絲素蛋白/氨基氧化石墨烯復(fù)合水凝膠的制備及性能研究

朱燕祥,焦玉全,黃佳涔,李 莉,彭曉佳,張魯中,趙亞紅

(1.南通科技職業(yè)學(xué)院,江蘇 南通 226001)(2.南通大學(xué)神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南通 226001)(3.南通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,江蘇 南通 226001)

在諸多生物材料中,水凝膠因臨床操作簡(jiǎn)單、組織相容性好等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,如心肌治療、整形外科、骨修復(fù)等[1-3]. 此外,還可以對(duì)水凝膠進(jìn)行物理或化學(xué)改性,提高其機(jī)械性能、生物降解性能、熱敏感性以及藥物/細(xì)胞承載能力等以滿足不同組織器官的修復(fù)需求[4-6]. 目前,用于制備水凝膠的材料可分為3類,即合成聚合物、天然聚合物以及脫細(xì)胞基質(zhì)[7]. 其中天然聚合物如膠原、殼聚糖、海藻酸鹽、透明質(zhì)酸等與細(xì)胞外基質(zhì)理化性質(zhì)極其相似,在生物仿生和細(xì)胞融合等性能方面更具優(yōu)勢(shì)[8],但也存在機(jī)械力學(xué)性能差、降解速度快等缺點(diǎn),限制了其在組織器官修復(fù)中的應(yīng)用.

絲素蛋白(SF)是蠶絲脫膠后提取的純天然高分子化合物,雖然力學(xué)性能下降,但具有較好的組織相容性和低免疫原性,可被加工成纖維、膜以及海綿等,應(yīng)用于組織器官如神經(jīng)、血管、骨和皮膚等的修復(fù)等[9-10]. SF在有機(jī)溶劑、超聲、快速渦旋以及改變pH 值的條件下可制備成水凝膠,作為骨充填材料和藥物緩釋載體等[11-12]. 然而SF水凝膠的某些理化性質(zhì)如強(qiáng)度和導(dǎo)電性能仍不能滿足再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的特殊需求. 因此,有針對(duì)性地開(kāi)發(fā)臨床適用型新型SF水凝膠十分必要.

氧化石墨烯(GO)是石墨烯氧化后的衍生物,含有大量含氧基團(tuán),具有較好的水溶性和分散性. 此外,GO比表面積大,結(jié)構(gòu)柔韌,導(dǎo)電性優(yōu)異,聯(lián)合制備水凝膠可增加凝膠強(qiáng)度和導(dǎo)電性能[13]. GO經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾改性,可以與多種天然高分子化合物交聯(lián),形成結(jié)構(gòu)特異和功能多樣的復(fù)合生物材料[14-15]. 氨基化修飾的GO(氨基氧化石墨烯,NGO),在高分子基體中的分散性和界面相互作用等性能更為優(yōu)異,同時(shí)導(dǎo)電性能提高,組織相容性增加,細(xì)胞毒性顯著降低[16]. 本文采用CaCl2/H2O/C2H5OH三元溶劑體系制備了SF溶液,同時(shí)加入氨基化氧化石墨烯,利用京尼平對(duì)氨基進(jìn)行交聯(lián)制備絲素蛋白/氨基氧化石墨烯(NGO/SF)復(fù)合納米水凝膠. 該水凝膠在力學(xué)性能和導(dǎo)電性等方面明顯改善,使其在心肌治療和神經(jīng)修復(fù)等再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用更具備可行性.

1 材料與方法

1.1 絲素蛋白溶液

稱取新鮮蠶絲(含絲膠)50 g,將其溶解在2 000 mL Na2CO3水溶液脫絲膠,溶液煮沸30 min,以此重復(fù)3次,Millipore純水充分浸泡洗滌,確保表面無(wú)殘留,后置于超凈臺(tái)內(nèi)室溫晾干,得到約40 g絲素蛋白樣本(SF). 將SF于78 ℃ 溶解在CaCl2/H2O/C2H5OH三元溶劑體系中,直至完全溶解得到黃色透明溶液. 將絲素三元溶液置于纖維素管中,在Millipore水中透析,每4 h一次換水,直至3 d. 透析后即為SF溶液,經(jīng)濾紙過(guò)濾,收集液再濃縮至質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%,置于4 ℃保存.

