夏蔞止鼾顆粒提取、成型工藝的優(yōu)化

孫嵐萍， 顧志榮， 馬轉(zhuǎn)霞， 呂 鑫， 張 銳， 祁 梅， 葛 斌

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730000)

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)[1]是一種睡眠呼吸紊亂性疾病，主要臨床表現(xiàn)為打鼾，鼾聲不規(guī)律，患者自覺(jué)憋氣，常伴有夜尿增多、晨起頭痛、頭暈等[2-3]，還可引起高血壓、糖尿病等多種疾病[4]，被稱(chēng)為夢(mèng)中的“隱形殺手”，常用治療方法包括藥物、持續(xù)氣道正壓通氣(CPAP)、口腔矯治器、外科手術(shù)等[5-6]，但療效不佳，臨床應(yīng)用受限，目前仍無(wú)特效藥物。中藥及其復(fù)方制劑治療OSAHS時(shí)，常采用化痰利濕、寬胸散結(jié)通陽(yáng)、行氣活血導(dǎo)滯等治則，具有療效確切、作用溫和、不良反應(yīng)小、整體調(diào)節(jié)等優(yōu)勢(shì)[7]。

夏蔞止鼾方是甘肅省人民醫(yī)院張明德主任中醫(yī)師擬定的臨床經(jīng)驗(yàn)方，目前應(yīng)用已超過(guò)20年，該方由法半夏、瓜蔞、黃芪、茯苓、陳皮等13味中藥組成，具有補(bǔ)氣化痰利濕、寬胸散結(jié)通陽(yáng)、行氣活血導(dǎo)滯等功效，治療氣虛血瘀、痰瘀互結(jié)所致OSAHS取得了較好的效果，但原方存在煎煮費(fèi)時(shí)，服藥體積大，服藥時(shí)間、劑量、次數(shù)難以精確化等缺點(diǎn)，故擬將其制成顆粒劑。本實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)結(jié)合信息熵理論優(yōu)化夏蔞止鼾顆粒提取工藝，星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法結(jié)合G1-熵權(quán)法優(yōu)化該制劑成型工藝，以期為其研發(fā)提供技術(shù)資料。

1 材料

1.1 儀器 LC-16型高效液相色譜儀[島津儀器(蘇州)有限公司]；UV8100A型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司)；AL204型電子天平(萬(wàn)分之一，瑞士梅特勒-托利多公司)；BSA4202S-CW型電子天平[百萬(wàn)分之一，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；SB25-12DTD型超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(西安超杰儀器有限公司)；DHG-9140A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；DD-5M型低速大容量離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；YC-1000型實(shí)驗(yàn)室噴霧制粒包衣機(jī)(上海雅程儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 試劑與藥物 法半夏、瓜蔞、連翹、黃芪、陳皮、生地黃、枳實(shí)、牛蒡子、澤瀉、薤白、當(dāng)歸、甘草、水蛭均購(gòu)于甘肅冠蘭中藥飲片有限公司，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李碩副教授鑒定為正品，符合2015年版《中國(guó)藥典》一部相關(guān)規(guī)定。連翹酯苷A(批號(hào)CHB190123)、橙皮苷(批號(hào)CHB180523)、梓醇(批號(hào)CHB171010)、芒柄花苷(批號(hào)CHB171026)對(duì)照品均購(gòu)于成都克洛瑪生物科技有限公司；預(yù)膠化淀粉、麥芽糊精、甘露醇、微晶纖維素、聚維酮均為藥用級(jí)輔料。甲醇、甲酸為色譜純(天津大茂化學(xué)試劑廠)；其他試劑均為分析純(天津大茂化學(xué)試劑廠)；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝優(yōu)化

2.1.1 HPLC法同時(shí)測(cè)定4種成分含量

2.1.1.1 色譜條件 WondaSil C18-WR色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-水(含0.2%甲酸)(B)，梯度洗脫(0～7 min，8%～13%A；7～10 min，13%～18%A；10～16 min，18%～21%A；16～58 min，21%～55%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

1.連翹酯苷A 2.橙皮苷 3.梓醇 4.芒柄花苷

2.1.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取連翹酯苷A、橙皮苷、梓醇、芒柄花苷對(duì)照品適量，甲醇溶解，即得(質(zhì)量濃度分別為0.90、1.00、1.50、0.27 mg/mL)，避光冷藏備用。

2.1.1.3 供試品溶液制備 精密吸取提取液7 mL，加10 mL甲醇搖勻，超聲提取60 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，4 000 r/min離心10 min，取上清液，溶劑回收至干，加水溶解，置于25 mL量瓶中，定容，即得。

