HMOX1在晶狀體上皮細(xì)胞中的抗氧化功能

廖生潔,陳江龍,張靖淇,王夢(mèng)蝶,黃炳輝,汪凌云

(湖北理工學(xué)院 腎臟疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃石 435003)

0 引言

氧化壓力一直被認(rèn)為是年齡相關(guān)性白內(nèi)障的重要誘因。光誘導(dǎo)、氧氣和輻射等均能引起氧化壓力的升高，導(dǎo)致晶狀體中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的過度氧化，最終使晶狀體變得渾濁。這一結(jié)論已在動(dòng)物模型以及體外培養(yǎng)的晶狀體體系中得到驗(yàn)證[1-2]。臨床病例研究結(jié)果顯示，老年人晶狀體中的晶狀體蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的過度氧化十分明顯，提示年齡相關(guān)性白內(nèi)障與活性氧(ROS)的形成緊密關(guān)聯(lián)[2-4]。尋找晶狀體中ROS調(diào)控因子，不僅能拓展白內(nèi)障發(fā)生的病理機(jī)制，同時(shí)還可為年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者的預(yù)防工作提供指導(dǎo)。

血紅素加氧酶(HMOX)可以將血紅素降解為膽綠素、一氧化碳和鐵，是血紅素降解的限速酶，在各組織中泛表達(dá)，特別是高活性組織，如脾臟、大腦和睪丸等。Benari等[5-6]在眼組織角膜上皮、視網(wǎng)膜、視網(wǎng)膜色素上皮和睫狀體中檢測(cè)到明顯的血紅素加氧酶活性。作者的前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在晶狀體上皮細(xì)胞中，HMOX1表達(dá)水平隨氧化應(yīng)激強(qiáng)度逐漸升高，提示其可能在晶狀體細(xì)胞中發(fā)揮抗氧化重要作用，本研究將進(jìn)一步確定HOMX1在晶狀體上皮細(xì)胞中的抗氧化功能。

1 試劑與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HLECs和p293T細(xì)胞均使用DMEM(Gibco)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并加入10 %胎牛血清(四季青)。培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為37 ℃，二氧化碳濃度設(shè)置為5 %。

1.2 HMOX1過表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建

將構(gòu)建好的HMOX1-pBABE質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒VSVG和GAGPOL轉(zhuǎn)染p293T細(xì)胞，包裝慢病毒載體，收取48 h的細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，將上清液與加入胎牛血清的高糖培養(yǎng)基1∶1混合，加入1 μg/mL的polybrane侵染HLECs細(xì)胞，24 h后，更換加入胎牛血清的高糖培養(yǎng)基2 mL，同時(shí)加入1 μg/mL嘌呤霉素篩選，收取細(xì)胞樣品進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

1.3 CRISPR-CAS法構(gòu)建HMOX1敲除細(xì)胞系

使用CCTop - CRISPR/Cas9 target online predictor對(duì)HMOX1基因進(jìn)行g(shù)RNA設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)4對(duì)不同靶點(diǎn)的引物，將正反向引物退火后，插入使用BBS1酶切成功的PX459質(zhì)粒。

將構(gòu)建成功的CRISPR-CAS9質(zhì)粒使用lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HLECs細(xì)胞，1 μg/mL嘌呤霉素篩選2 d后，胰酶消化細(xì)胞，96孔板分選單克隆。待細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取細(xì)胞基因組，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的片段。將成功擴(kuò)增的片段于凝膠電泳檢測(cè)后送公司進(jìn)行一代測(cè)序。

1.4 Western blot檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)

收取細(xì)胞，PBS清洗2次后使用細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，將裂解液置于沸水浴中煮樣10 min， SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品。將蛋白樣品轉(zhuǎn)膜至NC膜，5 %脫脂奶粉進(jìn)行封閉1 h，加入一抗。使用PBST洗滌3次，每次5 min，常溫孵育二抗1 h，清洗殘余二抗后低價(jià)HRP標(biāo)記的底物，于化學(xué)發(fā)光儀上檢測(cè)目的蛋白灰度值。

1.5 胞內(nèi)ROS檢測(cè)

選用碧云天活性氧檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)S0033)，按照說明書進(jìn)行操作，1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/mL。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積DCFH-DA，裝載探針進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 氧化還原環(huán)境對(duì)HLECs的細(xì)胞活性影響

為了研究氧化壓力是否影響晶狀體上皮細(xì)胞生長(zhǎng)活性，使用CCK8試劑盒檢測(cè)不同濃度雙氧水(H2O2)處理后的HLECs細(xì)胞活性(如圖1所示)。

圖1 不同條件處理下的HLECs細(xì)胞活性

從圖1可以看出，隨著H2O2濃度升高，晶狀體上皮細(xì)胞生長(zhǎng)活性顯著下調(diào)。500 μmol/L的H2O2濃度下，其活性已低于50 %。700 μmol/L濃度下，光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變圓，并出現(xiàn)凋亡樣小體，細(xì)胞活性低于20 %。NAC是常用的還原試劑，能夠維持環(huán)境的氧化還原穩(wěn)態(tài)。使用NAC和不同濃度H2O2處理HLECs，發(fā)現(xiàn)NAC能夠顯著提高細(xì)胞的生長(zhǎng)活性。這說明，氧化還原環(huán)境能顯著調(diào)控HLECs的細(xì)胞生長(zhǎng)活性。

