miR-182-5p和自噬在外周血單個核細胞和THP-1細胞痛風性關節(jié)炎模型炎癥反應中的研究

黃玉琴，謝艷，李濤，黃倩，青玉鳳，鄭建雄，4，張全波

(川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院，1.高尿酸血癥與痛風研究所；2.老年科；3.風濕免疫科；4.川北醫(yī)學院臨床醫(yī)學系；5.儀隴縣人民醫(yī)院，四川 南充 637000)

痛風是機體持續(xù)高尿酸水平和尿酸鹽(monosodium urate,MSU)晶體析出并沉積于關節(jié)、肌腱和/或其他組織器官中而引起組織損傷的一組臨床綜合征。急性痛風性關節(jié)炎(acute gout，AG)是MSU晶體沉積在骨關節(jié)、皮下及軟組織中引起的急性和極度疼痛的一種嚴重表型炎癥反應。研究證實，痛風的急性炎癥反應與Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)4-核因子(nuclear fator，NF)-κB信號通路被激活，促進白細胞介素(IL)-1β等炎癥因子釋放密切相關[1]。自噬是一個進化保守的，通過包繞隔離細胞質成分，包括受損的或功能減退的細胞器及錯誤折疊的蛋白質及大分子物質，并與溶酶體融合水解膜內成分的現(xiàn)象[2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)原發(fā)性急性痛風性關節(jié)炎患者自噬通量增加、自噬被激活，提示自噬在調控痛風患者炎癥反應過程中具有重要意義。

MiRNAs是一個短的、小的、非編碼RNAs家族。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可作為一種競爭性內源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)與LncRNA相互作用，參與靶基因的表達調控，并在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[4]。最近，miR-182在各種炎癥性疾病中被發(fā)現(xiàn)。如miR-182-5p通過調節(jié)TLR4/NF-κB信號通路來抑制脂多糖誘導的RAW264.7細胞的炎癥反應[5]，通過靶向TLR4抑制氧化低密度脂蛋白誘導的氧化應激[6]。在小鼠關節(jié)炎模型中，使用miR-182拮抗劑可顯著降低炎癥和組織破壞的組織學評分[7]。然而，miR-182-5p在痛風中的作用仍然鮮為人知。綜合數(shù)據(jù)庫和芯片分析的結果，本研究通過對急性期痛風患者、間歇期痛風患者及健康對照者(各5例)的PBMCs全基因組表達芯片分析挑選出差異最顯著的miR-182-5p，再挑選出具有miR-182-5p識別序列的linc00173和linc00963，擬通過模擬體內痛風發(fā)作過程，探討miR-182-5p與自噬及痛風關節(jié)炎可能存在的關聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器及試劑 LightCycler?96 PCR儀(Roche公司，瑞士)，人淋巴細胞分離液(天津灝洋生物公司)，反轉錄試劑盒(Takara公司，日本)，實時熒光定量PCR試劑盒(Takara公司，日本)，Trizol提取總RNA試劑盒(Invitrogen公司，美國)，低溫高速離心機5417R(Eppendrof公司，美國)，紫外分光光度儀(Thermo fisher公司，美國)，RPMI培養(yǎng)基(Thermo公司，美國)，胎牛血清(浙江天杭生物，中國)，人白介素1β檢測試劑盒(USCN公司,中國)，GAPDH rabbit mAb(美國Cell Signaling公司)，LC3-2 rabbit mAb(美國Cell Signaling公司)，IL-1β rabbit mAb(美國Cell Signaling公司)，miR-182-5p primer(美國GeneCopoeia公司)，U6內參(美國GeneCopoeia公司)，All-in-one TM miRNA qRT-PCR Detection Kit(美國GeneCopoeia公司)，GAPDH內參及自噬相關基因引物(上海生工生物工程有限公司，中國)。