1.2 水凝膠制備

將2 g京尼平(美倫生物公司)加熱溶解于10 mL去離子水中,制備20%京尼平水溶液作為交聯(lián)劑. NGO(購(gòu)自先豐納米公司)直徑190～320 nm,溶解于水至終濃度5 mg/mL. 將NGO溶液、SF溶液以一定的體積混合(如表1). 制備的NGO/SF復(fù)合納米水凝膠置于相應(yīng)孔板或EP管中,37 ℃孵育24 h.

表1 NGO/SF復(fù)合納米水凝膠成份配比Table 1 Proportion of ingredients of NGO/SF polymeric hydrogel

1.3 形態(tài)學(xué)觀察

用相機(jī)和光學(xué)顯微鏡觀察并記錄納米水凝膠的宏觀和微觀形態(tài). 制備的水凝膠樣品用去離子水浸泡24 h后,選取不同倍數(shù)觀察檢測(cè).

1.4 溶脹率測(cè)定

將制備的水凝膠樣品進(jìn)行冷凍干燥約12 h,稱得干重Ws. 將干燥水凝膠樣品室溫條件下浸入0.1 mol/L的PBS溶液(pH 7.4)中24 h,取出用濾紙將樣品表面殘留液體吸干再稱重,記為Wd. 每組設(shè)置3個(gè)平行樣. 溶脹比(SR)計(jì)算公式如下:SR=(Wd-Ws)/Ws×100%.

1.5 降解性能測(cè)試

NGO/SF復(fù)合納米水凝膠制備成膜狀,裁切成等同大小,分別置于離心管中,并精確稱量每個(gè)樣本初始重量W0. 于離心管中加入5 mL的 0.1 mol/L PBS(pH 7.4)溶液(或蛋白酶溶液),置于 37 ℃恒溫振蕩器中,每天換液. 不同時(shí)間點(diǎn)取出離心管,4 000 rpm 的轉(zhuǎn)速離心 10 min,棄去上清液加入三蒸水再次洗滌離心,重復(fù)3次. 將離心管置于真空干燥箱18 h,待水分完全蒸發(fā)后再次稱量記錄為W1. NGO/SF復(fù)合納米水凝膠降解率根據(jù)下列公式計(jì)算:

Degradation%=(W0-W1)/W0×100%.

1.6 力學(xué)性能

使用電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)(拓豐儀器科技有限公司,TFW-5s)測(cè)量水凝膠的抗壓機(jī)械性能. 將水凝膠溶液注入模具制備成直徑為20 mm 的圓盤狀,厚度5 mm. 將試驗(yàn)機(jī)設(shè)定為壓縮模式,將樣品放置于基座,以 5 mm/min 的位移速率測(cè)定其在壓縮測(cè)試下的應(yīng)力-應(yīng)變曲線,直至樣品破裂. 設(shè)置5個(gè)平行樣,根據(jù)壓縮測(cè)試的應(yīng)力-應(yīng)變曲線統(tǒng)計(jì)最大應(yīng)力、最大位移.

1.7 電導(dǎo)率測(cè)試

使用FT-341四探針儀(寧波瑞柯儀器有限公司)測(cè)量NGO/SF復(fù)合水凝膠的電導(dǎo)率性能. 將水凝膠溶液注入模具,制備成直徑10 mm的圓形膠,厚度為2 mm. 真空干燥箱中干燥后取出,置于4根排成直線的探針下,設(shè)置測(cè)量溫度25 ℃,檢測(cè)薄片的電導(dǎo)率.

