HPLC法同時(shí)測定鹿紅方中7種成分

李素麗， 周 泉， 曹嵐嵐， 林啟焰， 程雪梅， 楊 濤， 周 華*， 王長虹*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合心血管病研究所, 上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，上海市復(fù)方中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203)

鹿紅方又名補(bǔ)腎活血方，由鹿角、紅花、淫羊藿、補(bǔ)骨脂、女貞子、山茱萸、沉香7味藥材組成，方中鹿角咸溫入腎，補(bǔ)腎陽、益精血；紅花辛溫入心，活血通經(jīng)，兩藥共為君藥；淫羊藿、補(bǔ)骨脂、女貞子、山茱萸共助鹿角平補(bǔ)腎之陰陽，為臣藥；沉香納氣歸腎以助諸補(bǔ)腎藥，使本方補(bǔ)而不滯，是為佐使藥，諸藥合用，共奏補(bǔ)腎活血之功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，該方可抑制心肌纖維化[2]，影響血漿RASS產(chǎn)物[3-4]，鹿角中鹿茸多肽[5]、紅花中羥基紅花黃色素A[6]、補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂素均對心血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用[7-9]，淫羊藿中淫羊藿苷[10-11]可增加心臟收縮功能，山茱萸中沒食子酸能顯著降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓[12]、莫諾苷和馬錢苷對糖尿病小鼠心肌有一定的保護(hù)作用[13]，女貞子中特女貞苷[14]能明顯抑制腎小球系膜細(xì)胞凋亡。 本實(shí)驗(yàn)建立HPLC法同時(shí)測得鹿紅方中沒食子酸、羥基紅花黃色素A、馬錢苷、沉香四醇、補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、特女貞苷的含量，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，以期為該方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 材料

Agilent 1100 series 型高效液相色譜儀(配置Agilent DAD檢測器，美國安捷倫科技公司)；BSA124S-CW電子分析天平(萬分之一)、BT25S電子分析天平(十萬分之一)[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]。羥基紅花黃色素A(批號AF9081601，純度>98%)、馬錢苷(批號AF7110703，純度>98%)、補(bǔ)骨脂苷(批號AF9102107，純度>98%)、異補(bǔ)骨脂苷(批號AF9102108，純度>98%)對照品均購于上海鴻永生物科技有限公司；沉香四醇(批號DST190801-042，純度>98%)、沒食子酸(批號 DST190715-008，純度>98%)對照品均購于成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司；特女貞苷(批號2018011201，純度>98%)對照品購于成都普利斯生物科技有限公司。鹿角、紅花、補(bǔ)骨脂、淫羊藿、山茱萸、女貞子、沉香飲片均購于上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?，經(jīng)上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心吳立宏研究員鑒定為正品。乙腈(美國Fisher公司)；甲酸(批號G0960200，上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 ZORBAX SB-Aq色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相乙腈(A)-水(含0.1%磷酸)(B)，梯度洗脫(0～10 min，5%A；10～15 min，5%～10%A；15～35 min；10%～18%A；35～40 min，18%～25%A；40～60 min，25%～35%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長230 nm；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖1。

1.沒食子酸 2.羥基紅花黃色素A 3.馬錢苷 4.沉香四醇 5.補(bǔ)骨脂苷 6.異補(bǔ)骨脂苷 7.特女貞苷

2.2 對照品溶液制備 精密稱取沒食子酸、羥基紅花黃色素A、馬錢苷、沉香四醇、補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、特女貞苷對照品適量，甲醇制成質(zhì)量濃度分別為2.71、8.61、7.61、6.43、17.42、11.88、45.00 μg/mL的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 按處方量稱取藥材約125 g(鹿角15 g、紅花9 g、補(bǔ)骨脂20 g、淫羊藿30 g、山萸肉15 g、女貞子30 g、沉香6 g)，精密稱定，加1 500 mL水煎煮75 min，濾過，濾液減壓濃縮至1 000 mL，作為水煎劑，取適量用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按處方量比例稱取缺紅花、補(bǔ)骨脂、山茱萸、女貞子、沉香的剩余處方藥材約22.5 g(鹿角7.5 g、淫羊藿15 g)，精密稱定，加750 mL水煎煮75 min，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.5 線性關(guān)系考察 取“2.2”項(xiàng)下對照品溶液適量，稀釋后搖勻，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.6 精密度試驗(yàn) 取高、中、低質(zhì)量濃度對照品溶液，同一天內(nèi)在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次(日間)或連續(xù)測定3 d(日內(nèi))，測得沒食子酸、羥基紅花黃色素A、馬錢苷、沉香四醇、補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、特女貞苷日間精密度RSD分別為1.68%～2.78%、1.10%～2.59%、1.10%～2.93%、1.14%～2.73%、1.35%～2.16%、1.22%～3.24%、0.73%～2.32%，日內(nèi)精密度RSD分別為1.42%～2.36%、2.38%～6.74%、1.46%～2.77%、1.36%～2.71%、0.84%～1.40%、1.12%～4.01%、0.89%～3.56%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取水煎液適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得沒食子酸、羥基紅花黃色素A、馬錢苷、沉香四醇、補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、特女貞苷含量RSD分別為2.04%、2.78%、2.51%、2.78%、0.75%、2.49%、0.96%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取水煎液適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、1、4、6、12、16、24 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得沒食子酸、羥基紅花黃色素A、馬錢苷、沉香四醇、補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、特女貞苷峰面積RSD分別為1.6%、2.7%、2.5%、2.9%、0.9%、1.8%、1.3%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取各成分含量已知的供試品溶液5 mL，置于10 mL量瓶中，加入50%、100%、150%水平對照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，沒食子酸、羥基紅花黃色素A、馬錢苷、沉香四醇、補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、特女貞苷平均加樣回收率分別為102.58%、98.85%、100.17%、98.87%、98.61%、97.32%、98.53%，RSD分別為3.72%、3.08%、3.92%、2.02%、1.21%、2.02%、1.14%。

2.10 樣品含量測定 取水煎液適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見表2。

表2 各成分含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

2020年版《中國藥典》中，羥基紅花色素A、馬錢苷、沉香四醇、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、特女貞苷均為鹿紅方中相應(yīng)藥材的質(zhì)控指標(biāo)[15]，雖然補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素含量在方中較低，但補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷在體內(nèi)可分別轉(zhuǎn)化為兩者[16]，并且在水煎液中含量較高，故將羥基紅花黃色素A、馬錢苷、沉香四醇、補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、特女貞苷作為質(zhì)控指標(biāo)；沒食子酸為鹿紅方中山茱萸的指標(biāo)成分，含量較高，也選擇作為質(zhì)控指標(biāo)；淫羊藿苷、莫諾苷雖然可見于鹿紅方水煎液中，但含量較低，不宜作為質(zhì)控指標(biāo)，故未將兩者含量進(jìn)行測定；鹿角中含有大量鹿茸多肽，可介導(dǎo)心肌干細(xì)胞分化，修復(fù)受損心肌[12]，但本實(shí)驗(yàn)所建立的方法無法對多肽含量進(jìn)行測定，后期將對其作單獨(dú)處理。

本實(shí)驗(yàn)在色譜條件確定過程中，分別以水(含0.1%甲酸)-乙腈、水(含0.1%甲酸)-甲醇為流動相，并對其梯度進(jìn)行摸索，發(fā)現(xiàn)前者洗脫時(shí)色譜圖基線平穩(wěn)，色譜峰峰形對稱，分離度較好。再對檢測波長進(jìn)行考察，最終確定為230 nm，此時(shí)出峰數(shù)目多，各成分響應(yīng)、分離度均理想。