2.2 使用慢病毒載體構(gòu)建HMOX1過表達(dá)細(xì)胞系

HMOX1是胞內(nèi)重要的抗氧化基因。前期研究結(jié)果表明，雙氧水刺激條件下，HMOX1表達(dá)水平顯著上調(diào)。為了研究HMOX1在晶狀體上皮細(xì)胞中的生物學(xué)功能，將HMOX1構(gòu)建至pBABE載體，并使用慢病毒包裝的方法，將該載體轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，收集上清培養(yǎng)基后加入polybrane輔助病毒侵染HLECs細(xì)胞，并加入嘌呤霉素進(jìn)行細(xì)胞抗性篩選，成功獲得HMOX1過表達(dá)HLECs細(xì)胞系。

使用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞中的Flag-HMOX1進(jìn)行表達(dá)鑒定，其中，使用Flag抗體檢測(cè)Flag-HMOX1融合蛋白，使用Actb抗體檢測(cè)內(nèi)參表達(dá)。Flag-HMOX1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的鑒定如圖2所示。

圖2 Flag-HMOX1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的鑒定

2.3 使用CRISPR-CAS9構(gòu)建HMOX1敲除細(xì)胞系

為了觀察HLECs缺失HMOX1表達(dá)后的生物學(xué)效應(yīng)，擬通過CRISPR-CAS9方法在HLECs中構(gòu)建HMOX1敲除細(xì)胞系。針對(duì)HMOX1基因的CDS設(shè)計(jì)4對(duì)sgRNA序列，并成功將該gRNA的雙鏈產(chǎn)物插入PX459質(zhì)粒中，使用BBS1酶切進(jìn)行驗(yàn)證。BBS1酶切不開質(zhì)粒，即代表原有酶切位點(diǎn)被設(shè)計(jì)的堿基插入成功(如圖3(a)所示)。其中,奇數(shù)泳道為對(duì)照組，未加入BBS1內(nèi)切酶，偶數(shù)泳道為實(shí)驗(yàn)組。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HLECs后，抽提細(xì)胞基因組，并對(duì)設(shè)計(jì)的片段設(shè)計(jì)引物利用PCR方法進(jìn)行堿基擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物送至公司進(jìn)行一代測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，3號(hào)gRNA對(duì)基因組的切割效率最高，其編輯基因組的能力接近50%。單獨(dú)將3號(hào)gRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HLECs，并篩選單克隆后，使用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)HMOX1在敲除細(xì)胞中的表達(dá)情況，成功鑒定到HMOX1敲除的細(xì)胞系(如圖3(b)所示)。HMOX1的sgRNA引物序列見表1。

(a) HMOX1的CDS序列設(shè)計(jì)并構(gòu)建至PX459質(zhì)粒

表1 HMOX1的sgRNA引物序列

2.4 HMOX1過表達(dá)或敲除對(duì)細(xì)胞活性影響

為了觀察HMOX1缺失或過表達(dá)后對(duì)HLECs抵抗氧化壓力能力的影響，使用CCK8對(duì)不同細(xì)胞系細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)。CCK8檢測(cè)不同細(xì)胞系的細(xì)胞活性結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，HMOX1過表達(dá)細(xì)胞系的抗氧化能力顯著提升，在敲除細(xì)胞系中，HLECs的抵抗氧化壓力的能力則明顯削弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，HMOX1確實(shí)在HLECs中發(fā)揮著重要的抗氧化功能。

(a) HMOX1過表達(dá)及其對(duì)照細(xì)胞系的細(xì)胞活性結(jié)果

2.5 HMOX1對(duì)HLECs的ROS調(diào)控作用

HMOX1作為經(jīng)典的抗氧化因子，ROS的生成是判斷其抗氧化能力的常用指標(biāo)。使用活性氧檢測(cè)試劑盒中的熒光探針DCFH-DA對(duì)ROS進(jìn)行檢測(cè)，比較不同細(xì)胞系在H2O2處理后的胞內(nèi)活性氧的水平，從而給出HMOX1在HLECs中抗氧化的直接證據(jù)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同細(xì)胞系的ROS水平結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，HMOX1過表達(dá)細(xì)胞系胞內(nèi)ROS水平顯著低于對(duì)照細(xì)胞系，而敲除HMOX1細(xì)胞組的ROS水平則明顯升高。這一結(jié)果直接證明HMOX1在HLECs中具備抗氧化功能。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同細(xì)胞系的ROS水平結(jié)果

3 討論

抗氧化功能對(duì)于晶狀體維持透明的意義重大，HMOX1被報(bào)道能夠在多種細(xì)胞中保護(hù)細(xì)胞免受氧化壓力的侵襲。確定HMOX1在晶狀體上皮細(xì)胞中的抗氧化功能，對(duì)于開發(fā)白內(nèi)障預(yù)防藥物，特別是年齡相關(guān)性白內(nèi)障的預(yù)防工作有著較高的臨床意義。Tian等[7]研究表明，在HLECs中干擾HMOX1的表達(dá)能夠提高HLECs對(duì)氧化壓力的敏感性。經(jīng)典的分子生物學(xué)研究基因功能不僅包括敲低基因表達(dá)，還包含基因的過表達(dá)功能研究。siRNA方法敲低基因表達(dá)，可能面臨剩余基因表達(dá)產(chǎn)物仍發(fā)揮生物學(xué)功能。研究通過CRISPR-CAS9方法獲得了HMOX1敲除細(xì)胞系，保證了HLECs細(xì)胞中HMOX1表達(dá)完全敲除，準(zhǔn)確地觀察了HMOX1缺失后的生物學(xué)功能變化，證實(shí)了HMOX1為HLECs中的重要抗氧化因子。本文從多角度明確了HMOX1在HLECs中的抗氧化功效，為理解白內(nèi)障的發(fā)生擴(kuò)寬了思路，同時(shí)，也將為臨床醫(yī)生針對(duì)白內(nèi)障的預(yù)防工作提供了一個(gè)新的藥物靶點(diǎn)[8-9]。