1.8 循環(huán)伏安分析

采用三電極體系(上海辰華CHI660D)在NGO/SF復(fù)合納米水凝膠成膠前進(jìn)行電化學(xué)測(cè)試. 鉑絲電極為對(duì)電極,飽和鐵氰化鉀電極為參比電極,復(fù)合材料修飾的玻碳電極為工作電極. 每個(gè)樣品取10微升滴于玻碳電極表面,自然晾干.

玻碳電極預(yù)處理:將玻碳電極用三氧化二鋁拋光成鏡面. 電極分別在無(wú)水乙醇和二次蒸餾水中超聲清洗,使用前在氮?dú)饬髦懈稍镆韵皆陔姌O表面的物質(zhì).

1.9 靜電性能

利用織物感應(yīng)式靜電測(cè)試儀(溫州市大榮紡織儀器YG(B)342D),采用定壓法對(duì)NGO/SF復(fù)合納米水凝膠的靜電性能進(jìn)行測(cè)試. 選擇高壓10 kV,倍率0.5. 將制備試樣夾緊,待電機(jī)轉(zhuǎn)速穩(wěn)定(1 500 r/min)后,按下高壓放電按鈕放電,30 s后停止放電. 記錄加壓30 s的峰值即峰值電壓. 加壓停止時(shí),衰減時(shí)間計(jì)時(shí)器開(kāi)始計(jì)時(shí),靜電釋放,靜電電壓值減少,當(dāng)達(dá)到峰值*所設(shè)倍率時(shí),靜電電壓鎖定,此為半衰期電壓. 記錄顯示的衰減時(shí)間,此為半衰期.

2 結(jié)果與討論

2.1 NGO/SF復(fù)合水凝膠的顏色變化

水凝膠中通過(guò)添加各種化學(xué)示蹤劑如O2敏感型的苯并卟啉等,便于實(shí)時(shí)觀察組織器官的修復(fù)效果[17]. 對(duì)制備的NGO/SF復(fù)合水凝膠外觀檢測(cè)發(fā)現(xiàn),該水凝膠呈藍(lán)色. 隨著NGO含量的增高,復(fù)合納米水凝膠的顏色從淺藍(lán)色(近綠色)變至深藍(lán)色(近黑色)(圖1). 由此可見(jiàn),京尼平與氨基石墨烯的氨基以及絲素蛋白的氨基反應(yīng),生成梔子藍(lán)色的新型復(fù)合材料. 該新型水凝膠的顏色改變,不但避免添加其它化學(xué)染料給機(jī)體帶來(lái)的潛在副作用,而且有利于其在組織器官修復(fù)后的形態(tài)、位置和效果示蹤,提高原位修復(fù)的精準(zhǔn)性. 如原位注射水凝膠治療心肌梗死,通過(guò)水凝膠顏色即可判斷水凝膠在心室壁中的位置以及降解情況等[3].

圖1 NGO/SF復(fù)合水凝膠的光學(xué)照片圖Fig.1 Photograph of the NGO/SF polymeric hydrogel

2.2 NGO/SF復(fù)合水凝膠的溶脹性分析

不同組織器官的缺損修復(fù),對(duì)復(fù)合材料的溶脹性能具有不同的技術(shù)要求. 對(duì)添加不同含量NGO的 4種復(fù)合水凝膠進(jìn)行溶脹性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著NGO濃度的增加,復(fù)合水凝膠的溶脹性減小(圖2). 不添加NGO的水凝膠(NGO-SF1)平衡溶脹比高達(dá)451.4%,顯著高于NGO-SF2(253.9%)、NGO-SF3(190.8%)和NGO-SF4(159.8%). 因此NGO/SF復(fù)合水凝膠中NGO含量與溶脹性呈負(fù)相關(guān). 該結(jié)果為臨床選用特定溶脹性能的SF水凝膠提供了參考.

