磺胺二甲嘧啶在黃河鯉體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)研究

許振山，張偉麗，孫曉彤，王先鋒，李 慧，梁俊平

（河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院/河南省水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453007）

黃河鯉(Cyprinus carpio)，屬鯉形目、鯉科、鯉亞科，是我國(guó)黃河流域長(zhǎng)期自然形成的特有的重要淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，是我國(guó)寶貴的魚(yú)類資源[1]。五大名鯉之一的黃河鯉是河南省的重要養(yǎng)殖品種，養(yǎng)殖產(chǎn)量約占全省養(yǎng)殖魚(yú)類中的30%[2]。近年來(lái)，黃河鯉采取集約化池塘養(yǎng)殖模式，通過(guò)高密度放養(yǎng)苗種、大量投飼、投喂高營(yíng)養(yǎng)飼料等，單位面積產(chǎn)量獲得大量提高，然而，隨之病害也頻繁發(fā)生。近年來(lái)暴發(fā)的鯉魚(yú)爛鰓病，給其養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。養(yǎng)殖戶不得不使用各種藥物以減少損失、獲得養(yǎng)殖成功[3?4]。由于部分養(yǎng)殖戶缺乏科學(xué)的用藥技術(shù)，加之許多漁藥是從獸藥直接轉(zhuǎn)移而來(lái)，缺乏科學(xué)用藥指導(dǎo)，因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中存在一定的用藥誤區(qū)，給黃河鯉的健康養(yǎng)殖及其食用帶來(lái)了潛在風(fēng)險(xiǎn)。

磺胺類藥物是黃河鯉養(yǎng)殖生產(chǎn)中常用的化學(xué)合成抗菌藥，具有抗菌譜廣、性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)?；前范奏奏な腔前奉愃幬镏锌咕饔米顝?qiáng)的藥物之一，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性、革蘭氏陰性細(xì)菌都有抑制作用[5?6]。目前，關(guān)于磺胺二甲嘧啶的代 謝 動(dòng) 力 學(xué) 研 究，主 要 集 中 在 雞[7?8]、豬[9]、牛[10?11]、羊[12]等畜禽，在水產(chǎn)動(dòng)物中，僅見(jiàn)于大菱鲆(Scophthalmus maximus)[13?14]、銀 鯽(Carassius auratus gibelio)[15]、鯽(Carassius auratu)[16]和 黑 鮶(Sebastodes fuscescens)[17]中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)及殘留研究，在黃河鯉中的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用的磺胺二甲嘧啶主要為獸藥中移植而來(lái)，缺乏相關(guān)的藥效學(xué)、藥理學(xué)研究，無(wú)法制定出科學(xué)合理的給藥方案，因而形成惡性循環(huán)，容易造成藥物過(guò)量殘留，影響食用安全[18?19]。鑒于此，以黃河鯉為研究對(duì)象，研究磺胺二甲嘧啶在其體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)特征，依據(jù)PK/PD 模型，探討磺胺二甲嘧啶在黃河鯉養(yǎng)殖中最佳給藥方案，以減少藥物殘留，保障消費(fèi)者食用安全。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 健康黃河鯉購(gòu)于鄭州中牟某養(yǎng)殖場(chǎng)，體質(zhì)量（60±5）g，養(yǎng)殖于循壞流水養(yǎng)殖系統(tǒng)，水溫（23±2)℃，連續(xù)充氣，試驗(yàn)前檢測(cè)無(wú)藥物殘留，每天投喂3 次商品配合飼料，暫養(yǎng)14 d 后開(kāi)始正式試驗(yàn)。

1.1.2 試驗(yàn)藥品及試劑 磺胺二甲嘧啶原粉（含量≥99.0%，美侖公司），磺胺二甲嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品（含量≥99.0%，美侖公司），N4-乙?；前范奏奏?biāo)準(zhǔn)品（含量≥99.9%，Witega），乙腈（含量≥95.0%，Merck 公司）；冰醋酸（含量≥99.5%），磷酸、三乙胺（含量≥95.0%），正己烷（含量≥95.0%）均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 高效液相色譜儀（Agilent Technologies 1260 Infinity）；紫 外 檢 測(cè) 器（Agilent Technologies 1260 Infinity G4225A）；色 譜 柱 為Aglient Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.2 給藥及取樣