2.1.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、1、2、4 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，在“2.1.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.1.1.5 精密度試驗(yàn) 取“2.1.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.1.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得連翹酯苷A、橙皮苷、梓醇、芒柄花苷峰面積RSD分別為1.86%、1.72%、1.47%、1.52%，表明儀器精密度良好。

2.1.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取提取液6份，按“2.1.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得連翹酯苷A、橙皮苷、梓醇、芒柄花苷含量RSD分別為1.67%、1.97%、1.17%、1.39%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.1.3”項(xiàng)下供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.1.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得連翹酯苷A、橙皮苷、梓醇、芒柄花苷峰面積RSD分別為1.09%、1.93%、1.46%、1.95%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1.3”項(xiàng)下各成分含量已知的供試品溶液3.5 mL，共6份，精密加入對(duì)照品溶液，按“2.1.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，連翹酯苷A、橙皮苷、梓醇、芒柄花苷平均加樣回收率為100.09%、101.56%、100.17%、99.43%，RSD分別為1.96%、2.11%、2.03%、1.87%。

2.1.2 單因素試驗(yàn)

2.1.2.1 加水量 精密稱(chēng)取處方量藥材約126 g，共5份，浸泡12 h后分別加8、10、12、14、16倍量水，按“2.1.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2。由此可知，加14倍量水時(shí)各成分峰面積開(kāi)始呈下降趨勢(shì)，故選擇12、14、16倍作進(jìn)一步考察。

2.1.2.2 提取時(shí)間 煎煮時(shí)間設(shè)定為30、60、90、120、150 min，其余同“2.1.2.1”項(xiàng)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由此可知，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，各成分含量升高，但提取60 min后開(kāi)始呈下降趨勢(shì)，故選擇30、60、90 min作進(jìn)一步考察。

2.1.2.3 提取次數(shù) 煎煮次數(shù)設(shè)定為1～4次，其余同“2.1.2.1”項(xiàng)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由此可知，增加提取次數(shù)時(shí)各成分含量呈先升后降的趨勢(shì)，故選擇1～3次作進(jìn)一步考察。

圖2 各因素對(duì)提取效果的影響

2.1.2.4 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以提取次數(shù)(A)、提取時(shí)間(B)、加水量(C)為影響因素，連翹酯苷A、橙皮苷、梓醇、芒柄花苷含量，干膏率，指紋圖譜相似度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝[8]。因素水平見(jiàn)表2。

稱(chēng)取處方量藥材約126 g，共9份，按表2因素水平提取，按“2.1.1.3”項(xiàng)下方法制備9份供試品溶液，在“2.1.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分含量。精密吸取水煎液10 mL，置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，在105 ℃下干燥至恒重，取出，置于干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱(chēng)定質(zhì)量，計(jì)算干膏率。結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 提取工藝因素水平

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(Ⅰ)

2.1.2.5 指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià) 吸取“2.1.2.4”項(xiàng)下供試品溶液，在“2.1.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012A版)”生成指紋圖譜，中位數(shù)法建立對(duì)照?qǐng)D譜(R)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 9批樣品HPLC指紋圖譜

2.1.2.6 信息熵理論 建立原始評(píng)價(jià)指標(biāo)矩陣X，將其轉(zhuǎn)換為概率矩陣P，計(jì)算權(quán)重系數(shù)[9]、信息熵(Hi)、i項(xiàng)指標(biāo)的系數(shù)Wi、綜合評(píng)分M，Hi=[0.984 0，0.989 7，0.987 0，0.992 2，0.993 0，0.992 8]，Wi=[0.261 0，0.168 0，0.212 1，0.127 2，0.114 2，0.117 5]，M=[(Xi連翹酯苷A/Xmax連翹酯苷A×0.261 0+Xi橙皮苷/Xmax橙皮苷×0.168 0+Xi梓醇/Xmax梓醇×0.212 1+Xi芒柄花苷/Xmax芒柄花苷×0.127 2+Xi干膏率/Xmax干膏率×0.114 2+Xi相似度/Xmax相似度×0.117 5)×100]。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.1.2.7 方差分析 表4顯示，各因素影響程度依次為A>B>C，即提取次數(shù)>提取時(shí)間>加水量，其中因素A有顯著影響(P<0.05)，而B(niǎo)、C無(wú)顯著影響(P>0.05)。結(jié)合單因素試驗(yàn)和方差分析結(jié)果，確定最優(yōu)工藝為A3B3C2，即加14倍量水煎煮3次，每次1.5 h。

表4 方差分析(Ⅰ)

2.1.2.8 驗(yàn)證試驗(yàn) 精密稱(chēng)取處方量藥材約126 g，共4份，按“2.1.2.7”項(xiàng)下優(yōu)化工藝進(jìn)行4批驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。由此可知，各指標(biāo)RSD均小于3%，表明該工藝穩(wěn)定可行。

