(xì)胞增殖的影響 如圖1A所示，10、40 μmol/L蘆薈大黃素處理后，SMMC-7721和Hep3B肝癌細(xì)胞的生存率分別降低到79.52%、88.19%和47.49%、61.29%，并呈濃度依賴性(P<0.05)，作用24 h后兩者IC50分別為37.55、52.58 μmol/L。如圖1B所示，10、20、40 μmol/L蘆薈大黃素可濃度依賴性地抑制肝癌細(xì)胞克隆形成。如圖1C所示，10、20、40 μmol/L蘆薈大黃素處理24 h后，可呈劑量依賴性的方式抑制SMMC-7721和Hep3B肝癌細(xì)胞增殖能力，EdU陽性細(xì)胞數(shù)分別為15.32%、23.30%，11.19%、18.45%，6.08%、12.56%，低于對(duì)照組的34.27%、39.46%(P<0.05)。由于與Hep3B肝癌細(xì)胞比較，SMMC-7721肝癌細(xì)胞對(duì)蘆薈大黃素更為敏感，故本實(shí)驗(yàn)選用SMMC-7721肝癌細(xì)胞探索該成分抗肝癌作用。

注：A為大黃對(duì)肝癌細(xì)胞活性的影響，B為10、20、40 μmol/L蘆薈大黃素對(duì)肝癌細(xì)胞平板克隆形成的影響，C為蘆薈大黃素對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響，D為EdU陽性細(xì)胞數(shù)比例。與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.2 蘆薈大黃素對(duì)SMMC-7721肝癌細(xì)胞遷移的影響 如圖2所示，蘆薈大黃素減少了SMMC-7721肝癌細(xì)胞中遷移細(xì)胞的數(shù)量，并呈濃度依賴性；10、20、40 μmol/L蘆薈大黃素組的遷移細(xì)胞數(shù)分別為每個(gè)視野178.3、136.3、85.6個(gè)，低于對(duì)照組的每個(gè)視野452.6個(gè)(P<0.05)。

注：A為肝癌細(xì)胞遷移情況，B為肝癌細(xì)胞遷移數(shù)。與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.3 蘆薈大黃素對(duì)肝癌細(xì)胞Src/STAT3信號(hào)通路的調(diào)控 如圖3所示，蘆薈大黃素能濃度依賴性地抑制SMMC-7721肝癌細(xì)胞中Src和STAT3的磷酸化水平，而相應(yīng)的總蛋白表達(dá)不變，也以濃度依賴性的方式抑制Cyclin D1、c-Myc、MMP-2、MMP-9表達(dá)，表明Src/STAT3信號(hào)通路在蘆薈大黃素抑制 SMMC-7721肝癌細(xì)胞增殖和遷移中發(fā)揮重要作用。

注：A為蘆薈大黃素對(duì)Src/STAT3信號(hào)通路激活的影響，B為蘆薈大黃素對(duì)Src/STAT3信號(hào)通路下游增殖和遷移相關(guān)靶蛋白的影響，C為蛋白相對(duì)表達(dá)量。與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.4 Src與蘆薈大黃素的潛在結(jié)合作用 目前研究表明，蘆薈大黃素抑制了Src的磷酸化水平，因此推測(cè)蘆薈大黃素可能直接與Src蛋白結(jié)合，是潛在的Src蛋白抑制劑。本實(shí)驗(yàn)首先采用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行分析，Src和蘆薈大黃素之間的結(jié)合能為-8.772 kcal/mol。Src-蘆薈大黃素絡(luò)合物三維晶體結(jié)構(gòu)如圖4A所示，可知蘆薈大黃素和Src的ASP-406、GLU-341、GLU-312 之間形成了3個(gè)氫鍵。通過分子動(dòng)力學(xué)模擬，進(jìn)一步研究了Src-蘆薈大黃素蛋白復(fù)合物的穩(wěn)定性。Src-蘆薈大黃素絡(luò)合物在0、100 ns處的表面可視化模型如圖4C所示，可知Src穩(wěn)定地呈現(xiàn)在Src結(jié)合位點(diǎn)的中心，直到分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)束。在最初的20 ns內(nèi)，Src蛋白的均方根偏差(RMSD)從0.5 ?(1 ?=1.0×10-10m)增加到3 ?，并圍繞著3 ?波動(dòng)(圖4B，紅色線)，而蘆薈大黃素的RMSD則穩(wěn)定在0.5 ?波動(dòng)(圖4B，藍(lán)色線)。此外，表面等離子共振分析表明蘆薈大黃素以濃度依賴方式快速結(jié)合Src，平衡解離常數(shù)(KD)值為3.66×10-7mol/L，表明該成分對(duì)Src具有很強(qiáng)的親和力，能與后者直接結(jié)合。

