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    不同地區(qū)米酒曲細(xì)菌多樣性解析及表型預(yù)測(cè)

    2021-10-24 03:18:48王文平熊英梅陳賽浙侯強(qiáng)川劉忠軍
    食品工業(yè)科技 2021年20期

    王文平,熊英梅,陳賽浙,侯強(qiáng)川,劉忠軍,郭 壯,

    (1.湖北文理學(xué)院,湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心,湖北襄陽 441053;2.湖北堯治河楚翁泉酒業(yè)有限公司,湖北襄陽 441600;3.襄陽市釀酒生物技術(shù)與應(yīng)用企校聯(lián)合創(chuàng)新中心,湖北襄陽 441053)

    米酒曲通常是在特定的生態(tài)環(huán)境內(nèi),用成曲在開放體系中培養(yǎng)生產(chǎn)而成,含有豐富的微生物種類和酶系[1]。米酒曲在米酒發(fā)酵過程中起發(fā)酵和糖化生香作用,并最終決定了成品酒的產(chǎn)率和品質(zhì)風(fēng)味[2]。米酒曲中主要存在霉菌、酵母菌和細(xì)菌3個(gè)微生物類群,其中霉菌可降解淀粉和發(fā)酵糖類等物質(zhì),酵母菌可將糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成酒精,而細(xì)菌則賦予米酒獨(dú)特的風(fēng)味品質(zhì)[3]。按照傳統(tǒng)方式制作的米酒曲受“母種”質(zhì)量的影響較大,加之季節(jié)氣候、生產(chǎn)和地理環(huán)境等綜合因素的影響,故而米酒曲的質(zhì)量參差不齊,且容易混入產(chǎn)毒性的菌株[4]。蔡海鶯等[5]通過對(duì)12種甜米酒酒曲細(xì)菌類群進(jìn)行分離鑒定和測(cè)序發(fā)現(xiàn),其含有大量芽孢桿菌(Bacillus)、少量的病原菌和腐敗菌。

    近年來,以MiSeq等第二代高通量測(cè)序技術(shù)為代表的分子生物學(xué)手段被廣泛應(yīng)用于米酒[6]、泡菜[7]和臭豆腐[8]等發(fā)酵食品微生物群落結(jié)構(gòu)的解析中,在非優(yōu)勢(shì)和不可培養(yǎng)微生物類群檢測(cè)方面具有較大優(yōu)勢(shì),有效彌補(bǔ)了傳統(tǒng)純培養(yǎng)方式的不足。本研究以采集自廣西壯族自治區(qū)南寧市和湖北省孝感市的米酒曲為研究對(duì)象,在采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其細(xì)菌多樣性進(jìn)行解析的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步采用BugBase軟件對(duì)其細(xì)菌類群的表型進(jìn)行分析,以期為后續(xù)米酒品質(zhì)和安全性的提升提供數(shù)據(jù)支撐。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    廣西壯族自治區(qū)南寧市米酒曲樣本 分別采集自淡村農(nóng)貿(mào)市場(108°31′E,22°78′N)、瑯東農(nóng)貿(mào)市場(108°38′E,22°82′N)、仙 葫 農(nóng) 貿(mào) 市 場(108°44′E,22°81′N);湖北省孝感市米酒曲樣本 分別采集自大東門農(nóng)貿(mào)市場(113°92′E,30°92′N)、嚴(yán)橋市場(113°94′E,30°94′N)。每個(gè)地區(qū)采集米酒曲樣本10個(gè),合計(jì)采集20個(gè);所有米酒曲樣本均以糯米為原料制作而成,部分樣本中含有辣蓼草等中草藥;基因組提取試劑盒 德國QIAGEN公司;Fast-Pfu Fly DNA Polymerase、FastPfu Fly DNA聚合酶(5 U/μL)、dNTPs Mix 北京全式金生物技術(shù)有限公司。

    vetiri梯度基因擴(kuò)增儀 美國ABI公司;MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái) 美國Illumina公司;ND-2000C微量紫外分光光度計(jì) 美國Nano Drop公司;R930機(jī)架式服務(wù)器 美國DELL公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 宏基因組DNA的提取、PCR擴(kuò)增及Illumina高通量測(cè)序 取1.0 g研磨碎的米酒曲樣本使用DNA提取試劑盒進(jìn)行宏基因組DNA提取,按照Wang等[9]方法進(jìn)行16S rRNA V3~V4區(qū)擴(kuò)增,合格的PCR產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司使用MiSeq PE300平臺(tái)測(cè)序。

