殼聚糖/β-甘油磷酸鈉/膠原水凝膠包裹IR-780碘化物標(biāo)記肌腱干細(xì)胞的體內(nèi)示蹤研究

楊志金,徐 江 ,盛曉飛 ,陳 康 ,段少飛 ,李 斌 ,唐康來(lái)

1.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二O醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科,昆明 650032；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)中心，重慶 400038

肌腱損傷在體育運(yùn)動(dòng)及其他劇烈活動(dòng)中均十分常見(jiàn)。肌腱自身再生能力較差，自然愈合常形成瘢痕組織，導(dǎo)致機(jī)械性能下降，且容易再次損傷。肌腱損傷的常規(guī)治療方法包括非手術(shù)治療及手術(shù)治療，但這些治療方法均療效有限，不能恢復(fù)肌腱的自然結(jié)構(gòu)及機(jī)械性能。干細(xì)胞治療有促進(jìn)損傷肌腱組織再生的潛能，肌腱干細(xì)胞(tendon stem cells，TSCs)是來(lái)源于肌腱的間充質(zhì)干細(xì)胞。肌腱組織工程使用TSCs促進(jìn)損傷肌腱組織再生，是一項(xiàng)極有前景的治療方法。

干細(xì)胞局部注射很難避免細(xì)胞滲漏等問(wèn)題，且干細(xì)胞也很難在損傷部位長(zhǎng)時(shí)間駐留，因此需研究更適宜的干細(xì)胞移植技術(shù)?？墒褂蒙镏Ъ懿牧习杉?xì)胞局部注射治療肌腱損傷，同時(shí)TSCs也需要合適的支架材料以保持其干性，及成肌腱分化方向。水凝膠是制作組織工程支架最經(jīng)濟(jì)、有效的方法，水凝膠為移植的干細(xì)胞提供了一個(gè)模擬肌腱細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的載體和微環(huán)境。殼聚糖(Chitosan,C)/β-甘油磷酸鈉(β-glycerophosphate,GP)/膠原(collagen,Co)水凝膠是近年組織工程領(lǐng)域重點(diǎn)關(guān)注的一種可注射溫敏水凝膠，其加入了肌腱組織的主要組成成分Ⅰ型膠原，可能更適宜作為肌腱組織工程支架。

外源性干細(xì)胞移植在組織再生及功能修復(fù)方面極具前景[1]。干細(xì)胞移植后遷移到損傷部位，存活并分化為靶細(xì)胞而發(fā)揮功能。確定移植的干細(xì)胞是否可以定位在受損的器官或組織中，是干細(xì)胞移植治療的基礎(chǔ)[2]。為了監(jiān)測(cè)干細(xì)胞在體內(nèi)的分布、存活、增殖、分化等生物學(xué)行為，合適的干細(xì)胞示蹤技術(shù)起到至關(guān)重要的作用[3-4]?；铙w光學(xué)成像技術(shù)(optical imaging,OI)由于具有損傷小、靈敏度高、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和沒(méi)有放射性等優(yōu)點(diǎn)，是近年研究的熱點(diǎn)。其中近紅外(near-infrared,NIR)熒光探針在細(xì)胞培養(yǎng)及動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均有廣泛研究[5]。菁染料是目前被廣泛應(yīng)用的一種近紅外熒光探針，吲哚菁綠(Indocyanine green,ICG)已被食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration,FDA)批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床，包括：心臟功能檢測(cè)、眼科視網(wǎng)膜血管造影及肝功能檢測(cè)等[6-7]。同時(shí)ICG被用于干細(xì)胞的標(biāo)記示蹤[8]。雖然ICG的臨床應(yīng)用廣泛，但它為水溶性熒光探針，在體內(nèi)代謝較快，成像時(shí)間較短。且用于標(biāo)記干細(xì)胞的標(biāo)記效率低、熒光信號(hào)強(qiáng)度較弱等因素限制了其在干細(xì)胞體內(nèi)示蹤中的應(yīng)用。IR-780碘化物是一種新型的近紅外七甲川花菁類(lèi)熒光探針，具有良好的光學(xué)特性。IR-780碘化物用于標(biāo)記干細(xì)胞，具有良好的生物相容性及獨(dú)特的光學(xué)性能[9]。

