核酸檢測用PCR儀設(shè)計和測試方法

鄭鎮(zhèn)欽

摘要：核酸檢測用PCR儀通過對未知模板進(jìn)行定量分析，具有操作簡便、快速高效、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點，該技術(shù)在核酸定量分析和分子診斷等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛。本文重要介紹PCR儀的設(shè)計和測試方法。

關(guān)鍵詞：PCR、設(shè)計方法、測試方法

一、熒光PCR工作站應(yīng)用領(lǐng)域

分子生物學(xué)研究：對傳染性疾病進(jìn)行定量定性分析，病原微生物或病毒含量的檢測，比如新型新型冠狀病毒SARS-CoV-2導(dǎo)致的新冠肺炎（COVID-19）的檢測等。

醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究：采用熒光定量PCR檢測技術(shù)可以對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、結(jié)核分枝桿菌、EB病毒和巨細(xì)胞病毒等病原體進(jìn)行定量測定。

二、熒光PCR工作站的基本原理

熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理是當(dāng)一個熒光分子（供體分子）的熒光光譜與另一個熒光分子（受體分子）的激發(fā)光譜重疊時，供體熒光分子自身的熒光強(qiáng)度衰減，受體熒光分子的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。Ct值是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Ct值是實時熒光PCR中一個很關(guān)鍵的因素，C代表循環(huán)（Cycle），t代表閾值（Threshold）。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

實時熒光PCR工作站是基于熒光PCR技術(shù)的全自動化一體化儀器，設(shè)計的核心是PCR模塊。

三、PCR模塊的功能設(shè)計

1.高速升降溫度功能：通過快速升降溫完成聚合酶連鎖反應(yīng);

2.熒光讀取功能：在PCR過程中實現(xiàn)對熒光信號的讀取;

3.通信功能：模塊提供下位機(jī)軟件、電路接口，實現(xiàn)外部軟件對模塊的控制、數(shù)據(jù)讀取。

四、PCR管的選擇

由于PCR的核心指標(biāo)是升溫速率、降溫速率、模塊溫度均勻性等，因此，PCR管容積越小，越有利于升降溫。盡管目前主要使用的PCR管有0.2mL透明單管、0.1mL透明單管、0.2mL透明八聯(lián)管、0.2mL白色八聯(lián)管、0.1mL透明八聯(lián)管、0.1mL白色八聯(lián)管等等，但我們?nèi)匀恢鲝堃M(jìn)一步越小容積方向發(fā)展，應(yīng)以微升級為目標(biāo)，例如先進(jìn)一步縮小至70μL。同時，為更有利于熒光掃描，PCR應(yīng)盡量選用透明度高的材質(zhì)。

五、PCR模塊的結(jié)構(gòu)和設(shè)計

PCR模塊的每一個單元，應(yīng)采用獨(dú)立的升降溫組件，每個升降溫組件可容納1個PCR管，PCR管可以是6聯(lián)管或者8聯(lián)管，或者其他規(guī)格。升降溫組件采用帕爾貼進(jìn)行溫度控制，散熱采用水冷方式，帕爾貼加水冷散熱的組合方式使得PCR反應(yīng)速度更快、溫度控制更精準(zhǔn)。

主要組件有：

升降溫組件：每個組件搭載3個帕爾貼，可對模塊進(jìn)行精確控溫以及快速升降溫;

水冷組件：采用水冷泵供給制冷液，可快速對帕爾貼進(jìn)行降溫散熱，加快PCR反應(yīng)速率;

運(yùn)動組件：帶動掃描頭組件運(yùn)動，快速對PCR管進(jìn)行側(cè)掃描;

掃描頭組件：對PCR管進(jìn)行掃描，檢測PCR管內(nèi)熒光信號值;

加熱模塊壓緊件：壓緊模塊，使模塊與帕爾貼充分貼合，增強(qiáng)熱傳導(dǎo)速率。壓緊件采用聚醚醚酮材料加工;

加熱模塊：承載PCR管，同時為PCR管均勻傳導(dǎo)熱能。加熱模塊采用6063材料加工;

溫度保險：為升降溫組件提供溫度保護(hù)。溫度保險采用130℃、3A熔斷式溫度保險，可保證儀器安全;