1.1.2 引物設計及合成 根據(jù)相關基因的CDS序列，基因引物由上海生工生物工程公司設計及合成，基因序列。見表1。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 MSU刺激健康男性外周靜脈血 抽取5例健康男性外周靜脈血24 mL(4 mL/管)，肝素鈉抗凝，使用濃度為100 μg/mL MSU刺激后置于含5 % CO2的37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育，按照0、1、2、4、6、8 h不同時間點分離血漿及提取外周血單個核細胞(peripheral lood mononuclear cells，PBMCs)進行下一步實驗。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 人髓系白血病單核細胞(THP-1)購自于American Type Culture Collection，用含10 %胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃ 5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，視細胞生長情況24～48 h更換培養(yǎng)基，當細胞生長于培養(yǎng)皿中密度達到70～80 %時，1 200 rpm離心5 min后棄去上清液，將重懸細胞按1∶3的體積比傳代。

1.2.3 THP-1細胞痛風炎癥造模 將THP-1細胞接種于6 cm培養(yǎng)皿內(細胞約3.6×106個/皿)，待細胞融合至70～80 %時，用100 ng/mL佛波脂(37℃、5 % CO2培養(yǎng)48 h)誘導THP-1細胞成為貼壁的巨噬細胞。待細胞貼壁后棄培養(yǎng)基，加入新的含有100 μg/mL MSU的培養(yǎng)基并置于含5 % CO2的37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育0、3、6、9、12 h后，收集細胞培養(yǎng)上清液500 μL，3 000 rpm離心10 min，留上清，棄沉淀。培養(yǎng)皿細胞用PBS液清洗3次，3 min/次，清除MSU后得巨噬細胞進行下一步實驗。

1.2.4 RNA的提取及檢測 采用Trizol法提取PBMC/THP-1細胞中總RNA，紫外分光光度儀測定RNA濃度，選取吸光度為1.8～2.0用于反轉錄合成cDNA。RT-qPCR總體積為20 μL。反應體系：10 μL Power SYBR Green PCR Master Mix，7.4 μL去離子水，正向及反向引物各0.3 μL，2 μL cDNA。反應條件為：第一步：95℃ 30 s 1個循環(huán)→95℃ 5 s→60℃ 34 s 40個循環(huán)。第二步：95℃ 5 s→60℃ 60 s→95℃ 15 s 1個循環(huán)。每份標本均設2個復孔，反應結束后作溶解曲線。以目的基因的Ct值減去內參的Ct值為△Ct，2-△△Ct值表示目的基因mRNA表達的高低。采用All-in-one試劑盒進行反轉錄miR-182-5p為cDNA，以U6為內參。PCR反應體系：2×All-in-one qPCR Mix 10 μL，All-in-one TM qPCR Primer(2 μM)2 μL，Universal Adaptor PCR Primer 2 μL，RNase free water 4.0 μL，F(xiàn)irst-stand cDNA 2.0 μL，將上述20 μL反應體系加入96孔PCR板中。在LightCycler?96 PCR儀上按照95℃預變性10 min 1個循環(huán)；變性95℃10 min，退火60℃ 20 min，延伸72℃ 1 min，共45個循環(huán)。U6作為內參照，△Ct=(目的基因-內參對照U6)的Ct值。目的基因序列相對表達量用2-△△Ct表示。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測THP-1培養(yǎng)基中及人上清液IL-1β蛋白濃度 按照USCN公司生產的人IL-1β酶ELISA試劑盒說明書使用，A值用SPSS軟件繪出標準曲線，計算各樣本的值。

1.2.6 蛋白免疫印記法(Western Blot)MSU刺激THP-1和PBMC細胞后的LC3、IL-1β蛋白水平的表達 向THP-1和PBMC細胞中加入含有1 % PMSF的RIPA(強效)裂解液，取上清液，用BCA法進行蛋白定量。嚴格按照Western Blot方法操作，ELC顯色。用Image J軟件對圖片中條帶的灰度值進行分化計算目的基因蛋白條帶與GAPDH蛋白條帶灰度值的相對比值，各組實驗重復5次。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 MSU刺激健康男性外周血PBMCs

2.1.1 MSU刺激后不同時間點IL-1β表達水平比較 經(jīng)MSU刺激0、1、2、4、6、8 h后，6組IL-1β mRNA表達水平、IL-1β蛋白濃度及IL-1β蛋白表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(F=88.559、351.325、51.086，P<0.001)，且1、2、4、6、8 h IL-1β mRNA水平均高于0 h(P<0.05)，1、2、4、6 h IL-1Β蛋白濃度均高于0 h(P<0.01)，2、4、6、8 h IL-1β蛋白表達水平均高于0 h(P<0.05)。見表2。