給藥方法：根據(jù)黃河鯉平均體質(zhì)量，計(jì)算給藥劑量20 mg/kg 所需要的磺胺二甲嘧啶為0.13 g。準(zhǔn)確稱取磺胺二甲嘧啶原粉0.13 g，用適量NaOH 助溶，再用0.65%滅菌生理鹽水作為溶劑配成質(zhì)量濃度為13 g/L 的藥液。濕毛巾包裹魚(yú)體，用1 mL 無(wú)菌注射器吸取0.1 mL 配制好的藥溶液進(jìn)行尾靜脈注射或口灌，觀察無(wú)出血、無(wú)回吐的鯉魚(yú)用于試驗(yàn)。

取樣方法：分別于給藥后的0.25、0.5、1、2、4、6、12、24、48、72 h 等時(shí)間點(diǎn)取樣，同一時(shí)間點(diǎn)取7 尾魚(yú)。用1 mL 無(wú)菌注射器尾靜脈取血，置于2 mL 的離心管中，在5 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，離心后取上層血清于新的2 mL 離心管中，放置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)將魚(yú)解剖，取部分肌肉、全部腦組織，剝離出腎臟和肝臟等組織樣品，放置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 色譜檢測(cè)

1.3.1 樣品前處理 血清處理：將血清樣品于室溫條件下解凍后，5 000 r/min離心10 min，取500 μL上清液于離心管中，加入4 mL 乙腈，置旋渦儀中渦旋至沉淀均一無(wú)塊狀，放置片刻，再次渦旋，靜置2 h后以5 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移到玻璃試管中，用氮吹儀于37 ℃水浴吹干，加入1 mL 配制好的流動(dòng)相溶液（乙腈∶磷酸=20∶80）和500 μL 的 正 己 烷，使 用 旋 渦 儀 渦 旋10 s，靜 置30 min，棄上層吸取下層溶液，用0.22 μm 微孔有機(jī)濾膜過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。

組織處理：待組織樣品在室溫解凍后，用電子天平準(zhǔn)確稱量腦、腎臟、肝臟的質(zhì)量，肌肉稱取1 g。將組織剪碎并放于10 mL 的離心管中，加入1 mL 乙腈，用組織勻漿機(jī)12 000 r/min 勻漿30 s，分別用2 mL 和1 mL 乙腈清洗刀頭2 次，合并3 次提取液，渦旋至沉淀均一無(wú)塊狀，靜置2 h后以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移到玻璃試管中。之后操作步驟與血液處理方法相同。

1.3.2 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax TC-C18的（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相∶乙腈:磷酸（0.01 mol/L，pH 值3.4）=20∶80；紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)267 nm；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.005 g磺胺二甲嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品，用5 mL 0.1%的NaOH溶液助溶，然后用流動(dòng)相定容至50 mL，配成100 mg/L 的母液，再用流動(dòng)相分別稀釋成50.00、25.00、10.00、5.00、1.00、0.50 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，將其保存于4 ℃的冰箱中備用。N4-乙酰化磺胺二甲嘧啶標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法與磺胺二甲嘧啶相同。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別取500 μL 質(zhì)量濃度為50.00、25.00、10.00、5.00、1.00、0.50 mg/L 的磺胺二甲嘧啶標(biāo)準(zhǔn)溶液和N4-乙?；前范奏奏?biāo)準(zhǔn)溶液加入到500 μL空白血清中，按照前述樣品處理方法，最后定容到500 μL。分別取1 mL 質(zhì)量濃度分別為50.00、25.00、10.00、5.00、1.00、0.50 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品加入到1 g腦、肌肉、腎臟、肝臟4種組織的空白樣品中，按照前述樣品處理方法，最后定容到1 mL。所得溶液經(jīng)0.22 μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾后進(jìn)行高效液相色譜儀測(cè)定，將所得結(jié)果以峰面積為橫坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析 血液中藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)采用DAS 2.0 藥物代謝動(dòng)力學(xué)軟件進(jìn)行分析，用一、二和三室模型分別以權(quán)重1、1/C、1/C2進(jìn)行擬合，根據(jù)AIC 和R2值來(lái)判斷最適合的房室模型，并計(jì)算藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