帕爾貼：進(jìn)行升降溫控制。每個加熱模塊下布置1-3個帕爾貼，使得加熱速度更快，均一性更好。

水冷組件：由水冷倉組件、水冷排組件、水冷泵組件和水冷管路組成。

六、PCR性能的測試方法

1.平均升溫速率的測試方法

獲得45℃（恒溫2min）->95℃（恒溫2min）循環(huán)的一組數(shù)據(jù)。取50℃±0.5℃范圍內(nèi)一溫度點，溫度記為Ta，取90℃±0.5℃范圍內(nèi)一溫度點，溫度記為Tb，從Ta到達(dá)Tb的時間記為t。按公式計算平均升溫速率：平均升溫速率=（Tb-Ta）/t。平均升溫速率溫度從50℃±0.5℃升至90℃±0.5℃，平均升溫速率應(yīng)≥1.5℃/s。

2.最大升溫升溫速率的測試方法

設(shè)置溫度采集時間間隔為Δt，Δt≤1s并盡可能足夠小，掃描溫度從50℃±0.5℃升至90℃±0.5℃過過程中的瞬時最大溫度變化ΔTmax。按如下公式計算最大升溫速率：最大升溫速率=ΔTmax/Δt。溫度從50℃±0.5℃升至90℃±0.5℃，最大升溫速率應(yīng)≥2.5℃/s。

平均降溫速率和最大降溫速率同理測試。

3.控溫精度

獲得55℃（恒溫2min）->72℃（恒溫2min）->95℃（恒溫2min），且循環(huán)5次的溫度數(shù)據(jù)。取55℃、72℃、95℃三個溫度點，當(dāng)測試溫度到達(dá)設(shè)定溫度后恒溫10s后（即當(dāng)溫度穩(wěn)定后），計時30s。記錄30s內(nèi)的最高溫度和最低溫度，計算二者差值的一半ΔTn（n為5個循環(huán)），并取ΔTn的最大值Max（ΔTn）。Max（ΔTn）應(yīng)≤0.5℃。

4.溫度準(zhǔn)確度

獲得55℃（恒溫2min）->72℃（恒溫2min）->95℃（恒溫2min），且循環(huán)5次的溫度數(shù)據(jù)。取55℃、72℃、95℃三個溫度點，當(dāng)測試溫度到達(dá)設(shè)定溫度后恒溫10s后（即當(dāng)溫度穩(wěn)定后），計時60s，每10s記錄一次溫度數(shù)據(jù)，即60s內(nèi)共記錄6個溫度數(shù)據(jù)Ti（i=1～6），求Ti的平均值Tm。Tm與設(shè)定溫度差值的絕對值應(yīng)≤0.5℃。

5.溫度均勻性

獲得55℃（恒溫2min）->72℃（恒溫2min）->95℃（恒溫2min），且循環(huán)5次的溫度數(shù)據(jù)。取55℃、72℃、95℃三個溫度點，當(dāng)測試溫度到達(dá)設(shè)定溫度后恒溫10s后（即當(dāng)溫度穩(wěn)定后），計時60s，記錄溫度數(shù)據(jù)Ti（Ti=1，2，…n），在模塊上隨機(jī)或均勻選取n（n≥6）個孔位，取Ti最大與最小值，計算各孔位的溫度差值ΔT。各孔位（孔位需≥6）的溫度差值ΔT應(yīng)在±1℃范圍內(nèi)。

6.溫度持續(xù)時間準(zhǔn)確度

以95℃±0.5℃為計時參考點，自顯示溫度首次到達(dá)計時參考點，計時開始;至末次到達(dá)計時參考點結(jié)束，記錄時間為tn（n=1～5，為循環(huán)數(shù)），并計算5個循環(huán)記錄時間的平均值tm。按下列公式計算相對偏差：相對偏差=（tm-t）/tx100%。

總結(jié)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是分子生物學(xué)里程碑式的巨大成就，而熒光定量PCR的發(fā)展，又具有飛躍式的巨大進(jìn)步。因此，基于熒光定量PCR工作站的PCR設(shè)計和測試技術(shù)研究，是對人類生命健康具有重要意義的研究方向。

參考文獻(xiàn)：

[1]凱普企業(yè)工業(yè)設(shè)計中心熒光PCR工作站項目