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    原子力顯微鏡成像技巧的探討

    2021-10-23 12:44:26鄭美青
    分析儀器 2021年3期
    關(guān)鍵詞:原子力懸臂鍍層

    鄭美青 薛 冰

    (首都醫(yī)科大學(xué) 中心實(shí)驗(yàn)室,北京 100069)

    原子力顯微鏡(Atomic Force Microscopy, AFM)原理是在反饋控制系統(tǒng)的作用下,根據(jù)針尖曲率半徑在納米尺度的微小探針與樣品間的相互作用,去感觸樣品表面形貌的變化,就如同人在大腦地控制下,用手去感觸物體表面形貌。就原子力顯微鏡而言,其反饋到中央控制系統(tǒng)的參數(shù)是探針與樣品間的相互作用力,因此,可以更容易地獲得樣品的力學(xué)參數(shù)。

    原子力顯微鏡樣品制備相對簡單,對樣品損傷小,無需進(jìn)行染色、包埋等復(fù)雜處理過程,對測試環(huán)境要求不高,在空氣和液態(tài)環(huán)境下都可以進(jìn)行測試,可用于表征普通材料樣品和生物樣品[1,2],例如 DNA、蛋白質(zhì)和活性細(xì)胞[3-6]。相對于光學(xué)顯微鏡,原子力顯微鏡可以有更好的分辨率。

    實(shí)際掃描的過程中,原子力顯微鏡的成像圖是原子力探針和樣品共同卷積的結(jié)果,所以探針的選擇、樣品的制備直接決定成像質(zhì)量。

    1 探針對原子力顯微鏡的成像的影響

    在掃描樣品表面時(shí),探針的微小針尖與樣品表面相互作用,使探針的微懸臂發(fā)生形變。由激光二極管發(fā)出的激光束照射在探針的微懸臂末端,當(dāng)微懸臂發(fā)生形變時(shí),激光束的反射光束也發(fā)生相應(yīng)的變化,通過四象限光電探測器接收反射后的激光束,對所獲得的信息進(jìn)行轉(zhuǎn)換、放大,輸出電壓檢測信號。計(jì)算機(jī)通過比較檢測信號和預(yù)先設(shè)置的參考信號來實(shí)時(shí)調(diào)整壓電陶瓷掃描器在Z 軸方向上的伸縮量,實(shí)現(xiàn)反饋控制。計(jì)算機(jī)通過軟件編程對檢測信號進(jìn)行處理,獲取樣品表面形貌圖像以及相應(yīng)的物理量[7]。

    探針[8]分基底(Substrate)、懸臂(Cantilever)和針尖(Tip)三部分。懸臂相當(dāng)于力傳感器,根據(jù)懸臂形狀,探針可分為矩形懸臂和三角形懸臂。探針質(zhì)量好壞以及探針參數(shù)會直接影響最后的成像。選擇探針不是由哪種掃描模式?jīng)Q定,實(shí)驗(yàn)中要根據(jù)探針的參數(shù)去選擇。選擇探針的基本原則是:懸臂的軟硬度要適中,既保證樣品要產(chǎn)生足夠的形變量,又要保證有足夠的探測靈敏度。

    1.1 彈性系數(shù)(k)

    不同模式[9]下,應(yīng)選擇不同彈性系數(shù)的針。以布魯克原子力顯微鏡為例,智能成像模式基于peakforce tapping mode,探針以正弦驅(qū)動方式離開和接近表面。我們要確保探針敲到表面之后可以離開,因?yàn)闃悠繁砻嬗姓掣搅Φ挠绊懀绻结樚?,樣品粘附力比較大,探針形變比較大,樣品會拽著探針不讓離開,可能掃描器把探針拉到最高點(diǎn)的時(shí)候還沒分開,一般選擇彈性系數(shù)小于1N/m的探針就可以。

    Tapping mode振幅比較小,一般在幾個(gè)nm到幾十個(gè)nm,克服粘附力是完全要依靠蘊(yùn)藏在探針里的能量來離開樣品表面。彈性系數(shù)k越小,懸臂里的能量越小,越不容易離開樣品表面。Tapping振幅又小,所以要求探針的k要大,一般要選擇k大于2N/m的針。

    接觸模式是探針直接壓到樣品表面來回劃,力越大越容易破壞樣品,所以盡量選擇k小的探針來做成像,太硬的針會劃傷樣品表面。同時(shí)我們應(yīng)參考樣品的彈性模量大小來選擇探針。

    1.2 曲率半徑(tip radius)

    AFM有橫向分辨率和縱向分辨率,決定它們的因素不一樣。曲率半徑主要影響AFM的橫向分辨率,一般情況下,曲率半徑越小,針尖越尖,橫向分辨率越高。探針尖端尖不尖,用鈍針和尖針得到的效果是完全不一樣的,如圖1,同一個(gè)樣品,如果選擇曲率半徑小的尖針成像(圖1 b),針尖可以更好地插入樣品,得到更高分辨率的成像。

    圖1 鈍針(a)和尖針(b)的成像

    1.3 懸臂鍍層

    懸臂是AFM力的傳感器,所以它非常重要,控制力其實(shí)就是控制懸臂的彎曲量。探針背面的鍍層會增加懸臂反射率,提高信噪比。鍍層一般會選擇金、鋁等材質(zhì),帶鍍層的針sum值位于4.0~7.5V,不帶鍍層的針sum值位于1.5~2.5V。鍍層的質(zhì)量也會影響到成像質(zhì)量,成像有干涉條紋出現(xiàn),一般情況是由于光調(diào)偏了,會有光漏出,也有可能是鍍層質(zhì)量有問題。實(shí)驗(yàn)中激光位置應(yīng)該在懸臂前半部分,找sum值最大的位置。