圖2 不同NGO含量的NGO/SF復(fù)合水凝膠溶脹性檢測(cè)Fig.2 Water absorption measurement of the NGO/SF polymeric hydrogels containing different concentration of NGO

2.3 水凝膠的穩(wěn)定性分析

在神經(jīng)、軟骨和骨等組織工程中,要求水凝膠等作為支架基材的生物材料具備一定的穩(wěn)定性. 將制備的NGO/SF復(fù)合水凝膠置于0.1 mol/L的PBS(pH 7.4)溶液中進(jìn)行穩(wěn)定性分析. 檢測(cè)結(jié)果顯示,不同時(shí)間點(diǎn)NGO-SF1的降解率小于5%,表明SF水凝膠本身穩(wěn)定性較好. NGO-SF1降解率顯著高于NGO-SF2、NGO-SF3和NGO-SF4(圖3),表明NGO能夠提高復(fù)合水凝膠的穩(wěn)定性.

圖3 不同NGO含量的NGO/SF復(fù)合水凝膠在PBS溶液中降解率的檢測(cè)Fig.3 Degradation assay of the NGO/SF polymeric hydrogels in PBS solution

2.4 復(fù)合水凝膠抗壓力學(xué)性能測(cè)試

水凝膠普遍力學(xué)強(qiáng)度較低,結(jié)構(gòu)易損,制約了其作為組織工程材料應(yīng)用于骨、軟骨、心臟和血管等組織器官的修復(fù). 為了檢測(cè)NGO對(duì)復(fù)合水凝膠力學(xué)性能的影響,對(duì)4組樣品進(jìn)行了抗壓力學(xué)性能分析. 應(yīng)力-應(yīng)變曲線數(shù)據(jù)表明,增加NGO含量可以顯著提高NGO/SF復(fù)合水凝膠的抗壓強(qiáng)度,且呈現(xiàn)正相關(guān)(圖4). 結(jié)果提示,NGO能夠提高復(fù)合水凝膠抗壓力學(xué)性能.

圖4 NGO/SF復(fù)合水凝膠的抗壓應(yīng)力-應(yīng)變曲線Fig.4 Compressive stress-strain curve of the NGO/SF polymeric hydrogels

2.5 復(fù)合材料的電導(dǎo)率檢測(cè)

復(fù)合水凝膠的導(dǎo)電性能與指導(dǎo)組織細(xì)胞的遷移、分化和生長(zhǎng)等密切相關(guān). 傳統(tǒng)導(dǎo)電水凝膠是在水凝膠中引入聚苯胺、聚吡咯以及聚噻吩等高分子材料,同時(shí)也增加了復(fù)合材料的毒性和易聚積性. 諸多文獻(xiàn)表明,GO能夠提高復(fù)合材料的電導(dǎo)率. 為了了解NGO對(duì)NGO/SF復(fù)合水凝膠電導(dǎo)率的影響,實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了不同NGO含量的4種復(fù)合水凝膠的電導(dǎo)率. 結(jié)果可以看出,不含NGO的水凝膠電導(dǎo)率為0.007 7 ms·cm-1. 隨著NGO含量的增加,NGO/SF復(fù)合水凝膠電導(dǎo)率顯著上升,且呈現(xiàn)正相關(guān)(圖5),提示NGO有助于提高復(fù)合材料的電導(dǎo)率.

圖5 不同NGO含量的NGO/SF復(fù)合水凝膠電導(dǎo)率的檢測(cè)Fig.5 Conductivity measurement of the NGO/SF polymeric hydrogels

2.6 循環(huán)伏安曲線

循環(huán)伏安行為是衡量材料儲(chǔ)能性能的一項(xiàng)重要指標(biāo). 為了評(píng)價(jià)NGO/SF復(fù)合水凝膠電荷儲(chǔ)存能力,對(duì)該水凝膠進(jìn)行了循環(huán)伏安測(cè)試,并記錄電流-電勢(shì)曲線. 結(jié)果可以看出,隨著NGO含量的增加,水凝膠樣品的循環(huán)伏安曲線越來(lái)越接近四角長(zhǎng)方形,表明其導(dǎo)電性能逐漸增強(qiáng)(圖6).