    1.2.2 生物信息學(xué)分析 參照Wang等[10]的方法對(duì)序列進(jìn)行拼接和質(zhì)控,使用QIIME(v1.9.1)平臺(tái)[11]對(duì)質(zhì)控后的數(shù)據(jù)進(jìn)行多樣性評(píng)價(jià),使用PyNAST[12]將序列對(duì)齊,使用UCLUST兩步法建立操作分類單元(Operational taxonomic units,OTU)[13],使用SILVE數(shù)據(jù)庫[14]、Greengene數(shù)據(jù)庫[15]和RDP(Ribosomal Database Project,Release 11.5)數(shù)據(jù)庫[16]確定細(xì)菌分類學(xué)地位。

    1.2.3 核酸登錄號(hào) 本研究中所有序列數(shù)據(jù)已提交至MG-RAST數(shù)據(jù)庫,ID號(hào)為mgp97489。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    使用R軟件的ggpubr包和ggplot2包繪制香農(nóng)指數(shù)(Shannon Index)、辛普森指數(shù)(Simpson Index)和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)(Observed Species)的小提琴圖,使用柱形圖評(píng)估米酒曲中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門和屬的相對(duì)含量及其分布,采用威爾科克森符號(hào)秩(Wilcoxon)檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析,基于加權(quán)和非加權(quán)距離主坐標(biāo)分析多元方差分析(multivariate analysis of variance,MANOVA)解析2個(gè)地區(qū)米酒曲細(xì)菌類群的β多樣性,使用R軟件的UpSetR包基于OTU水平分析不同樣本間OTU的分布,將OTU矩陣與樣本的分類信息上傳至BugBase網(wǎng)站(https://bugbase.cs.umn.edu/)進(jìn)行表型預(yù)測(cè)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同地區(qū)米酒曲細(xì)菌類群α和β多樣性的比較分析

    本研究采用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)20個(gè)米酒曲樣本進(jìn)行測(cè)序,共得到高質(zhì)量序列686478條,平均每個(gè)樣本34324條。香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)是評(píng)價(jià)α多樣性的重要指標(biāo)。兩個(gè)地區(qū)米酒曲樣本的α多樣性結(jié)果如圖1所示。

    由圖1可知,南寧地區(qū)米酒曲細(xì)菌類群的香農(nóng)指數(shù)顯著低于孝感地區(qū)(P<0.05),但兩者的辛普森指數(shù)和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)并無顯著性差異(P>0.05)。由此可見,南寧地區(qū)米酒曲細(xì)菌類群的多樣性偏低。

    圖1 不同地區(qū)米酒曲香農(nóng)指數(shù)(A)、辛普森指數(shù)(B)和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)(C)α多樣性指標(biāo)比較分析Fig.1 Comparative analysis of α diversity indexes including Shannon index (A), Simpson index (B) and the number of observed species (C) of rice wine koji from different regions

    本研究進(jìn)一步對(duì)2個(gè)地區(qū)米酒曲細(xì)菌類群的β多樣性進(jìn)行了解析,結(jié)果如圖2所示。

    由圖2A可知,雖然2個(gè)地區(qū)的米酒曲樣本在空間排布上存在部分交疊現(xiàn)象,但整體呈現(xiàn)分離趨勢(shì),經(jīng)MANOVA檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2個(gè)地區(qū)米酒曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著(P<0.05)。由圖2B可知,雖然2個(gè)地區(qū)樣本在空間排布上亦呈現(xiàn)出明顯的分離趨勢(shì),其中南寧地區(qū)樣本聚集為三簇,而孝感地區(qū)聚集為兩簇,但經(jīng)MANOVA檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩者差異并不顯著(P>0.05)。由此可見,2個(gè)地區(qū)米酒曲蘊(yùn)含細(xì)菌類群的種類具有相似性,但其豐度可能存在一定差異。鑒于上述分析結(jié)果,本研究進(jìn)一步在分類學(xué)地位“門”和“屬”水平上對(duì)2個(gè)地區(qū)米酒曲細(xì)菌類群進(jìn)行了比較分析。