    大部分情況下,應(yīng)該選背面有鍍層的針來做成像,特別是做peakforce tapping時(shí)。變溫實(shí)驗(yàn)時(shí)要選擇不帶鍍層的懸臂,因?yàn)閼冶酆湾儗硬牧喜灰粯?,溫度變化時(shí)熱膨脹系數(shù)不一樣,懸臂會變彎,vertical一直在飄,所以變溫實(shí)驗(yàn)時(shí)要避免選擇帶鍍層的針。

    1.4 Deflection sensitivity

    Deflection sensitivity代表垂直形變量的靈敏度,這個(gè)值很重要,在做力學(xué)實(shí)驗(yàn)中首先要校準(zhǔn)Deflection sensitivity。數(shù)越小,探測小的形變量的sensitivity越高,因此如果要測量特別小的形變量時(shí),我們應(yīng)該選擇Deflection sensitivity數(shù)比較小的探針。因?yàn)镈eflection sensitivity跟懸臂的長度成正比,跟光路的長度成反比,因此要選懸臂短一些的針。

    1.5 假象的問題

    針尖形狀會影響到橫向分辨率,掃描的過程中會經(jīng)常遇到兩種情況,一是探針被污染了,粘上東西了,相當(dāng)于探針的形狀有變化,還有一種情況是,在做成像的過程中,因?yàn)榱Φ脑蛑饾u把探針磨鈍了,相當(dāng)于探針的形狀有了變化,所以分辨率會有變化。這兩種情況下,所測得結(jié)果卷積了探針形狀的改變,成像不真實(shí),因此實(shí)驗(yàn)中需要排除可能存在的這些假象,如圖2。

    圖2 探針被污染或者變鈍的成像

    2 樣品對原子力顯微鏡的成像的影響

    2.1 樣品制樣

    AFM樣品制樣原則,一要求基底干凈,二樣品要固定在基底上,如果樣品固定不好,或者樣品表面起伏太大,會導(dǎo)致力曲線很不穩(wěn)定。常用的固定方法有四種:一是范德華力,可以用膠將樣品粘在基底上,大多數(shù)情況下可以選雙面膠,導(dǎo)電實(shí)驗(yàn)時(shí)用銀膠;二是用化學(xué)鍵固定,比如表面修飾,經(jīng)常用到的化學(xué)鍵是金硫鍵,硫醇的巰基在外面,固定到金的表面;三是酰胺鍵,在羥基或者氨基表面,樣品用氨基或者羥基結(jié)尾,形成酰胺鍵;還有一種是用靜電力,利用樣品和基底表面的電荷,比如很多DNA是帶負(fù)電荷[10]的,要把基底表面修飾成帶正電荷的,通過靜電作用固定樣品如圖3,基底修飾后的成像分辨率明顯提高很多。

    圖3 云母基底修飾前后的成像圖a.修飾前;b.修飾后

    最常用的基底是云母片,云母基底非常好用,每一層都是原子級平整的,不需要額外清理、清洗,前提是要選用高質(zhì)量的云母。第二種基底是石墨,也是原子級平整,這兩種基底一個(gè)是親水,一個(gè)是疏水,在原子力的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用比較多,處理比較簡單。

    2.2 樣品的安裝

    安裝樣品時(shí)不要引入太多噪聲,如果樣品大于樣品臺,安裝樣品時(shí)會引起樣品臺邊緣震動,噪聲會比較高,甚至?xí)采w樣品本身的信號。

    2.3 樣品帶電問題

    同樣的樣品在不同的帶電條件下,測出來的結(jié)果不同。如果用tapping mode來做成像,一定要排除靜電影響。原因是tapping mode是通過振幅來成像,但如果樣品和探針之間有額外的靜電作用力的話,會引起探針共振峰的移動,即使高度沒有變化,引入額外的靜電力也會導(dǎo)致振幅變化,tapping將所有的振幅變化都反映在高度里邊,所以額外的靜電力會對高度有貢獻(xiàn)。這時(shí)雖然看到的圖很漂亮,但結(jié)果是錯誤的。

    2.4 樣品污染的問題。

    實(shí)驗(yàn)中可能會遇到這種情況,本來很細(xì)膩的顆粒,成像突然變得很大,很顯然是探針被污染了,污染的東西掉下來之后又可以繼續(xù)掃,如果是peakforce QNM,可以根據(jù)粘附力變化來判斷樣品是否被污染。

    2.5 樣品老化的問題。

    有些樣品容易老化,不能放置時(shí)間太久,一定要新制的樣品才可以檢測,空氣中放置后就會無法檢測。

    3 總結(jié)

    原子力顯微鏡是一種納米級測量分析儀器,儀器非常靈敏,影響因素較多,大致包括探針、樣品、AFM成像系統(tǒng)、軟件設(shè)置以及人為的參數(shù)調(diào)節(jié)等幾大類。本文總結(jié)了探針的彈性系數(shù)、曲率半徑、懸臂鍍層對成像的影響,以及制樣、裝樣時(shí)可能存在的問題,實(shí)驗(yàn)中為獲得更準(zhǔn)確的成像,我們需要盡量克服樣品可能存在的這些問題,并選擇最優(yōu)的探針來對其成像。

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