SMURF2在前列腺癌細(xì)胞中調(diào)節(jié)STAT1的泛素化并促進(jìn)EMT

董佳杰,黨燕梅,張 馳,蔣 順,劉 平,盧 山

(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,生物化學(xué)與生物制品研究所,江蘇 南京 210023)

前列腺癌(prostate cancer,PCa)是老年男性的高危疾病,在世界范圍內(nèi),前列腺癌發(fā)病率在男性惡性腫瘤中位居第2位[1]. 隨著疾病的發(fā)展,多數(shù)前列腺癌將轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌,這是前列腺癌致死的重要原因,目前沒有治愈的方法[2]. 因此針對(duì)前列腺癌相關(guān)分子機(jī)制的研究具有重要意義.

SMURF1(smad ubiquitination regulatory factor 1)和SMURF2是兩個(gè)緊密相關(guān)的C2-WW-HECT結(jié)構(gòu)域E3泛素連接酶,屬于NEDD4(neural precursor cell-expressed developmentally downregulated gene 4)亞家族. 與其他NEDD4家族成員(共9個(gè))相似,包含N端C2結(jié)構(gòu)域,介導(dǎo)這些E3s與細(xì)胞內(nèi)膜的結(jié)合;幾個(gè)含有色氨酸的WW結(jié)構(gòu)域,被認(rèn)為介導(dǎo)E3s與它們的相互作用元件和底物之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用;以及進(jìn)化保守的HECT結(jié)構(gòu)域,一些研究表明NEDD4家族的E3的HECT結(jié)構(gòu)域也參與底物識(shí)別[3-5]. 在哺乳動(dòng)物中,SMURF1和SMURF2分別由位于第7和17號(hào)染色體的兩個(gè)不同基因編碼. 人類SMURF1有3種異構(gòu)體,它們是由選擇性剪接產(chǎn)生的,而SMURF2只有單一蛋白產(chǎn)物. Smurfs有很高的序列同源性(>70%的氨基酸序列同源性),并具有相似的結(jié)構(gòu)特征. 盡管它們的底物庫有高度的相似性和一些冗余性,但這些蛋白質(zhì)在某些方面會(huì)表現(xiàn)出相反的生物學(xué)功能[6].

研究表明SMURF2在不同類型癌癥中發(fā)揮促癌或抑癌作用. 有研究報(bào)道SMURF2在幾種癌癥中顯著上調(diào),比如在結(jié)直腸癌中沉默SMURF2可減少結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲[7]. SMURF2還可以與EGFR(epidermal growth factor receptor)相互作用,使其以連接酶活性依賴的方式泛素化,這種相互作用會(huì)抵消RNF55(RING finger protein 55)對(duì)EGFR的泛素化降解從而增強(qiáng)EGFR信號(hào)通路[8]. SMURF2的敲低可顯著降低乳腺癌和口腔癌細(xì)胞系中CNKSR2(connector enhancer of kinase suppressor of ras2)的蛋白水平[9]. 但是野生型和無催化活性的SMURF2都能穩(wěn)定癌細(xì)胞中CNKSR2的水平[10]. 也有關(guān)于SMURF2抑制癌癥的報(bào)道,SMURF2-/-小鼠早期相對(duì)正常,但隨著年齡的增長,這些小鼠會(huì)在不同的組織和器官發(fā)展成各種腫瘤,包括肝、血、肺、垂體等[11],雜合子SMURF2小鼠也容易患自發(fā)性腫瘤[12].

有文獻(xiàn)報(bào)道SMURF2在正常細(xì)胞和組織中主要是核定位,但在前列腺癌中SMURF2顯示出明顯增加的胞質(zhì)螯合,與疾病進(jìn)展相關(guān)[13]. 還有文獻(xiàn)報(bào)道在前列腺癌細(xì)胞PC-3中,硼替佐米以劑量依賴的方式降低前列腺癌細(xì)胞系中SMURF2基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平,從而抑制了前列腺癌細(xì)胞的增殖[14]. 泛素連接酶SMURF2基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平升高可能參與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[15].