    圖2 基于加權(quán)(A)和非加權(quán)(B)UniFrac距離的主坐標(biāo)分析Fig.2 Principal coordinate analysis based on weighted (A) and unweighted (B) UniFrac distance

    2.2 不同地區(qū)米酒曲細(xì)菌類群門、屬結(jié)構(gòu)分析

    南寧和孝感地區(qū)米酒曲相對(duì)含量大于1.0%細(xì)菌門的構(gòu)成如圖3所示。

    由圖3可知,南寧地區(qū)米酒曲中平均相對(duì)含量>1.0%的細(xì)菌門為Firmicutes(厚壁菌門,94.58%)和Proteobacteria(變形菌門,5.14%),孝感地區(qū)為Firmicutes(厚壁菌門,83.01%)、Proteobacteria(變形菌門,15.15%)和Cyanobacteria(藍(lán)細(xì)菌,1.07%)。由圖3可知,兩個(gè)地區(qū)的米酒曲樣本中隸屬于Firmicutes和Proteobacteria的細(xì)菌類群含量差異顯著(P<0.05)。相對(duì)含量>1.0%的細(xì)菌屬及其顯著性分析如圖4所示。

    圖3 不同地區(qū)米酒曲相對(duì)含量>1.0%的細(xì)菌門及顯著性分析Fig.3 Bacterial phyla with relative abundance >1.0% of rice wine koji from different regions and their significance analysis

    由圖4可知,南寧地區(qū)米酒曲中平均相對(duì)含量>1.0%的細(xì)菌屬為Lactobacillus(乳桿菌屬,62.03%)、Weissella(魏斯氏菌屬,16.29%)、Lactococcus(乳球菌屬,9.74%)、Pediococcus(片球菌屬,2.64%)、Leuconostoc(明串珠菌屬,2.36%)、Salmonella(沙門氏菌屬,2.28%)和Gluconobacter(葡糖桿菌屬,1.45%),孝感地區(qū)米酒曲為Weissella(魏斯氏菌屬,50.14%)、Lactococcus(乳球菌屬,15.42%)、Lactobacillus(乳桿菌屬、5.08%)、Pediococcus(片球菌屬,4.55%)、Leuconostoc(明串珠菌屬,3.07%)、Enterobacter(腸桿菌屬,2.88%)、Macrococcus(巨型球菌屬,2.86%)、Staphylococcus(葡萄球菌屬,2.08%)、Acinetobacter(不動(dòng)桿菌屬,1.43%)、Salmonella(沙門氏菌屬,1.41%)和Acetobacter(醋酸桿菌屬,1.11%)。由此可見,南寧地區(qū)米酒曲細(xì)菌類群以Lactobacillus為主,而孝感地區(qū)以Weissella為主,經(jīng)Wilcoxon檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)上述兩個(gè)屬在不同地區(qū)米酒曲中的相對(duì)含量差異均極顯著(P<0.001)。除此之外,孝感地區(qū)米酒曲中Enterobacter的相對(duì)含量高度顯著偏高(P<0.01)。由此可見,雖然同一細(xì)菌屬在兩個(gè)地區(qū)米酒曲中均存在,但其相對(duì)含量存在較大差異,這也與圖2得到的結(jié)論一致。

    圖4 不同地區(qū)米酒曲相對(duì)含量>1.0%的細(xì)菌屬及顯著性分析Fig.4 Bacterial genera with relative abundance >1.0% of rice wine koji from different regions and their significance analysis