本研究擬對(duì)用IR-780碘化物標(biāo)記，由C/GP/Co水凝膠包裹，移植至動(dòng)物體內(nèi)的TSCs進(jìn)行示蹤觀察，觀察移植后帶熒光標(biāo)記的TSCs的分布及存活情況，為進(jìn)一步C/GP/Co水凝膠包裹TSCs移植至體內(nèi)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 14只雄性SD大鼠(4周齡，體重約100g，陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。所有動(dòng)物嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物治療和處理指南進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)程序均由陸軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物研究醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[SYXK(渝)20170002]。

1.2主要試劑 低糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國(guó))；胎牛血清(Gibco公司，美國(guó))；Ⅰ型膠原酶(Sigma公司，美國(guó))；胰蛋白酶(Hyclone公司，美國(guó))；青-鏈霉素雙抗(Hyclone公司，美國(guó))；Hoechst染色液(上海碧云天公司，中國(guó))；Mito-Tracker Green (Invitrogen公司，美國(guó))；IR-780碘化物(Sigma公司，美國(guó))；RNaseA(北京鼎國(guó)昌盛公司，中國(guó))；PI染色液(北京鼎國(guó)昌盛公司，中國(guó))；CCK-8試劑盒(合肥Biosharp公司，中國(guó)) ；PBS緩沖液(北京中杉金橋公司，中國(guó))；DAPI染色液(上海碧云天公司，中國(guó))。

1.3主要儀器 YJ-1450型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠，中國(guó))；3211型細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma公司，美國(guó))；37℃恒溫水浴箱(哈爾濱東明醫(yī)療儀器廠，中國(guó))；90-2型磁力攪拌器(上海滬西分析儀器廠，中國(guó))；OLYMPUS-IX70熒光顯微鏡(Olympus 公司，日本)；Leica TCS SP2激光共聚焦顯微鏡(Leica公司，德國(guó))；KODAK多功能活體成像系統(tǒng)(KODAK公司，美國(guó))；FACStar Plus 流式細(xì)胞儀(BD公司，美國(guó))；iMarkTM酶標(biāo)儀(Bio-Rad 公司，美國(guó))。

2 方法

2.1IR-780碘化物的配制 IR-780碘化物為深綠色粉末，用二甲亞砜(DMSO)溶解后調(diào)整濃度至10mM，分裝至1.5mL EP管，置于-20℃冰箱避光保存。

2.2大鼠跟腱來(lái)源TSCs的分離及培養(yǎng) 取4周齡SD雄性大鼠2只，體重約100g，CO2麻醉處死后，無(wú)菌條件下取雙側(cè)跟腱中段組織，剔除腱鞘及腱周結(jié)締組織。將肌腱均勻剪碎成1mm×1mm組織塊，每100mg肌腱組織加入含3mg/mLⅠ型膠原酶和4mg/mL中性蛋白酶混合溶液1mL，37℃孵箱消化2h。加入與消化液等體積的10%胎牛血清(FBS)溶液終止消化，收集細(xì)胞懸液，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用含20%FBS的適量DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至(1～2)×104cells/mL，將混懸液種植于75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，10mL/瓶，將培養(yǎng)瓶置于37℃、CO2濃度為5%的孵箱中靜置培養(yǎng)。每3d更換培養(yǎng)基并在顯微鏡下觀察生長(zhǎng)情況。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，即可傳代。原代為P0代，擴(kuò)增至P1～P3代用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。取P2代細(xì)胞進(jìn)行克隆形成能力及成骨、成軟骨、成脂肪分化等實(shí)驗(yàn)，鑒定為T(mén)SCs 后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[10]。

2.3C/GP/Co水凝膠的配制 在超凈臺(tái)中，冰浴條件下吸取6mL C溶液加入10mL無(wú)菌離心管中，置于冰上預(yù)冷。再將1mL GP溶液逐滴加入到C溶液中并不斷震蕩離心管，使其充分混合均勻，即可獲得C/GP溶液，體積比為6∶1。將7mLC/GP溶液加入50mL無(wú)菌離心管中，將8mL 2mg/mL的Co溶液快速加入C/GP溶液中，不斷震蕩離心管，使其充分混合均勻，即可獲得C/GP/Co溶液，體積比為6∶1∶8。

