c-Myc 基因啟動子甲基化在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的研究

黃海燕，應(yīng)穎，彭勇，袁芳芳，林吉霞，陳亞慧，章鑫，羅晶，陳勇

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種好發(fā)于40 ～60 歲女性人群的自身免疫性疾病。2004―2014 年，美國RA 患病率在0.41%～0.54%[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，Th17 細(xì)胞在RA 的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[3]。亦有文獻(xiàn)報道T 細(xì)胞糖代謝紊亂與RA 發(fā)病有著密切聯(lián)系[4]。轉(zhuǎn)錄因子c-Myc 能夠促進(jìn)T 細(xì)胞的活化，且是上調(diào)糖酵解中的關(guān)鍵酶[5]。DNA 甲基化可通過抑制基因的表達(dá)，在自身免疫病、高血壓及腫瘤等多種疾病發(fā)病過程中起著重要作用[6]。因此，本研究探討c-Myc基因啟動子甲基化在RA 發(fā)病中的作用，并分析c-Myc 基因甲基化率與IL-17 水平的相關(guān)性，及兩者與炎癥指標(biāo)的相關(guān)性，為RA 患者的早期診斷和治療提供一種新的思路。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019 年6―12 月就診于中國科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院的43 例RA 患者為實(shí)驗(yàn)組，均符合RA的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；排除：（1）合并強(qiáng)直性脊柱炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎等其他風(fēng)濕性疾病，（2）合并腫瘤、肝病、糖尿病等其他慢性疾病，（3）合并明顯血液學(xué)指標(biāo)異常，（4）感染、癌癥、外傷等其他原因所導(dǎo)致的關(guān)節(jié)疼痛。其中RA 活動期18 例，RA 穩(wěn)定期25例。另選同期來本院體檢者20 例作為健康對照組。上述研究對象間無血緣關(guān)系，且本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有參受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法 記錄研究對象的相關(guān)臨床資料：年齡、性別、C 反應(yīng)蛋白（CRP）、血沉（ESR）及類風(fēng)濕因子（RF）。各抽取2 ml 外周靜脈血至2%EDTA 管中保存，經(jīng)1 200 r/min 離心3 min 后分離上清液血漿及血細(xì)胞，并保存于―80 ℃冰箱中。

1.2.1 c-Myc（chr8:127736502）甲基化率檢測 采用QIAamp DNA 試劑盒（QIAGEN 公司，德國）提取外周血DNA，用DNA 甲基化修飾試劑盒（Zymo 公司，美國）進(jìn)行DNA 的亞硫酸鹽修飾。PCR 引物由PyroMark Assay Design 2.0（QIAGEN，德國）設(shè)計(jì)，由華大基因合成：上游引物序列5’-GGGAGTTTTGGGAAGGGAGAT-3’，下游引物序列（生物素）5’-ATCCCCAAATAAACAAAATAACCTC-3’，測序引物序列5’-ATTTTGTATTGGAATTTATAATAT-3’。PCR 反應(yīng)體系50l：包括H2O 34.8l，5×buffer GC（KAPA）10l，dNTP（10 mmol/L）1l，上游引物（50 pmol/l）1l，下游引物（50 pmol/l）1l，DNA 模板2l，Taq 酶（5 U/l）0.2l。反應(yīng)條件：95 ℃3 min，

1.2.2 血漿IL-17 水平檢測 用ELISA 測定試劑盒（中國，上海橋杜生物技術(shù)有限公司，202012，96 孔）測量蛋白質(zhì)水平。依照標(biāo)準(zhǔn)品順序分別加入50l的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，空白對照孔加入50l 的蒸餾水，其余微孔中先加樣品40l 再加生物素標(biāo)記的抗體10l，在37 ℃的水浴放置30 min。5 次洗板后加入50l的酶標(biāo)溶液（空白對照除外），并在37 ℃的水浴放置60 min，再次5 次洗板。加入顯色劑A 液50l+顯色劑B 液50l，避光10 ～15 min 后加入50l 終止液。并通過酶標(biāo)儀（賽默飛，VarioskanLUX）在450nm處測量每個孔的OD 值。94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃1 min，72 ℃7 min，共40循環(huán)。最后采用焦磷酸檢測儀（PyroMark Q96 ID，QIAGEN 公司，德國）檢測甲基化率。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。偏態(tài)分布計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗(yàn)；多組間比較運(yùn)用Cruskal-WallisH檢驗(yàn)，多重比較運(yùn)用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組一般資料比較 RA 活動期男4 例，女14例；平均年齡（57.7±12.5）歲。RA 穩(wěn)定期男6 例，女19 例；年齡（52.6±10.6）歲。健康對照組男5 例，女15 例；年齡（54.7±11.4）歲。3 組性別比及年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05）。