    乳酸菌能夠產(chǎn)生乳酸菌素等物質(zhì),在米酒的發(fā)酵過程中能夠抑制雜菌的生長[17]。米酒酸味的主要來源是乳酸菌產(chǎn)生的乳酸,而乳酸和乙醇反應(yīng)生成酯類是米酒主要的風(fēng)味來源,同時(shí)在乳酸菌的代謝過程中產(chǎn)生乙酰和雙乙酰,賦予米酒特殊的風(fēng)味[18]。Jiao等[19]采用變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技術(shù)對(duì)米酒細(xì)菌類群進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),參與發(fā)酵的乳酸菌多樣性越高則米酒的感官特性酒越好,因而在米酒發(fā)酵過程中提高乳酸菌的多樣性有利于提高米酒的感官品質(zhì)。Lactobacillus和Weissella均為乳酸菌,向凡舒研究指出Lactobacillus fermentum(發(fā)酵乳桿菌)、Lactobacillus agilis(能動(dòng)乳桿菌)和Lactococcus lactis(乳酸乳球菌)為湖北省孝感地區(qū)米酒中優(yōu)勢(shì)乳酸菌,Weissella cibaria(食竇魏斯氏乳酸菌)、Lactobacillus johnsonii(約漢遜氏乳桿菌)和Lactobacillus brevis(短乳桿菌)為四川省成都地區(qū)米酒中優(yōu)勢(shì)乳酸菌,不同地區(qū)米酒中乳酸菌的類群存在一定的差異[20]。由此可見,米酒和米酒曲中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群均為乳酸菌,乳酸菌的類群構(gòu)成對(duì)米酒的風(fēng)味品質(zhì)形成影響較大。

    2.3 基于OTU水平不同地區(qū)米酒曲細(xì)菌類群分析

    經(jīng)過100%和97%相似度進(jìn)行OTU劃分后共得到3366個(gè)OTU,樣本中的OTU分布結(jié)果如圖5所示。

    圖5 OTU在不同樣本中的分布Fig.5 Distribution of OTUs in different samples

    本研究發(fā)現(xiàn)僅有1個(gè)OTU在所有米酒曲樣本中均存在,隸屬于Weissella,其在南寧和孝感地區(qū)米酒曲中的平均相對(duì)含量分別為1.35%和8.77%,地區(qū)之間差異并不顯著(P>0.05);有2個(gè)OTU在19個(gè)樣本中存在,分別隸屬于Staphylococcus和Pediococcus,累計(jì)平均相對(duì)含量為3.16%;有6個(gè)OTU在18個(gè)樣本中存在,隸屬于Lactobacillus、棒形桿菌屬(Clavibacter)和Weissella,累計(jì)平均相對(duì)含量為34.09%。有1085個(gè)OTU僅存在一個(gè)樣本中,包含序列條數(shù)僅有13419條,僅占所有序列條數(shù)的2.00%,但并沒有OTU僅存在某一地區(qū)所有米酒曲中。由此可見,南寧和孝感地區(qū)的米酒曲雖然各自含有少量獨(dú)特的細(xì)菌類群,但更多的是共有大量的細(xì)菌類群。

    2.4 不同地區(qū)米酒曲細(xì)菌類群表型結(jié)果分析

    將OTU矩陣與樣本的分類信息上傳至BugBase網(wǎng)站進(jìn)行表型預(yù)測(cè),結(jié)果如圖6所示。

    由圖6可知,南寧地區(qū)米酒曲中革蘭氏陽性菌含量高度顯著高于孝感地區(qū)(P<0.01),而在氧化脅迫耐受、生物膜形成、革蘭氏陰性以及兼性厭氧方面呈現(xiàn)出高度顯著的相反趨勢(shì)(P<0.01)。雖然兩個(gè)地區(qū)米酒曲中均存在一定數(shù)量的致病菌,但是南寧地區(qū)米酒曲中致病菌的致病潛力要高度顯著低于孝感地區(qū)(P<0.01)。農(nóng)戶家自制的米酒曲方式較為傳統(tǒng),且制作方式較為開放,環(huán)境中的病原菌或其他微生物混入米酒曲之中可能造成米酒曲的污染,因而對(duì)米酒曲的制作方式進(jìn)行規(guī)范化,保持環(huán)境衛(wèi)生和篩選優(yōu)良特性的發(fā)酵菌株對(duì)于提升米酒的品質(zhì)和安全性均具有積極意義。

    3 結(jié)論

    南寧地區(qū)米酒曲細(xì)菌類群以Lactobacillus為主,而孝感地區(qū)以Weissella為主,且南寧地區(qū)米酒曲細(xì)菌類群的多樣性偏低。雖然南寧和孝感地區(qū)米酒曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯的差異,但這種差異主要是由于同一細(xì)菌類群在2個(gè)地區(qū)樣本中的含量不同導(dǎo)致的,每個(gè)地區(qū)米酒曲中并不含有太多獨(dú)特的細(xì)菌類群。

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