2.4IR-780碘化物標(biāo)記TSCs細(xì)胞內(nèi)定位 將P2代TSCs從培養(yǎng)瓶消化下來(lái)，調(diào)整濃度為5×106/mL，分裝于5個(gè)1.5mL無(wú)菌EP管中，每個(gè)EP管200μL。1 000rpm離心5min后棄上清，以含IR-780碘化物20μM的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基200μL重懸細(xì)胞?；靹蚝笾糜?7℃、5%CO2孵箱內(nèi)孵育15min。用含10%FBS的完全培養(yǎng)基重懸為單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL。將標(biāo)記好的TSCs按照1mL/皿接種于激光共聚焦專(zhuān)用培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)24h細(xì)胞完全貼壁，棄培養(yǎng)基，PBS漂洗3次，每次5min。每個(gè)培養(yǎng)皿加入1mL含100nM Mito-Tracker Green熒光探針的培養(yǎng)基，37℃孵育30min，用Hoechst染色液復(fù)染細(xì)胞核。激光共聚焦顯微鏡下觀察IR-780碘化物標(biāo)記TSCs的細(xì)胞內(nèi)定位。

2.5檢測(cè)IR-780碘化物標(biāo)記TSCs的陽(yáng)性率 IR-780碘化物標(biāo)記TSCs方法同上，1 000rpm離心5min后棄上清，用4%多聚甲醛固定30min，再次1 000rpm離心5min后棄上清。每樣品管加入200μL PBS溶液重懸，制備為單細(xì)胞懸液，使用FACStar Plus流式細(xì)胞儀檢測(cè)IR-780標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞比例，以正常未標(biāo)記TSCs為陰性對(duì)照。

2.6檢測(cè)IR-780碘化物標(biāo)記TSCs對(duì)其細(xì)胞周期的影響 將P2代TSCs從培養(yǎng)瓶消化下來(lái)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/mL，分裝于15 mL離心管中。1 000rpm離心5min后棄上清，以含IR-780碘化物20μM的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞?；靹蚝笾糜?7℃、5% CO2孵箱內(nèi)孵育15min。用含10%FBS的完全培養(yǎng)基重懸為單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL。將標(biāo)記好的TSCs及正常TSCs按照2×105/mL接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，IR-780碘化物標(biāo)記細(xì)胞及正常細(xì)胞完全貼壁，棄培養(yǎng)基，PBS漂洗3次，每次5min。用0.25%胰蛋白酶分別將IR-780碘化物標(biāo)記細(xì)胞及正常細(xì)胞從培養(yǎng)瓶消化下來(lái)，1 000rpm離心5min，棄上清。用PBS溶液重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至1.5mL EP管中，1 000rpm離心5min后棄上清。分別加入70%冷乙醇溶液固定IR-780碘化物標(biāo)記細(xì)胞及正常細(xì)胞，置于4℃冰箱，過(guò)夜。分別加入RNase A，37℃條件下30min。分別加入PI，37℃條件下10min。使用FACStar Plus流式細(xì)胞儀檢測(cè)IR-780標(biāo)記細(xì)胞及正常細(xì)胞的細(xì)胞周期。

2.7檢測(cè)IR-780碘化物標(biāo)記TSCs對(duì)其增殖的影響 將標(biāo)記好的P2代TSCs及正常P2代TSCs按照2×105/mL接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，IR-780碘化物標(biāo)記細(xì)胞及正常TSCs完全貼壁，棄培養(yǎng)基，PBS漂洗3次，每次5min。用0.25%胰蛋白酶分別將IR-780碘化物標(biāo)記細(xì)胞及正常TSCs從培養(yǎng)瓶消化下來(lái)，1 000rpm離心5min，棄上清。用含10%FBS的完全培養(yǎng)基將IR-780碘化物標(biāo)記細(xì)胞及正常TSCs重懸制備為單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104/mL。將IR-780碘化物標(biāo)記細(xì)胞及正常TSCs單細(xì)胞懸液分別加入到96孔板中，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，即每孔細(xì)胞總數(shù)為0.2×104/孔。將96孔板置于37℃、5% CO2孵箱中，靜置培養(yǎng)，每3d換液1次。在培養(yǎng)1、4、7d后，按10μL/孔分別加入CCK-8試劑，置于37℃、5% CO2孵箱中，靜置培養(yǎng)2h后在酶標(biāo)儀上讀取波長(zhǎng)為450nm的光密度值(optical density,OD)。各組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