圖4 Src和蘆薈大黃素結(jié)構(gòu)之間的相互作用

3 討論

在過去70年中，獲得FDA批準(zhǔn)用于癌癥治療的小分子化合物中，約有一半是天然藥物或天然藥物的直接衍生物[6-7]。蘆薈大黃素是從中藥大黃中提取的天然化合物，具有抗炎、抗菌、神經(jīng)保護(hù)和肝保護(hù)等多種藥理作用[8]。此外，蘆薈大黃素在肝癌、肺癌、胃癌及黑色素瘤細(xì)胞等不同腫瘤細(xì)胞上表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性[3]。杜雪峰等[9]發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素通過促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白Bax、caspase-3的表達(dá)誘導(dǎo)SMMC-7721肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬和凋亡。王曉輝等[10]發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素能夠減少HepG2肝癌細(xì)胞中微絲形成，抑制細(xì)胞增殖與遷移，其機(jī)制可能與蘆薈大黃素上調(diào)NF-κB表達(dá)，降低e-NOS活性有關(guān)。本研究中采用SMMC-7721和Hep3B肝癌細(xì)胞探索蘆薈大黃素抗肝癌作用及其機(jī)制。MTS和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示蘆薈大黃素能夠抑制肝癌細(xì)胞的活性。EdU染色和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)提示蘆薈大黃素抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。最后采用蛋白印跡探索蘆薈大黃素抗肝癌的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素能夠抑制肝癌細(xì)胞中Src/STAT3信號(hào)通路的激活，以及抑制下游增殖和遷移相關(guān)靶蛋白的表達(dá)。

Src是非受體蛋白酪氨酸激酶，能被多種受體蛋白激活，通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)節(jié)一系列下游基因表達(dá)，以控制細(xì)胞形態(tài)、增殖、粘附、分化和遷移等細(xì)胞過程[11]。STAT3是Src級(jí)聯(lián)的重要下游之一。Src激酶在惡性腫瘤中異常持續(xù)激活，隨后將STAT3磷酸化，激活的STAT3轉(zhuǎn)入核內(nèi)與DNA結(jié)合，促進(jìn)增殖、抗凋亡，遷移與侵襲等相關(guān)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因與多種類型腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展密切有關(guān)[12]。江雪梅[13]通過收集153肝癌患者術(shù)后標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)激活的Src水平與肝癌的不良預(yù)后密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)使用慢病毒載體抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)Src的表達(dá)能夠抑制細(xì)胞增殖、遷移與侵襲[14]。Finn等[15]使用Src激酶小分子抑制劑達(dá)沙替尼作用于多種肝癌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)達(dá)沙替尼能夠阻斷細(xì)胞周期，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。陳建新等[16]通過分子對(duì)接技術(shù)發(fā)現(xiàn)中藥單體10-姜酚能與Src結(jié)合，從而抑制Src/STAT3信號(hào)通路的激活，抑制HepG2肝癌細(xì)胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素能抑制肝癌細(xì)胞Src與STAT3的磷酸化表達(dá)，并抑制STAT3下游增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1、c-Myc以及遷移相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9的蛋白表達(dá)，蘆薈大黃素抑制肝癌細(xì)胞增殖與遷移的作用可能是通過抑制Src/STAT3信號(hào)通路。

Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素抑制磷酸化Src的激活，而不抑制總Src蛋白的表達(dá)，提示蘆薈大黃素可能直接靶向Src。本研究通過分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬，以確定蘆薈大黃素能否結(jié)合Src的蛋白激酶域。分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬常用于分析生物活性分子與靶蛋白或受體之間的潛在相互作用形式，并了解他們的結(jié)合模式[17-18]。蘆薈大黃素與Src的對(duì)接研究表明蘆薈大黃素-Src復(fù)合物的結(jié)合能為-8.772 kcal/mol，表明二者具有很強(qiáng)的結(jié)合能力。此外，分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果表明，蘆薈大黃素-Src結(jié)合構(gòu)象穩(wěn)定。表面等離子共振分析是一種新型的生物分析工具，用于分析蛋白質(zhì)、DNA、酶和其他生物分子之間的相互作用[19]。表面等離子共振分析發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素與Src之間具有很強(qiáng)的親和力。以上結(jié)果提示蘆薈大黃素能與Src直接結(jié)合，是一個(gè)潛在的Src抑制劑。

綜上所述，蘆薈大黃素通過抑制Src/STAT3信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞增殖與遷移，從而發(fā)揮其抗肝癌作用，是治療肝癌的有效藥物。