表2 MSU刺激后不同時間點IL-1β表達水平比較

2.1.2 MSU刺激后不同時間點linc00173、linc00963、miR-182-5p及LC3-2 mRNA表達水平比較 經(jīng)MSU刺激0、1、2、4、6、8 h后，6組linc00173、linc00963、miR-182-5p及LC3-2 mRNA表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=16.985、40.858、3.676、12.547，P<0.05)，且1、2、4 h linc00173水平高于0 h(P<0.05)，1、2 h linc00963水平高于0 h(P<0.01)，8 h miR-182-5p水平高于0 h(P<0.05)，4、6、8 h LC3-2 mRNA表達水平高于0 h(P<0.05)。見表3。

表3 MSU刺激后不同時間點linc00173、linc00963、miR-182-5p及LC3-2表達水平比較

2.1.3 MSU刺激后不同時間LC3-2蛋白表達水平比較 經(jīng)MSU刺激0、1、2、4、6、8 h后，6組LC3-2蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=6.643，P<0.05)，且6、8 h表達水平高于0 h(P<0.01)。見表4及圖1。

表4 MSU刺激后不同時間點LC3-2蛋白表達水平比較

2.2 MSU刺激THP-1細胞

2.2.1 MSU刺激后不同時間IL-1β表達水平比較 經(jīng)MSU刺激0、3、6、9、12 h后，5組IL-1β mRNA表達水平、IL-1β蛋白濃度及IL-1β蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=14.792、54.072、7.806，P<0.01)，且3、6、9、12 h IL-1β mRNA水平及IL-1β蛋白濃度高于0 h(P<0.05)，9、12 h IL-1β蛋白水平高于0 h(P<0.01)。見表5。

表5 MSU刺激后不同時間點IL-1β表達水平的比較

2.2.2 MSU刺激后不同時間linc00173、linc00963、miR-182-5p及LC3-2 mRNA表達水平比較 經(jīng)MSU刺激0、3、6、9、12 h后，5組linc00173、miR-182-5p及LC3-2表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=4.084、2.885、21.173，P<0.05，)，且9、12 h linc00173水平高于0 h(P<0.05)，6 h miR-182-5p低于0 h(P<0.05)，6、9、12 h LC3-2 mRNA水平高于0 h(P<0.01)；5組linc00963表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(F=0.904，P=0.477)。見表6。

表6 MSU刺激后不同時間點linc00173、linc00963、miR-182-5p及LC3-2表達水平比較

2.2.3 MSU刺激后不同時間LC3-2蛋白表達水平 經(jīng)MSU刺激0、3、6、9、12 h后，5組LC3-2蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=4.157，P<0.05)。見表7及圖2。

表7 MSU刺激后不同時間點LC3-2蛋白表達水平比較

3 討論

痛風是由于體內嘌呤代謝異常和/或尿酸排泄異常導致的，當尿酸超過血液飽和濃度并沉積在關節(jié)滑液中形成MSU時，會誘發(fā)急性關節(jié)炎發(fā)作。急性痛風性關節(jié)炎是由免疫細胞和MSU之間的相互作用引起的炎性反應[8]。痛風發(fā)作的機制尚未完全了解，但普遍認為中性粒細胞和巨噬細胞在其中起著至關重要的作用。MSU刺激巨噬細胞表面的TLR激活NF-κB信號通路產生炎癥小體，然后，MSU通過促進細胞內K+外排激活NLRP3炎性體從而誘導IL-1β的產生[9]。然而，自噬可降低NLRP3的蛋白表達減慢炎癥反應[10]，自噬的喪失激活炎癥小體介導的IL-1β分泌[11]，表明自噬具有抑制炎癥的能力。近年來，隨著對非編碼RNA的深入研究發(fā)現(xiàn)占轉錄組98%的非編碼RNA的突變可能是導致疾病發(fā)生的“罪魁禍首”，甚至可能是某些疾病臨床預后的標記分子。研究[12]表明，miR-182-5p與自噬相關基因相互作用參與疾病發(fā)展。中性粒細胞和巨噬細胞在痛風的發(fā)生中起重要作用，可能通過miR-182-5p介導痛風的炎癥過程。