2.8C/GP/Co水凝膠混合IR-780碘化物標(biāo)記的TSCs體內(nèi)活體成像觀察 4只SD大鼠用于活體成像觀察，用2.5%戊巴比妥鈉溶液按大鼠體重(4.5mg/kg)腹腔注射麻醉后，將大鼠左側(cè)后肢置于伸膝、踝背屈90°、稍外展位固定，使左側(cè)跟腱暴露清楚。每只大鼠的左側(cè)后肢制作跟腱缺損模型，右側(cè)后肢不做任何處置。將大鼠左側(cè)后肢局部褪毛，常規(guī)消毒鋪巾。將SD大鼠左側(cè)跟腱處皮膚縱行切開(kāi)約1.5 cm，鈍性分離跟腱周?chē)M織，將跟腱完整暴露。然后將跟腱中間1/3完整切除，上至肌腱連接處，下至跟骨，缺損大小約10mm×1mm。術(shù)后用絲線逐層縫合皮膚及皮下組織。由同一名術(shù)者完成4只SD大鼠的左側(cè)跟腱缺損模型制作。

在超凈臺(tái)中，冰浴條件下制備C/GP/Co溶液1.5mL。收集IR-780碘化物標(biāo)記的TSCs 4×106個(gè)，將4×106個(gè)細(xì)胞加入1.5mL C/GP/Co溶液中，充分混合均勻，備用。用1mL注射器抽取300μL上述混合溶液，注射至大鼠左側(cè)跟腱損傷部位。用相同方法，由同一名術(shù)者依次完成4只SD大鼠左側(cè)跟腱的注射。將4只SD大鼠分籠飼養(yǎng)，自由活動(dòng)。4只SD大鼠分別于注射后1、7、14、28d用CO2麻醉后，置于KODAK多功能活體成像系統(tǒng)內(nèi)觀察，用Kodak MI software 5.0.1軟件進(jìn)行熒光信號(hào)強(qiáng)度分析。

2.9C/GP/Co水凝膠混合IR-780碘化物標(biāo)記的TSCs體內(nèi)注射后的組織學(xué)分析 8只SD大鼠用于組織學(xué)分析，大鼠跟腱損傷模型及C/GP/Co水凝膠混合IR-780碘化物標(biāo)記的TSCs注射方法同上。分別于注射后1、7、14、28d隨機(jī)取2只SD大鼠，用CO2過(guò)度麻醉法處死后，取材用于組織學(xué)觀察。先剔除大鼠跟腱腱膜及周?chē)窘M織，放入組織盛裝盒內(nèi)，加入組織保存液，迅速轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱，冷凍30min。待肌腱組織冷凍為固體后，轉(zhuǎn)移至冰凍切片機(jī)切片，切片厚度8μm。將兩張相鄰切片貼附于干凈的載玻片上，4%多聚甲醛固定30min，室溫晾干。用DAPI染色液染色10min，水溶性封片劑封片。切片于Leica激光共聚焦顯微鏡下觀察。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1 IR-780碘化物標(biāo)記TSCs的細(xì)胞內(nèi)定位

激光共聚焦顯微鏡下觀察，可見(jiàn)IR-780碘化物標(biāo)記TSCs的熒光信號(hào)呈紅色，分布在細(xì)胞胞漿，呈點(diǎn)狀及線狀形態(tài)。用線粒體特異性探針Mito-tracker green雙標(biāo)后發(fā)現(xiàn)，Mito-tracker green的綠色熒光與IR-780紅色熒光共同定位于細(xì)胞線粒體，證實(shí)IR-780標(biāo)記TSCs定位于細(xì)胞線粒體內(nèi)。見(jiàn)圖1。

圖1 IR-780碘化物標(biāo)記大鼠TSCs細(xì)胞內(nèi)定位。Hoechst染細(xì)胞核，呈藍(lán)色；Mito-tracker green為綠色熒光；IR-780為紅色熒光。標(biāo)尺：2μm

2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)IR-780碘化物標(biāo)記TSCs的陽(yáng)性率

IR-780碘化物標(biāo)記的TSCs經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，細(xì)胞標(biāo)記陽(yáng)性率95.75%，熒光強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組細(xì)胞。見(jiàn)圖2。

3 IR-780碘化物標(biāo)記對(duì)TSCs細(xì)胞周期的影響

IR-780碘化物標(biāo)記的TSCs經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)：IR-780對(duì)TSCs的細(xì)胞周期無(wú)顯著影響。IR-780碘化物標(biāo)記的TSCs與正常TSCs的細(xì)胞周期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖3。

圖3 IR-780碘化物標(biāo)記大鼠TSCs對(duì)其細(xì)胞周期的影響。 a.正常TSCs的細(xì)胞周期；b.IR-780碘化物標(biāo)記的TSCs的細(xì)胞周期