1 材料與方法

1.1 材料

TOP10感受態(tài)細(xì)胞購自上海唯地生物技術(shù)有限公司;表達(dá)載體pcDNA3.1(+)為本實(shí)驗(yàn)室保存;EcoRⅠ、EcoRⅤ購自NEB公司;DNA Marker購自上海捷瑞生物公司;蛋白質(zhì)Marker購自Themo Fisher公司;T4 DNA ligase購自TaKaRa公司;DNA膠純化試劑盒購自諾唯贊公司;質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司;SMURF2、Slug抗體、瓊脂糖珠購自Santa Cruz公司;STAT1、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin抗體均購自Proteintech公司;β-actin抗體、綠色熒光二抗、紅色熒光二抗均購自ABclonal公司;山羊抗小鼠IgG、MG132、RIPA裂解液均購自碧云天生物技術(shù)有限公司;RPMI 1640培養(yǎng)基購自維森特生物技術(shù)(南京)有限公司;胎牛血清購自美國Gibco公司;胰蛋白酶(trypsin)購自Biosharp生物科技公司;Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-SMURF2的構(gòu)建

根據(jù)人基因SMURF2核苷酸序列和載體pcDNA3.1多克隆位點(diǎn),設(shè)計(jì)合成SMURF2-F和SMURF2-R兩條引物. 引物序列如下(劃線部分為酶切位點(diǎn),上游為EcoRⅠ,下游為EcoRⅤ):

SMURF2-F:5′CCGG^AATTCATGTCTAACCCCGGAGGCCG 3′;

SMURF2-R:5′AGGAT^ATCTCATTCCACAGCAAATCCACATGTT 3′.

提取DU145細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以其為模板PCR得到SMURF2基因PCR產(chǎn)物,雙酶切pcDNA3.1質(zhì)粒和SMURF2基因的PCR產(chǎn)物,經(jīng)T4 DNA ligase連接后轉(zhuǎn)化至TOP10. 轉(zhuǎn)化液涂布到氨芐抗性的LB(Luria-Bertani)平板上,37 ℃倒置培養(yǎng),待長出單菌落. 提取單菌落中的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序,獲得正確的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-SMURF2.

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞傳代

本研究中所用的細(xì)胞株包括人正常前列腺基質(zhì)細(xì)胞WPMY-1、前列腺增生細(xì)胞BPH1、前列腺癌細(xì)胞PC-3、DU145、CWR22RV1和LNCaP,均為本實(shí)驗(yàn)室保存. 細(xì)胞培養(yǎng)使用RPMI 1640完全培養(yǎng)基,放置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 用0.25%的胰蛋白酶消化傳代,2 d～3 d傳代一次.

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前一天,胰酶消化細(xì)胞后計(jì)數(shù)種板,待細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%時(shí),即以質(zhì)粒質(zhì)量:lipofectmine體積=1:2的比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染,用新鮮無血清培養(yǎng)基分別稀釋Lipofectmine?2000試劑和質(zhì)粒DNA,充分輕柔混勻,然后將Lipofectmine?2000試劑稀釋液加入到質(zhì)粒DNA稀釋液中,充分混勻,室溫靜置15 min后,棄除舊培養(yǎng)基,然后在每孔中加入相應(yīng)體積新鮮無血清培養(yǎng)基,將DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加至細(xì)胞中孵育 4 h～6 h后更換為正常的完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h.

1.2.4 免疫印跡(Western blotting)分析

去除培養(yǎng)液,用1×PBS漂洗細(xì)胞2次. 加入120 μL/孔的RIPA細(xì)胞裂解液(加有預(yù)冷的PMSF);將細(xì)胞刮下并將細(xì)胞裂解液收集至1.5 mL的離心管中,置于冰上放置30 min,每隔10 min渦旋一次,使細(xì)胞裂解充分;12 000 r/min離心15 min,取上清. 以牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,用DC法對(duì)上清樣品進(jìn)行總蛋白定量后,取20 μg總蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳;電泳結(jié)束后,將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上;用含5%脫脂奶粉的1×PBS室溫封閉1 h;PBST清洗3次后,4 ℃孵育一抗過夜;第二天PBST清洗3次后,室溫孵育二抗1 h;ECL進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色、拍照,并對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析.

1.2.5 免疫共沉淀(Co-IP)實(shí)驗(yàn)

收集不同轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞(100 mm培養(yǎng)皿),預(yù)冷的1×PBS清洗細(xì)胞2次,每皿加入350 μL的RIPA細(xì)胞裂解液(加有預(yù)冷的PMSF),將細(xì)胞刮下并將細(xì)胞裂解液收集至1.5 mL的離心管中,置于冰上放置30 min,每隔10 min渦旋一次,使細(xì)胞裂解充分;12 000 r/min離心15 min,取上清. 以BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,用DC法對(duì)上清樣品進(jìn)行總蛋白定量,將每一蛋白裂解液樣品分為3份,Input 組、IgG 組和目的組;分別向IgG 組和目的組加入1 μg的IgG抗體和目的抗體,4 ℃緩慢晃動(dòng)過夜;準(zhǔn)備瓊脂糖珠,用1×PBS潤洗3遍后加入到孵育過夜的IgG管和目的抗體管中,4 ℃緩慢搖晃孵育4 h;免疫沉淀后,4 ℃,3 000 r/min離心 5 min,將瓊脂糖珠離心到管底,小心吸去上清;最后加入2×Loading Buffer,輕輕混勻,95 ℃煮5 min,離心取上清液電泳,對(duì)照組和目的蛋白組上樣體積要一致,Input組上樣20 μg.

