乙型肝炎病毒基因耐藥突變位點(diǎn)的異質(zhì)性分析

鄔琪煥，練祥，柯婷婷，梁云，張?jiān)鲈?，胡宇濤，孫斌輝

抗病毒治療是符合治療指征的慢性乙型肝炎（CHB）患者首要的治療措施[1]，核苷（酸）類藥物（NAs）為主要藥物，包括一線藥物恩替卡韋（ETV）、富馬酸替諾福韋酯（TDF）和富馬酸丙酚替諾福韋（TAF），非一線藥物包括拉米夫定（LAM）、替比夫定（LdT）和阿德福韋酯（ADV）。NAs 相關(guān)的耐藥突變均位于乙型肝炎病毒（HBV）基因組逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)（RT區(qū)）。研究表明，未經(jīng)藥物治療的CHB患者存在不同比例的原發(fā)耐藥突變，而在藥物壓力選擇之下，HBV 的耐藥更加容易發(fā)生，因此研究當(dāng)?shù)氐哪退幫蛔兦闆r具有重要意義[2-3]。本文擬分析249 例CHB患者HBV-RT區(qū)基因突變情況，探討突變位點(diǎn)的異質(zhì)性以及臨床意義，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 資料與方法 收集2014 年2 月至2019 年7 月浙江省象山縣第一人民醫(yī)院醫(yī)療健康集團(tuán)收治的CHB 患者249例，均符合《慢性乙型肝炎防治指南（2019 版）》中CHB 診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，經(jīng)NAs治療后仍HBV DNA 陽性，或出現(xiàn)病毒學(xué)突破。收集患者的HBV-RT 耐藥突變位點(diǎn)信息、用藥情況、肝功能、HBV血清學(xué)標(biāo)志物、HBVDNA、臨床診斷、出現(xiàn)耐藥后的藥物調(diào)整情況及HBVDNA轉(zhuǎn)陰時(shí)間等信息。根據(jù)HBV-RT 區(qū)是否存在耐藥突變，分為非耐藥組和耐藥組。研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，被研究者的臨床資料均經(jīng)過查閱病歷和電話隨訪證實(shí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo) 包括肝功能，HBV血清學(xué)標(biāo)志物及HBV DNA 等。血清肝功能丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）檢測采用Olympus AU2700全自動化分析儀檢測。HBV血清學(xué)標(biāo)志物采用美國雅培Abbott AxSYM System 全自動化學(xué)發(fā)光分析儀。外周血清HBV DNA 檢測采用熒光定量PCR 法（檢測下限20 IU/ml）。

1.3 HBV-RT 區(qū)測序 采用ABI 3130型基因測序儀檢測HBV-RT 區(qū)基因（長度450 bp），涵蓋了臨床應(yīng)用的所有NAs（包括LAM、LdT、ADV、ETV、TDF 及TAF）的常見耐藥位點(diǎn)，檢測的位點(diǎn)包括rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtM204I/V、rtV207I/L/G、rtS213T、rtA181V/T、rtV214A、rt Q215S、rtN236T、rtP237H、rtN238T、rtT184A/G/S/I/L/F、rtS202G/I及rtM250V/L/I。由分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室同一位檢驗(yàn)人員完成。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS19.0 軟件處理，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t 檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25～P75）表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐藥組與非耐藥組臨床特征分析兩組性別比、ALT 及HBV DNA 水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05）。兩組年齡、治療后HBV DNA轉(zhuǎn)陰時(shí)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

表1 耐藥組與非耐藥組臨床特征分析

2.2 HBV-RT 區(qū)耐藥位點(diǎn)突變類型108 例HBV-RT 區(qū)耐藥中，單位點(diǎn)突變占37.96%（41/108），以rt M204I 位點(diǎn)及rtA181V 位點(diǎn)常見，其中男31 例，女10例；二聯(lián)位點(diǎn)突變占33.33%（36/108），以rt L180M + rt M204V、rt A181V+rt N236T常見，其中男31 例，女5 例；多位點(diǎn)突變占28.70%（31/108），以rt L180M+rt M204V突變基礎(chǔ)上rtS202/rtV173 發(fā)生突變常見，其中男22 例，女9 例。3 組性別構(gòu)成比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=2.39，P＞0.05）。

2.3 HBV-RT區(qū)各耐藥位點(diǎn)突變頻率HBV-RT 區(qū)耐藥位點(diǎn)突變發(fā)生頻率不同，突變最多的位點(diǎn)為rtM204 位點(diǎn)（77/216），其次為rtL180 位點(diǎn)（52/216），rtI169 位點(diǎn)突變最少發(fā)生（1/216），見表2及封二彩圖3。

表2 HBV-RT 區(qū)各耐藥位點(diǎn)突變頻率

2.4 不同藥物應(yīng)用下的耐藥情況及相關(guān)耐藥位點(diǎn) 108 例耐藥組患者所覆蓋的NAs 相關(guān)耐藥通路161 例次，其中含L 型核苷耐藥通路（rt M204 位點(diǎn)突變）77 例次（47.83%），含無環(huán)磷酸鹽耐藥通路（rt 236 位點(diǎn)突變）15 例次（9.32%），含共享（公共）耐藥通路（rt A181 位點(diǎn)突變）32 例次（19.86%），含雙重耐藥通路（rt A181T/V+rt N236T 位點(diǎn)突變）10 例次（6.21%），含ETV 初治耐藥通路（即rt L180M+rtM204V 再加上rtI169、rtT184、rtS202 或rtM250 任意一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)突變）22 例次（13.66%），多藥耐藥通路（180L/M+181A/T+204M/V、180M+181G+202G+204V、180M+181V+204V、181A/T+204M/I 及181T/V+236N/T+250M/L）5 例次（3.11%）。見表3。