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)IR-780碘化物標(biāo)記TSCs的陽(yáng)性率。a.正常TSCs；b.IR-780碘化物標(biāo)記的TSCs

4 IR-780碘化物標(biāo)記對(duì)TSCs細(xì)胞增殖能力的影響

TSCs及IR-780碘化物標(biāo)記TSCs在培養(yǎng)1、4及7d時(shí)兩組細(xì)胞的OD值均逐漸增高，與正常TSCs相比，IR-780碘化物標(biāo)記對(duì)細(xì)胞的增殖能力無(wú)顯著影響，各時(shí)間點(diǎn)兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖4。TSCs及IR-780碘化物標(biāo)記TSCs在培養(yǎng)1、4及7d時(shí)兩組細(xì)胞的OD值均逐漸增高，各時(shí)間點(diǎn)兩組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 CCK-8法檢測(cè)IR-780碘化物標(biāo)記TSCs增殖的影響

5 C/GP/Co水凝膠混合IR-780碘化物標(biāo)記的TSCs在大鼠體內(nèi)活體成像觀察

大鼠左側(cè)跟腱損傷部位注射C/GP/Co水凝膠混合IR-780碘化物標(biāo)記的TSCs溶液后，分別于注射后1、7、14、28d活體成像觀察。注射后1d活體成像觀察顯示：大鼠左側(cè)跟腱損傷區(qū)域及周?chē)?，可檢測(cè)到強(qiáng)熒光信號(hào)，與周?chē)M織比較明顯。注射后7、14及28d，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，熒光信號(hào)逐漸減弱，但注射后28d仍可檢測(cè)到明顯熒光信號(hào)。見(jiàn)圖5。

圖5 C/GP/Co水凝膠混合IR-780碘化物標(biāo)記的TSCs在大鼠體內(nèi)活體成像觀察。a.注射后1d；b.注射后7d：c.注射后14d：d.注射后28d

6 激光共聚焦顯微鏡觀察

大鼠跟腱組織熒光染色激光共聚焦顯微鏡下觀察，可見(jiàn)IR-780碘化物標(biāo)記TSCs的熒光信號(hào)呈紅色，分布在細(xì)胞胞漿，DAPI染細(xì)胞核，熒光信號(hào)呈藍(lán)色。IR-780碘化物標(biāo)記TSCs的熒光信號(hào)在注射后1d時(shí)最強(qiáng)，注射后7、14及28d，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，熒光信號(hào)呈逐漸減弱趨勢(shì)，但注射后28d仍可檢測(cè)到明顯熒光信號(hào)。見(jiàn)圖6。

圖6 C/GP/Co水凝膠混合IR-780碘化物標(biāo)記的TSCs注射至大鼠體內(nèi)后激光共聚焦顯微鏡觀察。DAPI染細(xì)胞核，熒光信號(hào)呈藍(lán)色；IR-780為紅色熒光。標(biāo)尺：5μm。IR-780熒光信號(hào)在1d時(shí)最強(qiáng)，注射后7、14及28d，熒光信號(hào)呈逐漸減弱趨勢(shì)， 28d時(shí)仍可檢測(cè)到明顯紅色熒光信號(hào)

討 論

干細(xì)胞移植治療肌腱損傷修復(fù)過(guò)程中，對(duì)移植后的干細(xì)胞進(jìn)行非侵入性的實(shí)時(shí)觀察至關(guān)重要。干細(xì)胞標(biāo)記及示蹤技術(shù)一直是干細(xì)胞移植損傷修復(fù)研究的難點(diǎn)，通過(guò)細(xì)胞示蹤技術(shù)監(jiān)測(cè)干細(xì)胞移植后在機(jī)體內(nèi)的存活、分布、增殖及分化情況，是干細(xì)胞移植治療領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。移植干細(xì)胞的示蹤及監(jiān)測(cè)，對(duì)評(píng)估其治療效果至關(guān)重要[11]。干細(xì)胞標(biāo)記及示蹤技術(shù)目前常用的有熒光蛋白標(biāo)記示蹤法、磁共振對(duì)比增強(qiáng)劑標(biāo)記示蹤法、熒光染料標(biāo)記示蹤法、核酸標(biāo)記技術(shù)及同位素標(biāo)記技術(shù)等[2]。