1.2.6 免疫熒光(Immunofluorescence)實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞種到12孔板中,1×105個(gè)/孔,24 h后,將細(xì)胞用1×PBS清洗3次;用4%的多聚甲醛固定 30 min,PBS清洗3次,每次5 min;0.1% Triton X-100室溫通透25 min;1×PBS清洗3次,每次3 min;滴加3% BSA,室溫封閉30 min;每孔滴加足夠量稀釋的一抗(1∶200),4 ℃孵育過夜;加熒光二抗,20 ℃～37 ℃避光孵育1 h;PBST清洗3次,每次3 min;滴加DAPI避光孵育3 min～5 min,對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核,用PBST清洗4次,每次5 min;熒光顯微鏡下觀察拍照.

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel和GraphPad軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖,所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的結(jié)果統(tǒng)計(jì)均以Mean±標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示. 使用t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)以確定不同組之間的顯著差異.P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同正常組織和腫瘤組織中SMURF2的表達(dá)水平

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)已成為蛋白質(zhì)功能和穩(wěn)定性的重要監(jiān)督者. UPS在真核細(xì)胞過程中具有許多重要作用,包括細(xì)胞周期進(jìn)程、應(yīng)激反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA修復(fù)、調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子活性和膜轉(zhuǎn)運(yùn)等[16]. 超過80%的蛋白質(zhì)被UPS降解,UPS已經(jīng)成為調(diào)節(jié)各種細(xì)胞過程的重要參與者[17]. UPS在許多人類疾病如癌癥和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用[18]. SMURF2屬于HECT家族E3泛素連接酶,擁有廣泛的底物,參與多條信號(hào)通路. 首先利用PROTEINATLAS網(wǎng)站對(duì)TCGA(the cancer genome atlas)數(shù)據(jù)庫中不同正常組織及腫瘤組織中SMURF2的蛋白水平進(jìn)行分析,如圖1A,B所示,結(jié)果顯示SMURF2蛋白在前列腺正常組織和腫瘤組織中表達(dá)存在差異:在前列腺正常組織中未能檢測(cè)到SMURF2蛋白的表達(dá),但在部分前列腺腫瘤患者中卻能夠檢測(cè)到SMURF2蛋白的表達(dá).

圖1 不同正常組織和腫瘤組織中SMURF2表達(dá)水平Fig.1 The expression level of SMURF2 in different normal tissues and tumor tissues

2.2 SMURF2表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

提取DU145細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以其為模板,加入設(shè)計(jì)好的SMURF2引物,PCR擴(kuò)增后,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定,在2 000 bp～3 000 bp有一條目的條帶,與理論值(約2 247 bp)相符,結(jié)果如圖2A所示,序列分析顯示為正確的SMURF2基因. 將目的基因片段與pcDNA3.1質(zhì)粒載體進(jìn)行雙酶切連接后,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞,氨芐抗生素LB培養(yǎng)平板初篩陽性克隆,菌落PCR進(jìn)一步鑒定陽性克隆(圖2B). 將陽性克隆菌落進(jìn)行小量擴(kuò)大培養(yǎng)后,提取質(zhì)粒,進(jìn)行單雙酶切驗(yàn)證,如圖2C所示. 至此初步鑒定質(zhì)粒構(gòu)建成功,并命名為pcDNA3.1(+)-SMURF2(圖2D).

圖2 SMURF2表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.2 Construction of SMURF2 expression plasmid

2.3 SMURF2在前列腺癌細(xì)胞系中高表達(dá)

接下來,利用RT-PCR和Western blotting在前列腺(癌)細(xì)胞WPMY-1、BPH1、PC-3、DU145、22Rv1、LNCaP中,檢測(cè)SMURF2的表達(dá). 當(dāng)細(xì)胞密度到80%時(shí),提取細(xì)胞的總RNA和總蛋白,圖8A,B所示為SMURF2在6種細(xì)胞中mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況. 從結(jié)果中可以看出,在6種細(xì)胞的蛋白水平上,正常前列腺細(xì)胞WPMY-1中SMURF2表達(dá)量最低,其中PC-3和DU145細(xì)胞中SMURF2蛋白的表達(dá)水平最高,mRNA水平與蛋白水平基本一致,圖1C為SMURF2蛋白水平的灰度分析結(jié)果. 通過網(wǎng)站和數(shù)據(jù)庫分析SMURF2可能是STAT1的E3泛素連接酶,因此,想進(jìn)一步探究二者的關(guān)系. 在PC-3、DU145、WPMY-1、22Rv1細(xì)胞中過表達(dá)SMURF2,檢測(cè)對(duì)STAT1蛋白的影響,Western blotting結(jié)果顯示過表達(dá)SMURF2后STAT1蛋白水平降低,如圖1D所示.