圖6 不同NGO含量的NGO/SF復(fù)合水凝膠循環(huán)伏安曲線Fig.6 Cyclic voltammetry curve of the NGO/SF polymeric hydrogels

2.7 靜電性能

實(shí)驗(yàn)采用定壓法檢測(cè)了NGO/SF復(fù)合水凝膠的3個(gè)靜電性能指標(biāo),包括峰值電壓、終點(diǎn)電壓和衰減周期. 隨著復(fù)合水凝膠中NGO含量的增加,材料峰值電壓顯著上升,表明累積電荷明顯增加;衰減周期也相應(yīng)延長(zhǎng),提示復(fù)合納米水凝膠表面的電荷比較穩(wěn)定,不易造成逃逸,易累積形成靜電(表2).

表2 NGO/SF復(fù)合水凝膠的3個(gè)靜電性能指標(biāo)Table 2 Electrostatic performance of the NGO/SF polymeric hydrogels

綜上所述,NGO/SF復(fù)合水凝膠除了因化學(xué)交聯(lián)生成藍(lán)色外,在穩(wěn)定性、力學(xué)性能以及導(dǎo)電性能等方面均有顯著提高,且溶脹性降低. 這些理化性質(zhì)的優(yōu)化,使得NGO/SF復(fù)合水凝膠作為新型生物材料在皮膚、神經(jīng)、血管、心肌、軟骨和骨修復(fù)等再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域極具應(yīng)用前景. 同時(shí),在3D組織和器官構(gòu)建、腫瘤原位化療等方面也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值. 雖然不少研究對(duì)GO的細(xì)胞和生理毒性仍存有爭(zhēng)議,但如果在GO上交聯(lián)羧基、氨基等基團(tuán)或者絲素等,功能化的GO幾乎沒(méi)有毒性,并具有良好的生物相容性[18]. 因此,NGO/SF復(fù)合水凝膠是一種新型安全的生物材料.

3 結(jié)論

(1)本實(shí)驗(yàn)在絲素蛋白溶液中添加了不同含量的NGO,通過(guò)京尼平交聯(lián),合成制備了NGO/SF復(fù)合水凝膠. 該水凝膠呈藍(lán)色,且隨著水凝膠中NGO濃度的增加顏色逐漸加深. 因此,該技術(shù)制備的水凝膠有利于其在組織器官修復(fù)中的效果示蹤.

(2)制備的NGO/SF復(fù)合水凝膠吸水率小,且具有較好的穩(wěn)定性. 隨著NGO的添加,NGO/SF復(fù)合水凝膠吸水率逐漸降低,穩(wěn)定性增強(qiáng).

(3)抗壓力學(xué)性能檢測(cè)表明,NGO有利于提高SF水凝膠的抗壓強(qiáng)度(彈性). 據(jù)分析,添加NGO后的水凝膠抗壓力學(xué)性能提高超過(guò)1.6倍(NGO-SF2 vs NGO-SF1). SF水凝膠力學(xué)性能的提高,將大大提高水凝膠的臨床修復(fù)效果和使用壽命.

(4)通過(guò)對(duì)添加NGO復(fù)合材料的電導(dǎo)率、循環(huán)伏安和靜電性能的檢測(cè)表明,NGO有利于改善SF水凝膠的導(dǎo)電性以及儲(chǔ)電性能. 在神經(jīng)組織以及心肌修復(fù)中,生物材料導(dǎo)電性能的提高,有助于組織器官的功能恢復(fù). NGO-SF復(fù)合水凝膠的開(kāi)發(fā),將進(jìn)一步提高其在臨床使用中的修復(fù)效果.