1.4.2 磺胺二甲嘧啶給藥劑量計(jì)算 根據(jù)Css=F×X0/（Vd×K10×τ）計(jì)算黃河鯉磺胺二甲嘧啶給藥劑量[20]。式中，Css：期望達(dá)到的穩(wěn)態(tài)血藥濃度；F：生物利用度；X0：每日給藥劑量；Vd：表觀分布容積；K10：藥物在中央室消除速率；τ：給藥間隔時(shí)間。X0=Css×K10×Vd×τ/F。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線

磺胺二甲嘧啶質(zhì)量濃度為0.50～50.00 mg/L 時(shí)，其在血液、腦、肌肉、腎臟、肝臟中的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.007 7x+0.115 8（R2=0.999 8）、y=0.009 4x-0.208（R2=0.999 9）、y=0.009 1x-0.008 3（R2=0.999 9）、y=0.008 1x+0.039 1（R2=0.997 7）、y=0.014 8x-0.261 5（R2=0.999 6）。N4-乙酰化磺胺二甲嘧啶質(zhì)量濃度在0.50～50.00 mg/L 時(shí)，其在血液、腦、肌肉、腎臟、肝臟中的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.009 9x（R2=0.998 6）、y=0.009 8x-0.277 8（R2=0.999 4）、y=0.001 6x-0.074 8（R2=0.999 6）、y=0.010 7x-0.242 9（R2=0.999 4）、y=0.014 8x-0.261 5（R2=0.999 6）。

2.2 磺胺二甲嘧啶及其代謝物在黃河鯉血液中的質(zhì)量濃度變化

如表1所示，靜脈注射磺胺二甲嘧啶后，黃河鯉血液中磺胺二甲嘧啶質(zhì)量濃度在0.25 h 達(dá)到峰值20.69 mg/L，之后逐漸降低，血液中N4-乙酰化磺胺二甲嘧啶質(zhì)量濃度在24 h 達(dá)到峰值2.22 mg/L；對(duì)黃河鯉口灌磺胺二甲嘧啶后，血液中磺胺二甲嘧啶質(zhì)量濃度在1 h 達(dá)到最大值17.90 mg/L，N4-乙酰化磺胺二甲嘧啶質(zhì)量濃度在12 h達(dá)到峰值2.22 mg/L。

表1 黃河鯉血液中磺胺二甲嘧啶及其代謝物N4-乙?；前范奏奏さ馁|(zhì)量濃度Tab.1 The concentration of sulfamethazine and N4-acetyl sulfamethazine in plasma of Cyprinus carpio mg/L

2.3 磺胺二甲嘧啶在黃河鯉體內(nèi)房室模型及藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)

采用DAS 2.0 藥物代謝動(dòng)力學(xué)軟件對(duì)黃河鯉血液中磺胺二甲嘧啶藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，靜脈注射磺胺二甲嘧啶后符合零級(jí)吸收二 室 模 型，表 達(dá) 方 程 式：C靜脈注射=14.48e-7.463t+0.318e-0.035t；口灌磺胺二甲嘧啶后符合一級(jí)吸收二室模型，表達(dá)方程式：C口灌=6.627e-0.242t+ 8.678e-0.041t-15.305e-34.885t?；前范奏奏ぴ邳S河鯉血液中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表2所示。由表2可知，靜脈注射磺胺二甲嘧啶后血藥峰質(zhì)量濃度為20.00 mg/L，消除半衰期為19.964 h，血藥濃度-時(shí)間曲線下面積為253.686 h·mg/L，表觀分布容積為0.911 L/kg；口灌磺胺二甲嘧啶后血藥峰質(zhì)量濃度為17.90 mg/L，達(dá)峰時(shí)間為1 h，吸收半衰期為0.02 h，消除半衰期為16.927 h，血藥濃度-時(shí)間曲線下面積為236.686 h·mg/L，表觀分布容積為1.406 L/kg，生物利用度為93.30%。

表2 黃河鯉體內(nèi)磺胺二甲嘧啶的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.2 Pharmacokinetic parameters of sulfamethazine in Cyprinus carpio

2.4 磺胺二甲嘧啶給藥劑量

陳超然等[21]報(bào)道，磺胺二甲嘧啶對(duì)鰻弧菌、嗜水氣單胞菌、遲緩愛(ài)德華氏菌的最小抑菌質(zhì)量濃度均為0.2 mg/L，李夢(mèng)夢(mèng)等[22]報(bào)道復(fù)方磺胺二甲嘧啶對(duì)維氏氣單胞菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為62.5 mg/L，為保證磺胺二甲嘧啶有良好的抑菌效果，計(jì)算時(shí)取其最大值62.5 mg/L，每日給藥劑量(X0)為137.88 mg/kg。