本研究發(fā)現(xiàn)，MSU刺激健康男性PBMCs后，經(jīng)RT-qRCR、Elisa、Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，IL-1β在不同時間點都有所升高，且隨著刺激時間的延長有下降趨勢，提示MSU已經(jīng)誘導出炎癥，且可能存在負反饋調節(jié)。miR-182-5p在8 h明顯升高，linc00173和linc00963均在2 h達到最大值，隨后下降，表明miR-182-5p可能參與了痛風炎癥的調節(jié)，在痛風模型中下調IL-1β mRNA水平的同時還下調了linc00173和linc00963的表達，但具體調控機制不詳。miR-182是miR-183簇的一員，在多種疾病中發(fā)揮重要作用和影響，如miR-182間皮瘤通過靶向叉頭盒O1(Forkhead box O1,FOXO1)增殖和侵襲[13]。miR-182通過調節(jié)FOXO3增加非小細胞肺癌細胞的抗輻射性[14]。miR-182-5p是酒精性肝炎中表達最高的miRNA，miR-182-5p的過度表達導致膽汁細胞中炎癥介質的上調[15]。

先天免疫途徑在痛風的發(fā)病機制中起著關鍵作用，尤其是NLRP3型炎癥小體的激活，導致IL-1β和其他促炎細胞因子的釋放。然而，自噬參與了NLRP3的降解。自噬通過抑制NLRP3炎癥小體減輕線粒體潮濕所致的急性肺損傷[16]。紫甘薯色素通過增強細胞自噬減弱了NLRP3炎癥小體的活性，最終延緩了內皮細胞的衰老，從而改善了心血管并發(fā)癥[17]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-182-5p過表達增加了促炎基因誘導，啟動了巨噬細胞增加自噬[18]。本研究觀察到，LC3-2 mRNA和蛋白隨著刺激時間的延長有所增加，提示自噬可能參與抑制MSU誘導的致炎因子的釋放，并可能受miR-182-5p的調節(jié)，可能是痛風患者自發(fā)緩解的機制。

Hu等[19]發(fā)現(xiàn)，lncRNA ANRIL通過ceRNA機制與miRNA-122-5p結合從而激活NLRP3炎性體并加速尿酸誘導的炎癥的發(fā)展。本研究首先確定了linc00173、linc00963、miR-122-5p和自噬與痛風相關。盡管沒有清楚地證明它們在痛風中存在ceRNA機制，但大量研究表明miRNA可以與lnRNA或mRNA相互作用。因此，可以合理假設ceRNA的機制可能在痛風中發(fā)生。首先，綜合數(shù)據(jù)庫和芯片分析的結果，挑選出了痛風患者中差異最顯著的miR-182-5p，在挑選出具有miR-182-5p識別序列的linc00173和linc00963。其次，通過功能學細胞實驗進一步證實了它們在痛風中確實存在差異表達。這也是本小組未來要重點研究的內容。

此外，通過比較THP-1細胞經(jīng)MSU刺激后上述指標的變化，結果發(fā)現(xiàn)，miR-182-5p、linc00173、linc00963和LC3-2 mRNA都出現(xiàn)了不同的改變。雖然和健康男性MSU刺激結果變化趨勢不完全一致，但更進一步說明痛風患者ncRNA和自噬存在異常，其在痛風炎癥反應過程中發(fā)揮了重要的作用。而變化趨勢不一致可能為THP-1為懸浮單核細胞，誘導為巨噬細胞需要佛波酯的干預，佛波酯對細胞存在一定毒性作用；THP-1長期體外培養(yǎng)可能改變細胞活力。

綜上，miR-182-5p及自噬在痛風中起著重要作用，可能作為痛風關鍵病理過程的中央調節(jié)劑，用于痛風的診斷、治療及預測臨床結局，但目前尚不清楚其在痛風的發(fā)生及自發(fā)緩解中的具體機制，miR-182-5p和自噬的特定作用仍然需要大量挖掘。