圖3 SMURF2在前列腺癌細(xì)胞系中高表達(dá)Fig.3 SMURF2 expressed highly in prostate cancer cell lines

2.4 SMURF2和STAT1共定位及相互作用

為進(jìn)一步探究SMURF2是否作為STAT1的E3泛素連接酶在前列腺癌細(xì)胞中發(fā)揮作用,接下來通過免疫熒光實(shí)驗(yàn),如圖4A所示,檢測(cè)到二者在PC-3細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有表達(dá),并且存在共定位. 又通過在HEK293T細(xì)胞中外源過表達(dá)SMURF2和STAT1,如圖4B所示,發(fā)現(xiàn)用FLAG的抗體可以檢測(cè)到SMURF2蛋白,說明這兩種蛋白能夠相互作用.

圖4 SMURF2和STAT1共定位及相互作用Fig.4 The colocalization and interaction of SMURF2 and STAT1

2.5 SMURF2調(diào)節(jié)STAT1泛素化和EMT相關(guān)蛋白

SMURF2作為E3泛素連接酶,在前列腺癌細(xì)胞中可以降解STAT1蛋白,但是不影響STAT1 mRNA水平,結(jié)果如圖5A所示. 于是進(jìn)一步研究SMURF2對(duì)STAT1蛋白泛素化水平的影響. 通過蛋白酶體抑制劑(MG132)處理或與過表達(dá)SMURF2共處理PC-3細(xì)胞8 h,Western blotting結(jié)果如圖5B所示,在MG132與過表達(dá)SMURF2共處理組中STAT1蛋白的泛素化水平要明顯高于MG132單獨(dú)處理組,并且檢測(cè)到二者存在相互作用.

有研究報(bào)道在肺癌細(xì)胞中,IL-27激活STAT1信號(hào)通路抑制STAT3過表達(dá),STAT1激活抑制EMT標(biāo)志蛋白Slug,Vimentin,N-cadherin表達(dá)[19]. STAT1激活后進(jìn)入核內(nèi),結(jié)合在Slug的啟動(dòng)子上,抑制Slug的表達(dá)[20]. STAT1與EMT相關(guān),研究發(fā)現(xiàn)SMURF2可以降解STAT1蛋白,接著進(jìn)一步檢測(cè)了EMT相關(guān)蛋白(圖5C),結(jié)果顯示PC-3細(xì)胞中EMT標(biāo)志蛋白相對(duì)于對(duì)照組,E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯降低,而 N-cadherin、Slug、Vimentin等蛋白表達(dá)量明顯升高.

圖5 SMURF2調(diào)節(jié)STAT1泛素化和EMT相關(guān)蛋白Fig.5 The regulation of SMURF2 to STAT1 ubiquitination and EMT-related proteins

3 結(jié)論

SMURF2屬于HECT家族E3泛素連接酶,擁有廣泛的底物,參與多條信號(hào)通路,在不同癌癥中發(fā)揮不同的作用,但在前列腺癌中的功能尚不明確. 本研究通過數(shù)據(jù)庫分析得知SMURF2蛋白在前列腺正常組織和前列腺癌組織中表達(dá)情況存在差異,并進(jìn)一步在mRNA水平及蛋白水平證實(shí)了SMURF2在前列腺癌細(xì)胞中高表達(dá). 通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察到SMURF2與STAT1蛋白在前列腺癌細(xì)胞中存在共定位,又通過Co-IP實(shí)驗(yàn)和泛素化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證明SMURF2在前列腺癌細(xì)胞中可以增強(qiáng)STAT1的泛素化水平從而降解STAT1蛋白. 有文獻(xiàn)報(bào)道STAT1蛋白激活會(huì)抑制癌細(xì)胞EMT的發(fā)生,研究進(jìn)一步檢測(cè)了EMT相關(guān)蛋白,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SMURF2會(huì)增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT. 但SMURF2是否作為STAT1的E3泛素連接酶在癌癥中發(fā)揮作用及SMURF2對(duì)前列腺癌細(xì)胞功能的影響還需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證. 本研究為探究前列腺癌發(fā)生發(fā)展提供相關(guān)分子機(jī)制,同時(shí)也為前列腺癌的靶向治療提供了相關(guān)的理論依據(jù).