2.5 磺胺二甲嘧啶在黃河鯉各組織中分布特點(diǎn)

如圖1 所示，以20 mg/kg 劑量口灌黃河鯉磺胺二甲嘧啶后，磺胺二甲嘧啶在肝臟中分布速率最快，在0.25 h 即達(dá)到峰值44.09 mg/kg，之后逐漸降低，但在6 h 時(shí)出現(xiàn)第2 次峰值14.45 mg/kg；磺胺二甲嘧啶在腎臟中分布趨勢(shì)與肝臟相似，在0.25 h 即達(dá)到峰值13.39 mg/kg，之后逐漸降低，同樣也在6 h時(shí)出現(xiàn)第2次峰值，為8.13 mg/kg?；前范奏奏ぴ诩∪夂腿X中的分布特點(diǎn)均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，肌肉中峰值出現(xiàn)在4 h，為8.85 mg/kg，在全腦中峰值出現(xiàn)在1 h，為13.07 mg/kg。

2.6 N4-乙?；前范奏奏ぴ邳S河鯉體內(nèi)的分布特點(diǎn)

如圖2 所示，在肝臟、腎臟、肌肉中均檢出磺胺二甲嘧啶代謝產(chǎn)物N4-乙?；前范奏奏ぃ诟闻K中含量最高，其次為腎臟，在肌肉中含量較低。腦組織中未檢測(cè)出N4-乙?；前范奏奏?。

肝臟中N4-乙酰基磺胺二甲嘧啶含量在口灌后的12 h 達(dá)到峰值，為16.80 mg/kg，之后快速下降，72 h 時(shí)降至7.72 mg/kg。腎臟中N4-乙?；前范奏奏ぴ? h 時(shí)達(dá)到峰值10.80 mg/kg，之后呈現(xiàn)波浪式下降趨勢(shì)，72 h 時(shí)降至1.06 mg/kg。肌肉中N4-乙?；前范奏奏ぴ? h 時(shí)開(kāi)始檢出，在12 h達(dá)到峰值1.21 mg/kg，隨后逐漸降低，72 h 時(shí)降至最低0.30 mg/kg。

3 結(jié)論與討論

3.1 靜脈注射磺胺在二甲嘧啶黃河鯉體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征

黃河鯉以20 mg/kg 劑量靜脈注射磺胺二甲嘧啶后，表觀分布容積為0.911 L/kg。BARONI 等[11]報(bào)道磺胺二甲嘧啶在牛體內(nèi)的表觀分布容積為0.317 L/kg，在羚羊體內(nèi)為0.399 L/kg。BARONI 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，磺胺二甲嘧啶在1～15周齡小牛體內(nèi)的表觀分布容積為0.281～0.317 L/kg?；前范奏奏ぴ邳S河鯉體內(nèi)的消除半衰期為19.964 h，在牛體內(nèi)的消除半衰期為7.46 h，在羚羊體內(nèi)為6.17 h，在不同年齡小牛體內(nèi)為9.46～7.45 h。由此可見(jiàn)，靜脈注射磺胺二甲嘧啶在黃河鯉體內(nèi)分布較快，組織分布廣于畜禽類，消除速率慢于畜禽類。

3.2 口服磺胺二甲嘧啶在黃河鯉體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征

孫愛(ài)榮等[14]研究發(fā)現(xiàn)，大菱鲆口服磺胺二甲嘧啶后，吸收半衰期為3.647 h，達(dá)峰時(shí)間為8 h；艾曉輝等[15]報(bào)道，銀鯽口服磺胺二甲嘧啶后的吸收半衰期為0.655 h，達(dá)峰時(shí)間為24 h；范能全[16]研究發(fā)現(xiàn)，鯽魚(yú)口服磺胺二甲嘧啶后的吸收半衰期為0.782 h，達(dá)峰時(shí)間為8 h；孫玉增等[17]報(bào)道，黑鲪口服磺胺二甲嘧啶后的吸收半衰期為1.69 h，達(dá)峰時(shí)間為8 h。本研究結(jié)果顯示，黃河鯉口服磺胺二甲嘧啶后血液中的吸收半衰期為0.02 h，達(dá)峰時(shí)間為1 h。由此可見(jiàn)，口服磺胺二甲嘧啶在黃河鯉體內(nèi)的吸收速率快于大菱鲆、鯽、黑鲪等魚(yú)類。