熒光蛋白示蹤的原理是通過(guò)質(zhì)粒、腺病毒及慢病毒等載體，將熒光蛋白基因與目的基因整合后在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，經(jīng)激發(fā)光照射后發(fā)出熒光。常見(jiàn)的有綠色熒光蛋白(greenfluorescent protein,GFP)及紅色熒光蛋白(red fluorescentprotein，RFP)等。GFP有很多優(yōu)點(diǎn)，不需加入底物或酶即可發(fā)射穩(wěn)定的綠色熒光，可在熒光顯微鏡下觀察活細(xì)胞情況等。但GFP標(biāo)記存在實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、費(fèi)用高的缺點(diǎn)。此外，GFP還存在表達(dá)水平在不同動(dòng)物個(gè)體間及同一動(dòng)物不同細(xì)胞間差異很大；移植前GFP高表達(dá)，移植后可能出現(xiàn)低表達(dá)等[12]。磁共振對(duì)比增強(qiáng)劑標(biāo)記示蹤法，其原理是在體外將待移植細(xì)胞用MRI增強(qiáng)劑標(biāo)記后移植至體內(nèi)，然后利用MRI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行追蹤。目前研究較多的是磁共振示蹤劑是超順磁性氧化鐵(SPIO)，但其細(xì)胞標(biāo)記率較低，且MRI檢測(cè)不能反映干細(xì)胞的存活狀態(tài)和微環(huán)境的變化[13]。

NIR熒光成像技術(shù)具有較強(qiáng)的組織穿透能力，NIR在其光譜范圍內(nèi)能在機(jī)體及組織自發(fā)熒光，對(duì)組織細(xì)胞的低毒性及高敏感性等特點(diǎn)，且可以實(shí)時(shí)、無(wú)創(chuàng)、體外連續(xù)監(jiān)測(cè)，檢測(cè)靈敏度高、操作較容易，并能進(jìn)行非侵入式的實(shí)時(shí)深層組織成像，在干細(xì)胞標(biāo)記示蹤中展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力[14-15]。

七甲川花菁染料作為一類(lèi)經(jīng)典的近紅外熒光探針，當(dāng)前已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)成像研究。IR-780碘化物是七甲川菁染料中的一種新型近紅外熒光小分子，在干細(xì)胞標(biāo)記、移植后動(dòng)物活體成像及組織學(xué)檢查中均有明顯優(yōu)勢(shì)。Zhang等[9]用近紅外熒光染料IR-780碘化物對(duì)大鼠來(lái)源皮膚干細(xì)胞等進(jìn)行標(biāo)記，研究結(jié)果表明：IR-780碘化物能簡(jiǎn)單、有效地標(biāo)記干細(xì)胞，且對(duì)干細(xì)胞的增殖、分化影響較小，此外部分來(lái)自標(biāo)記細(xì)胞的泄漏染料可以被血液循環(huán)系統(tǒng)清除掉，對(duì)干細(xì)胞周?chē)礃?biāo)記的細(xì)胞影響不明顯。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，IR-780碘化物可有效標(biāo)記TSCs，靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、方便價(jià)廉，對(duì)細(xì)胞或機(jī)體影響小。IR-780碘化物標(biāo)記TSCs后定位于細(xì)胞的線粒體內(nèi)，對(duì)細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯影響。IR-780碘化物標(biāo)記的TSCs在活體成像系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間示蹤及觀察，且可在激光共聚焦顯微鏡下行組織學(xué)觀察。

筆者的研究結(jié)果證實(shí)：IR-780碘化物可有效標(biāo)記TSCs并用于實(shí)時(shí)示蹤，C/GP/Co水凝膠包裹IR-780碘化物標(biāo)記的TSCs注射至大鼠跟腱損傷部位后，TSCs在肌腱損傷部位存活良好，IR-780碘化物標(biāo)記TSCs的熒光信號(hào)在注射后1d時(shí)最強(qiáng)，注射后7、14及28d，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，熒光信號(hào)呈逐漸減弱趨勢(shì)，但注射28d后活體成像及激光共聚焦顯微鏡觀察仍可檢測(cè)到明顯熒光信號(hào)，且大鼠身體其他部位從注射后1～28d均無(wú)顯著IR-780碘化物熒光信號(hào)。TSCs通過(guò)C/GP/Co水凝膠包裹注射至大鼠跟腱損傷部位，可長(zhǎng)時(shí)間存活并駐留于損傷部位發(fā)揮治療效應(yīng)。C/GP/Co水凝膠包裹TSCs可用于進(jìn)一步的動(dòng)物跟腱損傷體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。