表3 249 例患者發(fā)生耐藥突變的情況

3 討論

HBV 是一種部分閉合的環(huán)狀雙鏈DNA 病毒，具有高變異性[4]，由于基因組較小，在病毒逆轉(zhuǎn)錄過程中又不具備校正功能；加上NAs 僅能大幅度降低血清中的HBV DNA 的含量，而減少HBsAg和HBV cccDNA 的作用不明顯[5]，使得慢性HBV感染患者需要長期應(yīng)用NAs。NAs 抗病毒治療過程中極易產(chǎn)生耐藥，CHB 患者使用NAs 抗病毒治療1 年以上者，耐藥比例每年增加達(dá)14%～20%[6]。因此在NAs 治療過程中，許多患者的HBV準(zhǔn)種池內(nèi)可能出現(xiàn)不同比例的耐藥突變病毒準(zhǔn)種，進(jìn)而導(dǎo)致病毒學(xué)突破或臨床耐藥，很大程度上降低了抗病毒療效，促進(jìn)疾病進(jìn)一步發(fā)展為終末期肝病[7]。

本研究結(jié)果表明，出現(xiàn)病毒學(xué)突破或臨床耐藥患者中，耐藥組患者的平均年齡及優(yōu)化治療后DNA 轉(zhuǎn)陰時(shí)間均高于非耐藥組。在長時(shí)間的藥物壓力或/和宿主免疫壓力下，人體內(nèi)HBV準(zhǔn)種池中易產(chǎn)生各種形式的準(zhǔn)種突變株。因此，年齡較大的患者較早或較高頻率出現(xiàn)病毒學(xué)突破或臨床耐藥，及時(shí)進(jìn)行耐藥基因檢測顯得十分關(guān)鍵，能及時(shí)發(fā)現(xiàn)相關(guān)耐藥，調(diào)整后續(xù)抗病毒治療方案。目前LdT常見相關(guān)變異位點(diǎn)為rt M204I，LAM 相關(guān)突變主要包括rt V173L、rt L180M 和rt 204I/V 等，ADV 耐藥變異集中于rt A181V、rt N236T；ETV 目前發(fā)現(xiàn)的耐藥突變大多發(fā)生于LAM 耐藥的患者[8]。本研究108 例耐藥組患者所覆蓋的NAs 相關(guān)耐藥通路中，含L 型核苷耐藥通路最常見，但是含共享（公共）耐藥通路（rt A181 位點(diǎn)突變）與含ETV 初治耐藥通路分別位列第2、3 位。共享（公共）耐藥通路可導(dǎo)致L 型核苷類藥物和ADV 耐藥，并降低TDF 的敏感性[9]，而ETV 與TDF 均為目前廣泛使用的一線抗病毒藥物，因此，對于病毒學(xué)應(yīng)答不佳的經(jīng)治患者，應(yīng)選擇無交叉耐藥的優(yōu)化用藥方案或聯(lián)合用藥方案。

HBV 各耐藥位點(diǎn)的突變發(fā)生頻率不同，變異最多的位點(diǎn)為rtM204，其次為rtL180，rtI169 位點(diǎn)突變最少發(fā)生，其中僅rtV173位點(diǎn)上，女性的突變率高于男性，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.014）。本研究中的主要變異位點(diǎn)類型基本是各相關(guān)藥物的常見耐藥變異位點(diǎn)，體現(xiàn)了一致性。

研究表明，LAM第1、2、3 及4 年耐藥變異發(fā)生率分別為14%、38%、49%和66%，LdT 略優(yōu)于LAM，但總體耐藥率仍很高；ADV第1、2、3、5 年耐藥率分別為0、1.6%、3.1%和29%，ETV 5 年累計(jì) 耐藥率1.2%，TDF耐藥僅有極少數(shù)報(bào)道[8]。本研究耐藥組中，LdT、LAM 耐藥位點(diǎn)檢出率較高，容易出現(xiàn)耐藥，幾乎任何用藥情況都會出現(xiàn)，相對而言ADV及ETV的耐藥位點(diǎn)檢出率較低，不同藥物耐藥率的高低與大數(shù)據(jù)相差甚遠(yuǎn)，可能與數(shù)據(jù)經(jīng)過特定條件入組有關(guān)，但總體耐藥率高低順序符合相關(guān)研究的趨勢。同時(shí)LAM、LdT的應(yīng)用仍占較大比例，可能與早期較多選擇非一線藥物有關(guān)，可盡早調(diào)整為高耐藥屏障的以下一線抗病毒藥物[10]。

綜上所述，臨床醫(yī)生對需要抗病毒治療的CHB患者首選ETV、TDF及TAF等一線用藥，如出現(xiàn)病毒學(xué)應(yīng)答不佳時(shí)及時(shí)給予HBV耐藥檢測，以根據(jù)后續(xù)結(jié)果調(diào)整用藥，從而減少耐藥突變的發(fā)生。