血藥濃度-時(shí)間曲線下面積和生物利用度是評(píng)價(jià)藥物吸收程度的重要指標(biāo)之一[24]。大菱鲆口服20 mg/kg 磺胺二甲嘧啶后血藥濃度-時(shí)間曲線下面積和生物利用度分別為385.409 h·mg/L、47.13%[14]；銀鯽口服200 mg/kg 磺胺二甲嘧啶后血藥濃度-時(shí)間曲線下面積為175.2 h·mg/L[15]；鯽口服200 mg/kg磺胺二甲嘧啶后血藥濃度-時(shí)間曲線下面積為137.82 h·mg/L[16]；黑鲪口服100 mg/kg 磺胺二甲嘧啶后血藥濃度-時(shí)間曲線下面積為975.70 h·mg/L[17]。本研究結(jié)果顯示，黃河鯉口服20 mg/kg 磺胺二甲嘧啶后血藥濃度-時(shí)間曲線下面積為236.686 h·mg/L，生物利用度為93.30%；同時(shí)，磺胺二甲嘧啶在黃河鯉體內(nèi)的消除半衰期為16.927 h，而在大菱鲆體內(nèi)為8.8 h[13]，黑鲪體內(nèi)為4.78 h[17]。說(shuō)明磺胺二甲嘧啶在鯉體內(nèi)吸收較為充分，且消除較慢，有利于殺滅病原微生物。

3.3 口服磺胺二甲嘧啶在黃河鯉體內(nèi)組織分布與代謝

黃河鯉口服磺胺二甲嘧啶后，在肝臟分布最快，0.25 h 即達(dá)到峰值44.09 mg/kg，在腎臟中分布趨勢(shì)與肝臟相似，但低于肝臟；在肌肉和腦中分別在6 h 和1 h 達(dá)峰值，遠(yuǎn)低于肝臟。銀鯽口服磺胺二甲嘧啶后，在肌肉中的質(zhì)量濃度高于肝臟[15]；大菱鲆口服磺胺二甲嘧啶后，在腎臟中質(zhì)量濃度最高，肌肉中質(zhì)量濃度也高于肝臟中質(zhì)量濃度[14]。說(shuō)明磺胺二甲嘧啶在黃河鯉體內(nèi)經(jīng)肝臟首過(guò)效應(yīng)較強(qiáng)?；前范奏奏ごx產(chǎn)物N4-乙酰化磺胺二甲嘧啶在肝臟、腎臟、肌肉中均有檢出，在肝臟中含量最高，其次為腎臟。說(shuō)明肝臟和腎臟是磺胺二甲嘧啶的主要代謝器官。在血液中也檢測(cè)到少量N4-乙?；前?，但并未隨血液循環(huán)進(jìn)入腦組織。虹鱒(Oncorhynchus mykiss)口服磺胺間甲氧嘧啶和磺胺間二甲氧嘧啶后，在各組織中也檢測(cè)到了相應(yīng)的乙?；x產(chǎn)物[25]，并可以通過(guò)脫乙酰作用轉(zhuǎn)化為原藥而在動(dòng)物體內(nèi)造成殘留。SAMUELSEN 等[26]用3 種磺胺藥物藥浴大西洋庸鰈(Hippoglossus hippoglossus)72 h 后，大約90%的磺胺間二甲氧嘧啶和磺胺甲噁唑在組織中以N4-乙?；x物的形式存在。YUAN 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)白兔注射磺胺間二甲嘧啶后，62.1%的藥物通過(guò)乙?；M(jìn)行代謝。雖然魚(yú)類與哺乳動(dòng)物種類不同，但可通過(guò)乙酰化代謝磺胺類藥物。

對(duì)黃河鯉?kù)o脈注射磺胺二甲嘧啶后，組織分布速率快，消除速率慢；口灌磺胺二甲嘧啶后，組織分布速率慢，消除速率快，表觀分布容積大，生物利用度較高。磺胺二甲嘧啶在黃河鯉體內(nèi)通過(guò)乙?；纱x為N4-乙?；前范奏奏?。根據(jù)黃河鯉體內(nèi)血藥濃度及體外抑菌濃度，建議按照138 mg/kg劑量投喂磺胺二甲嘧啶。