表5 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(n=4)

2.2 成型工藝優(yōu)化

2.2.1 顆粒制備 按處方稱(chēng)取藥材，加入14倍量水煎煮3次，每次1.5 h，濾過(guò)，合并濾液，濃縮，噴霧造粒機(jī)噴霧干燥后制得干燥恒重浸膏粉，按相應(yīng)浸膏粉輔料比例混合制成軟材(“握之成團(tuán)，觸之即散”)，過(guò)20目篩，采用擠壓制粒法制粒，60 ℃下烘干，整粒，即得。

2.2.2 指標(biāo)測(cè)定

2.2.2.1 吸濕率 參考文獻(xiàn)[10]報(bào)道，精密稱(chēng)取顆粒2 g，置于干燥恒重敞口的扁形稱(chēng)量瓶中，輕搖使其分布均勻，放入盛有氯化鈉過(guò)飽和溶液的干燥器內(nèi)，密封48 h后稱(chēng)定質(zhì)量，計(jì)算吸濕率，公式為吸濕率=[(吸濕后顆粒質(zhì)量-吸濕前顆粒質(zhì)量)/吸濕前顆粒質(zhì)量]×100%。

2.2.2.2 成型率 參考文獻(xiàn)[11]報(bào)道，收集通過(guò)1號(hào)篩而不通過(guò)5號(hào)篩的合格顆粒，稱(chēng)定質(zhì)量，計(jì)算成型率，公式為成型率=(合格顆粒質(zhì)量/顆?？傎|(zhì)量)×100%。

2.2.2.3 溶化率 參考文獻(xiàn)[12]報(bào)道，精密稱(chēng)取顆粒1 g，置于50 mL恒重離心管中，加入沸水20 mL，攪拌并振搖5 min，4 000 r/min離心10 min，80 ℃下將殘?jiān)娓芍梁阒?，稱(chēng)定質(zhì)量，計(jì)算溶化率，公式為溶化率=(溶化的顆粒質(zhì)量/顆粒總質(zhì)量)×100%。

2.2.2.4 休止角 參考文獻(xiàn)[13]報(bào)道，采用固定漏斗法，將3只漏斗串聯(lián)固定于鐵架臺(tái)，最下方漏斗口距離坐標(biāo)紙1 cm(H)，將顆粒由漏斗壁倒入最高處漏斗口中，待坐標(biāo)紙上顆粒椎體頂端觸及漏斗下沿時(shí)停止，記錄錐體底部直徑為2R，計(jì)算休止角α，公式為α=arctan(H/R)。

2.2.2.5 堆密度 參考文獻(xiàn)[14]報(bào)道，將顆粒置于恒重量筒中反復(fù)振蕩，記錄體積，稱(chēng)定顆粒質(zhì)量，計(jì)算堆密度，公式為堆密度=顆粒質(zhì)量/顆粒體積。

2.2.3 輔料篩選 本實(shí)驗(yàn)選擇預(yù)膠化淀粉、麥芽糊精、甘露醇、微晶纖維素、聚維酮進(jìn)行考察，由于浸膏粉黏性較大，故以95%乙醇為潤(rùn)濕劑，設(shè)定浸膏粉與輔料比例為1∶1，潤(rùn)濕劑用量為浸膏粉與輔料總質(zhì)量的0.38倍，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備顆粒，測(cè)定其吸濕率、成型率、溶化率，結(jié)果見(jiàn)表6，最終確定甘露醇、麥芽糊精作為輔料。

表6 不同輔料對(duì)成型工藝的影響

2.2.4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以乙醇用量(A)、浸膏粉與輔料比例(B)、甘露醇與麥芽糊精比例(C)為影響因素，吸濕率(X1)、成型率(X2)、溶化率(X3)、休止角(X4)、堆密度(X5)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化成型工藝。因素水平見(jiàn)表7。

表7 成型工藝因素水平

2.2.5 G1-熵權(quán)法 根據(jù)G1法[15-16]，確定各評(píng)價(jià)指標(biāo)影響程度依次為X1>X2=X3>X4>X5，并確定其權(quán)重評(píng)價(jià)標(biāo)度，其中r2=1.6，r3=1.0，r4=1.2，r5=1.4，計(jì)算各指標(biāo)主觀權(quán)重值(w1)，根據(jù)熵權(quán)法計(jì)算各指標(biāo)客觀權(quán)重值(w2)，根據(jù)式(1)計(jì)算組合權(quán)重(w)，結(jié)果見(jiàn)表8。再計(jì)算綜合評(píng)分Y，結(jié)果見(jiàn)表9。

表8 評(píng)價(jià)指標(biāo)權(quán)重值

表9 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果(Ⅱ)

(1)