2.2 3 組c-Myc（chr8:127736502）甲基化率、CRP、ESR、RF 及IL-17 水平比較 3 組c-Myc（chr8:127736502）甲基化率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），健康對照組與RA 活動期和穩(wěn)定期差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。3 組IL-17 水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），RA 活動期CRP，ESR，RF 與穩(wěn)定期差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。見表1。

表1 3 組c-Myc(chr8:127736502)甲基化率、CRP、ESR、RF、IL-17 水平比較

2.3 c-Myc（chr8:127736502）甲基化率、IL-17 與各指標(biāo)的相關(guān)性分析 c-Myc（chr8:127736502）甲基化率與IL-17 呈負(fù)相關(guān)性（r=－0.186，P ＜0.05）；c-Myc（chr8:127736502）甲基化率與CRP、ESR 及RF無明顯相關(guān)性（均P ＞0.05）；IL-17 與CRP、ESR 及RF 有相關(guān)性（r=0.326、0.401、0.212，均P ＜0.05）。

3 討論

c-Myc 基因位于人類第8 號染色體上，由3 個外顯子和2 個內(nèi)含子組成，能促進(jìn)細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有研究表明，該基因編碼的c-Myc 轉(zhuǎn)錄因子在乳腺癌、宮頸癌、腎癌、肝癌及胃癌等腫瘤組織中均表達(dá)增加，與多種抗腫瘤藥物抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)[8]。亦有文獻(xiàn)報道，在RA 和骨關(guān)節(jié)炎患者的成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞（FLS）中發(fā)現(xiàn)c-Myc 甲基化水平存在差異[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，不管是活動組還是穩(wěn)定組的RA患者，c-Myc基因甲基化率均低于健康對照組；而RA 活動組與穩(wěn)定組無明顯差異。這說明轉(zhuǎn)錄因子c-Myc 可能參與了RA 的致病過程，但與疾病的活動性無關(guān)。

IL-17 是Th17 細(xì)胞的效應(yīng)分子，能協(xié)同IL-1、TNF- 產(chǎn)生下游炎癥因子，如IL-6 及IL-8，參與RA的炎癥反應(yīng)。IL-17 還通過誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成、滑膜成纖維樣細(xì)胞表達(dá)RNAKL，參與骨破壞的發(fā)生[10]。本研究RA患者外周血中IL-17 水平明顯高于健康對照組，且RA 活動期高于穩(wěn)定期。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：外周血中IL-17 水平與c-Myc（chr8:127736502）甲基化率呈負(fù)相關(guān)，與炎癥指標(biāo)如CRP、ESR 及RF 呈正相關(guān)。這表明IL-17 參與了RA 的炎癥過程，且與活動性有關(guān)，可能成為臨床監(jiān)測RA 活動性的一個指標(biāo)。

Kunkl 等[11]在多發(fā)性硬化癥患者中發(fā)現(xiàn)，CD28 通過轉(zhuǎn)錄因子c-Myc 增加CD4+T 細(xì)胞中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUT1），從而上調(diào)T 細(xì)胞的糖酵解。本研究中c-Myc基因甲基化水平在RA患者中較低，可能增加了c-Myc 轉(zhuǎn)錄因子的水平，促進(jìn)了T 細(xì)胞的活化，激活了糖酵解的關(guān)鍵酶，促使IL-17生成，從而導(dǎo)致RA的發(fā)生。

本研究的不足之處：樣本量較少，且來源于同一個中心，未檢測轉(zhuǎn)錄因子c-Myc的水平，亦未對糖酵解相關(guān)的關(guān)鍵酶及產(chǎn)物進(jìn)行檢測。有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，完善以上實(shí)驗(yàn)，探討c-Myc 基因甲基化在RA 發(fā)病及疾病發(fā)展中的作用。