2.2.6 模型擬合與方差分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表9數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得方程為Y=-55.810 17+426.726 61A+111.786 02B+39.079 55C-11.783 75AB+81.911 25AC-29.349 40BC-760.881 43A2-37.247 88B2-15.253 18C2，方差分析見(jiàn)表10。

表10 方差分析(Ⅱ)

2.2.7 響應(yīng)面分析 通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。由此可知，模型最大值點(diǎn)為乙醇用量0.34倍，浸膏粉與輔料比例為1∶0.93，甘露醇與糊精比例1.31∶1，綜合評(píng)分為95.094 0分，即為最優(yōu)工藝。

圖4 各因素響應(yīng)面圖

2.2.8 驗(yàn)證試驗(yàn) 按優(yōu)化工藝制備5批顆粒，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表11。由此可知，平均綜合評(píng)分與預(yù)測(cè)值95.094 0分接近，偏差率僅為-1.12%，表明模型預(yù)測(cè)性良好，可用于工藝參數(shù)的優(yōu)化。

表11 成型工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.2.9 臨界相對(duì)濕度測(cè)定 參考文獻(xiàn)[17]報(bào)道，在棕色玻璃干燥器中配置7種鹽過(guò)飽和溶液，室溫下放置48 h，使內(nèi)部濕度平衡，將干燥至恒重的2 g顆粒置于恒重稱(chēng)量瓶中，均勻攤開(kāi)，敞口放于相對(duì)濕度不同的干燥器中，室溫下放置48 h后精密稱(chēng)定質(zhì)量，計(jì)算吸濕率，結(jié)果見(jiàn)表12。以吸濕率為縱坐標(biāo)(Y)，相對(duì)濕度為橫坐標(biāo)(X)繪制曲線，在吸濕曲線前后拐點(diǎn)處作切線(分別為Y=0.102 6X-0.644 4、Y=0.783 9X-48.815 5)，兩切線交點(diǎn)對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)即為臨界相對(duì)濕度，結(jié)果見(jiàn)圖5，可知該數(shù)值為70.45%。

表12 顆粒吸濕率測(cè)定結(jié)果

圖5 顆粒吸濕曲線

3 討論

中藥飲片的優(yōu)劣會(huì)直接影響夏蔞止鼾顆粒成型，本研究所用均來(lái)自醫(yī)院中藥庫(kù)，有質(zhì)量檢驗(yàn)報(bào)告，經(jīng)驗(yàn)收人員鑒定為正品后，再經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李碩副教授鑒定，符合2015年版《中國(guó)藥典》一部相關(guān)規(guī)定。中藥復(fù)方提取液中活性成分含量對(duì)制劑的質(zhì)量和療效起著至關(guān)重要的作用，在煎煮過(guò)程中易受到加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)等因素影響[18]，本研究選擇多指標(biāo)成分，再通過(guò)客觀賦權(quán)法得到綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，從而篩選提取工藝。

中藥復(fù)方組成藥味繁多，成分復(fù)雜，而臨床療效是由方中許多活性成分協(xié)同發(fā)揮作用的，故評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇是其提取工藝研究中十分重要的環(huán)節(jié)[19]。本實(shí)驗(yàn)選取方中君藥或臣藥的指標(biāo)成分或有效成分來(lái)進(jìn)行優(yōu)化，其中連翹酯苷A具有抗氧化、抗炎功效[20]，可改善OSAHA患者呼吸紊亂指數(shù)及最低血氧飽和度；橙皮苷具有抗氧化應(yīng)激、降低脂質(zhì)過(guò)氧化物水平的作用，可抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)；梓醇具有抗腦缺血損傷、抗氧化等作用[21]，能降低MDA水平，抑制炎性細(xì)胞因子釋放；芒柄花苷是重要的黃酮類(lèi)成分，具有抗氧化作用。另外，干浸膏含有大多數(shù)上述有效成分或有效部位，能更全面地反映復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇連翹酯苷A、橙皮苷、梓醇、芒柄花苷及干膏率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化夏蔞止鼾顆粒成型工藝時(shí)，能較大程度地避免各指標(biāo)之間優(yōu)化條件的相互交叉。對(duì)綜合評(píng)分分別進(jìn)行多元線性回歸、二項(xiàng)式方程擬合分析，發(fā)現(xiàn)后者擬合效果較好，失擬項(xiàng)無(wú)顯著差異。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與模型方程理論值之間的偏差在合理范圍內(nèi)，表明擬合模型準(zhǔn)確可靠，優(yōu)化工藝穩(wěn)定可行，重復(fù)性較好。但實(shí)驗(yàn)室小試所優(yōu)化的提取、成型工藝可能存在某些不足，故今后將進(jìn)行中試，以期為夏蔞止鼾顆粒的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供重要依據(jù)。